知母肉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

黃曉婧，肖春霞，許 莉，高 鵬，羅 霄，趙小勤

(成都市食品藥品檢驗研究院/中藥材質(zhì)量監(jiān)測評價重點實驗室，四川 成都 610045)

知母入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，為百合科知母屬植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖[2]，近代研究表明其化學(xué)成分主要為皂苷類、雙苯吡酮類、生物堿類、氨基酸類等[3]，具有抗血小板凝聚、抗腫瘤、改善阿爾茨海默癥、降糖等作用[4-6]。經(jīng)市場調(diào)研，知母藥材有毛知母、知母肉兩種，炮制品有知母、知母肉切片和鹽知母等多種規(guī)格[7]。通過文獻(xiàn)考證，明·陳嘉謨在《本草蒙筌》[8]中提到知母肉的制作方法為“去凈皮毛，忌犯鐵器”，即早在明代已存在知母肉的炮制加工方式[9]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，知母肉飲片中知母皂苷BⅡ含量明顯高于知母飲片[7]，表明知母肉的存在具有一定的合理性。《中國藥典》2015年版一部知母來源項下明確注明知母肉的制作方法為“除去外皮，曬干”，但標(biāo)準(zhǔn)中并無知母肉的檢驗項目及規(guī)定。此外，北京市[10]、廣西壯族自治區(qū)[11]、安徽省[12]、河南省[13]、湖南省[14]、重慶市[15]、天津市[16]、上海市[17]、貴州省[18]等多個地方飲片炮制規(guī)范中均提及知母肉，《歐洲藥典》EP10.0[19]知母項下也同時收載了毛知母和知母肉兩種規(guī)格。但多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀描述，項目設(shè)置簡單且不統(tǒng)一。為進(jìn)一步規(guī)范知母肉飲片炮制工藝，全面提高知母肉飲片質(zhì)量，本研究參照《中國藥典》2015年版一部知母質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)項目對知母肉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，并對知母肉重金屬及有害元素、植物生長調(diào)節(jié)劑殘留、農(nóng)藥殘留、黃曲霉毒素進(jìn)行考察，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695-2998高效液相色譜儀(沃特世科技有限公司)；Thermo 3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)-德國Thermo ELSD 6000蒸發(fā)光散射檢測器；薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)；AUX220電子天平(日本島津公司，1/1萬)；XPE26電子天平(梅特勒-托尼多儀器有限公司，1/100萬)；SK250H超聲儀(250 W，53 kHz，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥品

芒果苷對照品(98.4%，111607-201503)、知母皂苷BⅡ?qū)φ掌?94.4%，111839-201505)由中國食品藥品檢定研究院提供；新芒果苷對照品(99.73%，MUST-16042232)由成都曼斯特生物科技有限公司提供；乙腈(色譜純)；其余試劑(分析純)；水(實驗室自制純凈水)。

21批次知母肉中7批次為藥材，14批次為飲片。來源信息見表1。

表1 知母肉來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 外觀性狀

《中國藥典》2015年版無知母肉的性狀描述，觀察知母肉藥材和飲片的外觀特征，增加藥材描述“形如毛知母。表面黃白色，有扭曲的溝紋，有的可見葉痕及根痕”及飲片描述“取凈知母肉，潤透，切厚片，干燥。本品形如知母飲片，表面黃白色，切面黃白色”。外觀性狀見圖1。

A．知母(毛知母)藥材；B.知母飲片；C.知母肉藥材；D.知母肉飲片

2.2 顯微鑒別

參照藥典標(biāo)準(zhǔn)知母項下，為粉末顯微鑒別，知母肉與毛知母顯微無差別，為黏液細(xì)胞，胞腔內(nèi)含草酸鈣針晶束。顯微鑒別見圖2。

圖2 知母肉顯微鑒別

2.3 薄層色譜鑒別

參照藥典標(biāo)準(zhǔn)知母項下方法，分別為芒果苷、知母皂苷BⅡ進(jìn)行薄層色譜鑒別，經(jīng)驗證，知母肉在標(biāo)準(zhǔn)條件下薄層色譜主斑點清晰，分離效果好。薄層色譜見圖3、圖4。

1～3.樣品S1～S3；4.芒果苷；5～7.樣品S8～S10

1～3.樣品S1～S3；4.芒果苷；5～7.樣品S8～S10

2.4 檢查項目

2.4.1 水分 按照《中國藥典》2015年版第四部水分測定法(通則0832烘干法)測定，知母肉藥材和飲片中水分含量測定結(jié)果見表2、表3。7批次藥材水分含量在4.2%～8.9%之間，平均值為6.5%，符合藥典規(guī)定的不得超過12.0%。14批次飲片水分含量在5.3%～11.6%之間，平均值為8.1%，根據(jù)測定結(jié)果，擬規(guī)定知母肉飲片水分含量不得超過12.0%。

