云斑白條天牛COI基因拼接方法及序列比較的實驗設(shè)計

梅增霞，李建慶

（1 濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東濱州 256603；2 濱州學(xué)院教務(wù)處）

DNA 分析技術(shù)廣泛用于種群分化、系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)研究，也是生物類專業(yè)學(xué)生需要掌握和熟練應(yīng)用的一門技術(shù)。利用DNA 進行生物系統(tǒng)學(xué)分析，通常要求學(xué)生在掌握DNA 提取、PCR 擴增技術(shù)之后，就對目的DNA 拼接和分析，因此，拼接出準(zhǔn)確的DNA 序列是開展其他DNA 分析關(guān)鍵和基礎(chǔ)。

云斑白條天牛是黃河三角洲地區(qū)為害白蠟樹的重要害蟲，危害嚴(yán)重，發(fā)生量大，成蟲個體較大，基因組DNA 的提取比較容易。線粒體細胞色素氧化酶亞基I（COI）是一個較為保守的基因序列，經(jīng)常用于昆蟲種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育和分化的研究[1]，目前已有部分對云斑白條天牛COI 的相關(guān)研究[2-4]，可為該實驗前期的DNA 提取和PCR 擴增提供借鑒。本實驗內(nèi)容是筆者從事云斑白天牛種群分化研究工作的部分內(nèi)容，項目組從當(dāng)?shù)刂匾οx云斑白條天牛中成功提取并擴增了COI 基因，為該實驗的開展做好了前期準(zhǔn)備。

本實驗設(shè)計結(jié)合黃河三角洲地域特色，以當(dāng)?shù)刂匾οx云斑白條天牛為實驗對象，提取擴增其COI 基因，以COI 基因為例，利用DNAStar 基因分析軟件進行基因序列拼接，并比較拼接方法和拼接結(jié)果，對提升學(xué)生綜合實踐能力和創(chuàng)新能力均有重要作用。

1 實驗準(zhǔn)備

1.1 DNA 提取

在濱州城區(qū)的白蠟樹上采集云斑白條天牛成蟲，然后進行DNA 提取。

1.2 DNA 擴增測序

設(shè)計云斑白條天牛雌成蟲COI 基因引物，PCR 擴增，將擴增后DNA 提交上海生工公司雙向測序，測序完成后，公司提供的abl 文格式件分別為DNA 雙鏈的3' 端序列和5' 端序列，文件較大分別為310KB 和259KB，含不同堿基的圖譜。seq 格式文件較小，僅為1KB，含堿基序列。

1.3 基因序列拼接和分析軟件

利用DNAStar 軟件的SeqMan 程序拼接基因序列，利用MegAlign 程序比對序列。

2 實驗過程

2.1 Seq 序列文件的拼接

打開DNAStar 的SeqMan 程序，輸入2 個seq 序列文件，將2 個序列進行拼接，拼接后序列長度716 bp。

點擊菜單欄Contig 的Strategy View，打開Strategy窗口（圖1），勾取Conflicts 選項后，通過彩色區(qū)塊，快速查找沖突堿基，由圖4 可見，選取的前80 個堿基中，在堿基序列30～40 和40～50 之間有沖突堿基。

圖1 seq 序列文件裝配序列的Strategy 窗口

點擊Contig 的Alignment View，打開Alignment 窗口，通過圖2 可見，拼接裝配前2 個序列的長度分別是685 bp 和681 bp，根據(jù)圖1 查看的結(jié)果，在拼接后總長度的716 bp 中選取前80 個堿基進行比較，在序列30～40 和40～50 之間查找沖突堿基，在圖2 上有5 處拼接沖突的地方，1 處堿基不一致，4 處堿基缺失。

拼接裝配時，需要對沖突堿基和缺失堿基進行修補，缺失堿基可根據(jù)另一條鏈對應(yīng)的堿基進行填補，但沖突堿基軟件不能確定哪個是正確的，如圖2 的序列35 位點處的2 條鏈的堿基分別A 和C，軟件裝配時以M 作為該位點堿基輸出序列結(jié)果。

