五味子不同炮制品中鞣質(zhì)含量的測(cè)定

張宇喆，趙 丹，武子敬

(通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院·吉林通化·134002)

五味子為木蘭科五味子屬植物五味子Schisandra Chinesisi（Turez.）Baill.的成熟果實(shí)。五味子這個(gè)名字來(lái)自于唐代《新修本草》中“五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味”的描述[1]。《神農(nóng)本草經(jīng)》中描述五味子具有滋養(yǎng)作用并無(wú)毒性[2]。據(jù)以往的研究表明，五味子中主要含有五味子素、維生素C、樹(shù)脂、鞣質(zhì)及少量糖類(lèi)，具有增強(qiáng)免疫、延緩衰老、治遺精的功效，也可平緩心跳頻率和紓解高血壓[3]。如今五味子以治療肝炎和神經(jīng)衰弱等癥為主[4]。鞣質(zhì)又稱(chēng)單寧，是普遍存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物，鞣質(zhì)其性收斂，內(nèi)服可用于醫(yī)治出血、滑脫等癥；外用后鞣質(zhì)能使創(chuàng)面滲出液中的蛋白質(zhì)凝結(jié)形成結(jié)痂，降低感染的風(fēng)險(xiǎn)[5]。鞣質(zhì)還原性較強(qiáng)，被認(rèn)為是天然的抗氧化劑，可以幫人們實(shí)現(xiàn)延緩衰老的夢(mèng)想[6]。而且，抗過(guò)敏、抗炎、驅(qū)蟲(chóng)、降血壓等也是鞣質(zhì)具有的作用。本文五味子不同炮制品中鞣質(zhì)的含量測(cè)定以五味子不同炮制品中鞣質(zhì)含量差異為根據(jù)，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)法聯(lián)合干酪素法進(jìn)行測(cè)定。本試驗(yàn)采取超聲波輔助提取技術(shù)，運(yùn)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)法，測(cè)定五味子不同炮制品中鞣質(zhì)含量，為五味子在臨床上更好的使用提供參考[7]。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 材料

中藥材五味子（購(gòu)于通化醫(yī)藥大廈）；沒(méi)食子酸對(duì)照品；磷鉬鎢酸試液；無(wú)水碳酸鈉；干酪素；食鹽；黃酒；醋。

1.2 儀器

電子分析天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海昂拉儀器有限公司）；超聲提取儀（上海宇硯機(jī)械設(shè)備有限公司）；電子萬(wàn)能爐（本溪恒文育電爐廠）；高速多功能粉碎機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 五味子炮制方法

2.1.1 五味子生品

取中藥五味子，去除雜質(zhì)后，用水沖洗至潔凈，取出，晾干，得到潔凈的五味子生品,準(zhǔn)確稱(chēng)量30g。

2.1.2 醋蒸五味子

取30g潔凈的五味子，在潔凈的燒杯中，用醋悶潤(rùn)后，放到蒸鍋內(nèi)，等到醋被吸干后，拿出晾干，就得到了用醋炮制的五味子。五味子∶醋=20∶3[8]。

2.1.3 酒蒸五味子

取潔凈的中藥五味子，稱(chēng)取30g后，放入潔凈燒杯中，用黃酒混合均勻，悶潤(rùn)，放置在合適容器內(nèi)，蒸至酒干，其外表呈現(xiàn)紫黑色，拿出，晾干，得到用酒蒸制而成的五味子[11]。五味子∶酒=5∶1[9]。

2.1.4 清蒸五味子

取符合標(biāo)準(zhǔn)的五味子30g，放入蒸鍋內(nèi)，蒸汽加熱蒸透，拿出，晾干。

2.1.5 鹽蒸五味子

取處理過(guò)的五味子30g，用鹽水拌勻待鹽水吸盡后，置于適當(dāng)容器內(nèi)蒸制，直至外表呈紫黑色后取出，晾干。食鹽∶水=1∶50[10]。

2.1.6 炒五味子

取干凈的五味子30g，用文火炒到五味子微微鼓起，并基本保持紫褐色時(shí)，拿出，晾干，得炒五味子[11]。

2.1.7 焦五味子

取五味子30g，去除雜質(zhì)，用中火炒至焦黃色或焦褐色，拿出，晾干。

2.1.8 五味子炭

將30g五味子生品去掉雜質(zhì)及梗，用武火翻炒五味子，直到五味子表面呈焦褐色即可，內(nèi)部“存性”。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取潔凈50mL棕色量瓶，倒入25.20mg精確稱(chēng)量沒(méi)食子酸，然后再倒入水溶解稀釋到刻度線(xiàn)，振蕩，取其中10mL置于另一棕色量瓶，重復(fù)以上操作，得到濃度為50.4μg·mL-1的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

用4號(hào)篩對(duì)粉碎后的五味子生品及不同炮制品進(jìn)行篩選，在250mL棕色量瓶中加入2g藥材粉末和150mL水，靜置過(guò)夜后用超聲提取儀處理15min，晾涼，加水稀釋至相應(yīng)刻度，充分混勻，放置在陰涼地方30min，過(guò)濾，棄去最開(kāi)始濾得的濾液50mL，而后精密濾得20.0mL續(xù)濾液加入到100mL棕色量瓶中，加水稀釋到相應(yīng)刻度，充分混合均勻后，得到五味子供試品溶液。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