表2 知母肉藥材水分、灰分檢查結(jié)果 (%)

表3 知母肉飲片水分、灰分檢查結(jié)果 (%)

2.4.2 總灰分和酸不溶性灰分 按照《中國藥典》2015年版第四部灰分測定法(通則 2302)測定，知母肉藥材和飲片總灰分和酸不溶性灰分測定結(jié)果見表2、表3。7批次藥材總灰分結(jié)果在2.7%～5.0%之間，平均值為3.8%，符合藥典規(guī)定的不得超過9.0%。14批次飲片總灰分結(jié)果在2.5%～5.3%之間，平均值為3.6%。根據(jù)測定結(jié)果，擬規(guī)定知母肉飲片總灰分不得超過9.0%。

7批次知母肉藥材酸不溶性灰分結(jié)果在0.2%～0.6%之間，平均值為0.4%，符合藥典規(guī)定的不得超過4.0%。14批次飲片酸不溶性灰分結(jié)果在0.1%～0.6%之間，平均值為0.3%。根據(jù)測定結(jié)果，擬規(guī)定知母肉飲片酸不溶性灰分不得超過2.0%。

2.4.3 二氧化硫殘留量 按照《中國藥典》 2015年版四部二氧化硫殘留量測定法(通則 2331第一法)測定。因本實驗收集的藥材均為產(chǎn)地趁鮮收集，實驗室切片、干燥，未涉及到硫磺熏蒸加工環(huán)節(jié)，故共測定了5批次飲片的二氧化硫殘留量。結(jié)果有2批次未檢出，2批次檢出量為3 mg/kg和10 mg/kg，還有1批次(樣品S10)檢出量為434 mg/kg，超出了藥典規(guī)定的限量高值400 mg/kg。鑒于知母硫磺熏蒸的情況較嚴(yán)重[7]，建議標(biāo)準(zhǔn)增加二氧化硫殘留量測定項。

2.4.4 重金屬及有害元素 按照《中國藥典》2015年版四部鉛、鎘、砷、汞、銅測定法(通則2321第二法)，檢測了3批次知母肉藥材和3批次飲片，結(jié)果均未檢出。因此，建議標(biāo)準(zhǔn)暫不增加重金屬及有害元素項。

2.4.5 植物生長調(diào)節(jié)劑 按照新建立的UPLC-MS-MS法測定8種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留，檢測了3批次知母肉藥材和3批次飲片，結(jié)果均未檢出。

2.4.6 農(nóng)藥殘留量 按照新建立的QuEChERS-GC-QQQ-MS/MS測定知母中58種農(nóng)藥殘留方法[20]，檢測了3批次知母肉藥材和3批次飲片，結(jié)果均未檢出。因此，建議標(biāo)準(zhǔn)暫不增加農(nóng)藥殘留項。

2.4.7 黃曲霉毒素 按照《中國藥典》2015年版四部黃曲霉毒素測定法第一法(通則2351)，檢測了3批次知母肉藥材和3批次飲片，結(jié)果均未檢出。因此，建議標(biāo)準(zhǔn)暫不增加黃曲霉毒素限量項。

2.5 新芒果苷、芒果苷含量測定

2.5.1 色譜條件 以SHISEIDO CAPCELL PAK C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)為色譜柱；以乙腈為流動相A，0.2%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫：0～7 min，7%(A)；7～10 min，7%～13%(A)；10～26 min，13%(A)；26～27 min，13%～7%(A)；檢測波長為258 nm。理論塔板數(shù)按芒果苷峰計算應(yīng)不低于6 000。

2.5.2 溶液制備 (1)對照品溶液：取芒果苷、新芒果苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含芒果苷25 μg、新芒果苷50 μg的混合溶液，即得對照品溶液。(2)供試品溶液：取樣品粉末(過三號篩)約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，稱定重量，立即超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。對照品和供試品溶液色譜見圖5。

1.新芒果苷；2.芒果苷

2.5.3 線性范圍 精密稱取新芒果苷對照品10.16 mg、芒果苷對照品7.26 mg，置于50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液母液。將母液分別稀釋至7個不同濃度溶液，按照“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計算線性關(guān)系，結(jié)果見表4。