圖2 seq 序列文件裝配序列的Alignment 窗口

2.2 Abl 圖譜文件的拼接

在SeqMan 程序中輸入2 個abl 圖譜文件，將2 個序列進行拼接裝配，裝配拼接后序列長度705 bp。

由圖3 的Strategy 窗口可見，在拼接后的705 bp中選取前80 個堿基進行比較，在30～40 和40～50 序列位置之間有沖突堿基。根據(jù)圖4 的Alignment 窗口，拼接裝配前2 個序列的長度分別是680 bp 和675 bp，根據(jù)圖3 確定堿基沖突位置，在圖4 上有4 處堿基拼接沖突位置，2 處為堿基不一致，2 處是堿基缺失。修補沖突堿基時參考圖譜波峰，如圖5 局部放大，可確定缺失的39 和44 位點的2 個堿基分別為T 和A；32 位點處沖突堿基A 和C 不匹配，根據(jù)圖譜的波峰可以確定為A，因為堿基A 波峰清晰明顯，而堿基C 處無波峰；50位點處堿基A 的綠色波峰和黑色波峰幾乎重疊，很難確定是堿基A 還是G，因此軟件將以R 作為堿基裝配序列結(jié)果輸出，這是需要重新測序才能確定該位置的堿基名稱。

圖3 abl 圖譜文件裝配序列的Strategy 窗口

圖4 abl 圖譜文件裝配序列的Alignment 窗口

前文2.1 提及的序列文件拼接序列35 位點處的沖突堿基A 和C 與圖譜文件拼接序列的32 位點處為同一堿基位點，因此根據(jù)圖譜文件可以確定圖2 序列文件35 位點處堿基為A。

圖5 abl 圖譜文件裝配序列30～50 位點的放大圖

2.3 拼接序列的比較

通過2 種方法得到云斑白條天牛成蟲COI 的2 條拼接序列，abl 圖譜文件拼接后，輸出序列命名為BC-COI-abl，seq 序列文件拼接后，輸出序列命名為BC-COI-seq。通過DNAStar 的MegAlign 程序比較2 條序列的差異，結(jié)果顯示，BC-COI-abl 序列長度705bp，比較的堿基位點為1-705，BC-COI-seq 序列長度716 bp，比較的堿基位點為7～711，比較的堿基序列長度為705 bp，無堿基缺口，2 個序列的相似度為99%。2 條序列的堿基比對結(jié)果，由圖6 可見，2 種拼接方法得到序列有7 處位點堿基不一致，原因均為BC-COI-seq 序列拼接時含有沖突基因不能確定準(zhǔn)確堿基。

圖6 拼接序列BC-COI-abl 和BC-COI-seq 的堿基比較

3 實驗結(jié)果

通過以上實驗過程的比較和分析，可以得出2 個實驗結(jié)論：①2 個文件拼接序列不一致，abl 文件拼接的基因序列較seq 文件拼接的序列堿基準(zhǔn)確性更高。Seq 文件拼接序列存在一些不準(zhǔn)確堿基，這些不準(zhǔn)確堿基可通過觀察abl 文件不同堿基位的波峰圖譜來確定，較好波峰對應(yīng)的堿基為正確堿基。②利用seq 文件拼接的序列長度大于利用abl 文件拼接的序列。seq 文件拼接后COI 基因的序列長度716 bp，abl 文件拼接的COI 基因序列長度為705 bp。

4 討論

通常認為DNA 序列在1000 bp 以內(nèi)的基因，測序公司提供的seq 格式文件的堿基序列是較為準(zhǔn)確的，可以直接用于DNA 分析。seq 文件小占用內(nèi)存少，進行序列拼接時拼接過程相對簡單，缺失堿基可以利用另一條鏈的堿基自行填補，可快速輸出拼接序列，但拼接時遇到?jīng)_突堿基，無法確定哪一個堿基是正確的，導(dǎo)致輸出序列中含有非堿基字母。abl 文件較大占用內(nèi)存多，拼接過程相對復(fù)雜，但拼接結(jié)果準(zhǔn)確可靠，通過觀察不同堿基位的圖譜波峰，確定正確堿基，個別情況下軟件拼接錯誤的堿基也可通過觀察波峰來確定。

作者在指導(dǎo)學(xué)生過程中發(fā)現(xiàn)基因拼接是一個很基本的DNA 技術(shù)，但學(xué)生實際掌握情況并不好，這一實驗把DNA 技術(shù)的實驗理論結(jié)合地方實際問題，以當(dāng)?shù)睾οx云斑白條天牛的COI 基因為實驗對象，結(jié)合自身科研過程和開發(fā)適合學(xué)生實驗項目對鍛煉學(xué)生解決實際問題能力，提高大學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣有很大幫助。該實驗也可與其他實驗如DNA 提取、PCR 擴增、基因比對等內(nèi)容結(jié)合而組成一個研究性實驗，若適當(dāng)增加研究內(nèi)容或改變實驗對象，也可用作學(xué)生畢業(yè)論文題目。因此，該實驗設(shè)計以DNA 拼接方法這一實驗技術(shù)為出發(fā)點，以點帶面，提升學(xué)生綜合運用知識能力、邏輯思維能力和創(chuàng)新能力均有重要作用。