量取4.0mL沒(méi)食子酸對(duì)照液以及樣品溶液，將測(cè)量后的兩種溶液放入50mL的棕色瓶，再分別向其中

放入磷鉬鎢酸試液2.0mL。再分別向其中加入20mL水，向棕色瓶中加入29%碳酸鈉溶液直到稀釋到與刻度線(xiàn)平齊，充分混合均勻，放置陰涼處?kù)o置15min。使用空白試劑做參照，在400～800nm之間做波長(zhǎng)掃描，其得到兩種比色液在760nm處吸光度值最大，因此測(cè)定的波長(zhǎng)選擇760nm[12]。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

選擇4個(gè)50mL棕色量瓶，并分別倒入對(duì)照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0mL，磷鉬鎢酸溶液2.0mL以及水22.0、20.0、18.0、16.0mL，最后倒入29%碳酸鈉溶液定至刻度線(xiàn)。充分混勻，靜置15min。最后用空白試劑做參照，在波長(zhǎng)760nm處測(cè)量各自的吸光度，橫坐標(biāo)為各瓶的溶液濃度，縱坐標(biāo)為各自的吸光度，進(jìn)行線(xiàn)性回歸后[13]，得到線(xiàn)性回歸方程式：y=0.0133x+0.1，R2=0.9996。并看到在2.02～12.10μg·mL-1的濃度下五味子供試品溶液線(xiàn)性關(guān)系較好。其結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.5 總鞣質(zhì)含量的測(cè)定

2.5.1 總酚量的測(cè)定

把4.0mL供試品溶液倒進(jìn)50mL潔凈的棕色量瓶中，運(yùn)用2.3項(xiàng)下的相同方法得到各種供試品在760nm處的吸光度值。將各自的吸光度值代入到回歸方程中，通過(guò)計(jì)算得出溶液里總酚量。

2.5.2 不被吸附多酚量的測(cè)定

在100mL的錐形瓶中加入0.6g磨成細(xì)粉的干酪素和25mL各種五味子溶液，放入30℃恒溫水浴鍋中1h，搖勻，水浴保溫后拿出，防冷至室溫，混合均勻靜置后過(guò)濾，丟去初濾液，精密濾取4mL續(xù)濾液。使用“2.3”項(xiàng)下的方式測(cè)定出吸光度值，代入回歸方程式中，計(jì)算得到不被吸附的多酚的量。

2.5.3 總鞣質(zhì)含量的計(jì)算

鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量[14]

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取4.0mL沒(méi)食子酸對(duì)照液，按照“2.3”項(xiàng)中的方法，連續(xù)測(cè)量6次對(duì)照品的吸光度，.并計(jì)算出其RSD值為0.77%（n=6），得出實(shí)驗(yàn)精密度良好的結(jié)論。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)出6份2g的五味子生品粉末，按“2.2.2”中的方法配制供試品溶液，吸取4mL溶液按“2.3”項(xiàng)下方式，測(cè)定出各自不同的吸光度值，通過(guò)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算公式計(jì)算出供試品溶液吸光度的RSD為0.55%（n=6）。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取超聲波提取的4.0mL生五味子供試品溶液，如同“2.3”項(xiàng)下的辦法，在顯色后0.5、1、3、6、9、12h時(shí)測(cè)出各個(gè)吸光度，計(jì)算吸光度的RSD=1.22%，通過(guò)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可以看出穩(wěn)定性較好。

2.6.4 加樣回收率試驗(yàn)

以五味子生品為例，在15.0mg沒(méi)食子酸對(duì)照品中加入6份已知含量的供試品溶液0.1g，再按“2.2.2”項(xiàng)中一樣的方式得到供試品溶液，最后運(yùn)用“2.5”項(xiàng)下一樣的方法測(cè)出吸光度并計(jì)算得到樣品中鞣質(zhì)的加樣回收率和的RSD值為1.29%。

2.7 樣品測(cè)定

取8種五味子藥材粉末2g，各取3份，之后根據(jù)“2.2.2”項(xiàng)下的原理得到樣品溶液，再使用“2.5”項(xiàng)下辦法測(cè)得吸光度并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程式計(jì)算得到總鞣質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 五味子不同炮制品中鞣質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

因鞣質(zhì)性質(zhì)活潑易發(fā)生氧化反應(yīng)，受熱結(jié)構(gòu)易被破壞，對(duì)于鞣質(zhì)成分的提取不利，所以運(yùn)用冷浸過(guò)夜超聲提取法，而且操作簡(jiǎn)單，對(duì)總鞣質(zhì)成分的提取較完全[12]。

鞣質(zhì)的含量測(cè)定可以選擇皮粉法、干酪素法、比色法等。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定五味子不同炮制品中的鞣質(zhì)含量選擇了干酪素法，因?yàn)樗倪x擇性較好，具有取樣量少，快速，靈敏等特點(diǎn)[15]。同時(shí)在堿性條件下鞣質(zhì)能與磷鉬鎢酸產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，因?yàn)樵撍{(lán)色沉淀遇光不穩(wěn)定，因而，顏色反應(yīng)防止輕操作，應(yīng)用棕色瓶。

以紫外-可見(jiàn)分光光度法聯(lián)合干酪素法測(cè)定五味子不同炮制品中鞣質(zhì)含量與生品有一定差異，相較于生品，其中醋蒸、清蒸、酒蒸的炮制方法均增加了其鞣質(zhì)的含量，而其他方法使鞣質(zhì)含量降低。其中經(jīng)查閱其他文獻(xiàn)得知，醋蒸、酒蒸均能增加其收斂作用，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，而清蒸鞣質(zhì)含量的增加可能是由于蒸法或者蒸制溫度對(duì)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)有影響，所以鞣質(zhì)含量增加可能不僅與醋、黃酒的作用有關(guān)。