表4 新芒果苷和芒果苷的線性范圍

2.5.4 精密度試驗 精密吸取同一份對照品溶液適量(“2.5.3”項下)，按照“2.5.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果測得新芒果苷峰面積RSD為0.49%(n=6)，芒果苷峰面積RSD為1.23%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(S1)6份，按照“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，“2.5.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計算新芒果苷和芒果苷含量，測得6份樣品新芒果苷平均含量為31.75 mg/g，RSD=0.72%；芒果苷平均含量為6.05 mg/g，RSD=1.00%。結(jié)果表明，本法的重復(fù)性良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液(“2.5.5”項下)，按照“2.5.1”項下色譜條件分別于0、4、8、16、24 h進(jìn)樣，測定新芒果苷、芒果苷峰面積，RSD分別為0.33%、0.23%。另取新芒果苷對照品溶液(0.081 28 mg/mL)，芒果苷對照品溶液(0.058 08 mg/mL)，分別于0、4、8、16、24 h進(jìn)樣測定新芒果苷、芒果苷峰面積，RSD分別為0.39%、0.48%。結(jié)果表明，對照品和供試品溶液中的新芒果苷、芒果苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的樣品(S1)6份，每份取約0.1 g，置于錐形瓶中，分別精密加入新芒果苷對照品溶液(濃度為0.728 mg/mL)5 mL、芒果苷對照品溶液(濃度0.305 mg/mL)2 mL，再分別精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，立即超聲提取40 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液測定峰面積，計算回收率。結(jié)果新芒果苷的平均回收率為101.36%，RSD為2.14%；芒果苷的平均回收率為101.24%，RSD為1.52%。結(jié)果表明，本法的準(zhǔn)確度較好。

2.5.8 樣品含量測定 取表1中的知母肉藥材、飲片樣品適量，每個樣品平行2份，按照“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算各批樣品中新芒果苷和芒果苷的含量之和，結(jié)果見表5、表6。

表5 知母肉藥材含量測定結(jié)果(以干燥品計) (n=2)

表6 知母肉飲片含量測定結(jié)果(以干燥品計) (n=2)

由表5、表6可見，知母肉藥材中新芒果苷、芒果苷總量在2.15%～3.95%之間，平均值為2.76%，參照知母藥材限度，擬規(guī)定知母肉藥材新芒果苷、芒果苷總量不得少于1.20%。知母肉飲片中新芒果苷、芒果苷總量在1.86%～3.10%之間，平均值為2.63%，參照知母飲片限度，擬規(guī)定知母肉飲片新芒果苷、芒果苷總量不得少于1.50%。

2.6 知母皂苷BⅡ含量測定

取表1中的知母肉藥材、飲片樣品適量，按照《中國藥典》2015年版一部知母項下知母皂苷BⅡ的含量測定方法測定，結(jié)果見表5、表6。由此，擬規(guī)定知母肉藥材中知母皂苷BⅡ含量在5.3%～7.3%之間，平均值為6.6%，符合藥典規(guī)定的知母藥材不得少于3.0%。知母肉飲片中知母皂苷BⅡ含量在4.8%～7.1%之間，平均值為5.8%，符合藥典知母飲片規(guī)定的不得少于2.0%。建議采用藥典知母中知母皂苷BⅡ限度。

3 討論

3.1 提取溶劑考查

分別考察樣品制備中提取溶劑稀乙醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙腈、50%丙酮、0.2%磷酸溶液-乙腈(83∶17)的提取效果，測定含量，結(jié)果采用50%甲醇和0.2%磷酸溶液-乙腈(83∶17)為提取溶劑對新芒果苷提取效果差別不大，但50%甲醇對芒果苷提取效果更佳，因此選擇50%甲醇為提取溶劑。

3.2 提取方式考查

分別考察超聲處理(15 min、30 min、60 min)、加熱回流(30 min、60 min、90 min)的提取效果，結(jié)果超聲處理對芒果苷提取效果優(yōu)于加熱回流，加熱回流對新芒果苷的提取效果優(yōu)于超聲處理。但因知母含黏液質(zhì)較多，樣品經(jīng)加熱回流后，供試品溶液變黏稠；加熱回流30 min出現(xiàn)輕微拉絲現(xiàn)象，加熱回流60 min和90 min溶液變得很黏稠，溶液拉絲，不易過濾。故實驗采用超聲處理提取方法。

4 結(jié)論

本研究收集了7批次不同產(chǎn)地的知母肉藥材和21批次飲片，基于2015年版《中國藥典》中收錄的知母藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對知母肉藥材及飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，補充和完善了已有的知母相關(guān)的國家及地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)實驗結(jié)果初步確定知母肉的鑒別、含量測定和檢查項判定標(biāo)準(zhǔn)：供試品薄層色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點；含量測定供試品按干燥品計算，藥材含新芒果苷、芒果苷總量不得少于1.20%，飲片不得少于1.50%；藥材含知母皂苷BⅡ不得少于3.0%，飲片不得少于2.0%；水分不得超過12.0%；總灰分不得超過9.0%；酸不溶性灰分不得超過4.0%，飲片不得超過2.0%；二氧化硫不得超過400mg/kg。