TPGS修飾載精氨酸脫亞胺酶環(huán)糊精脂質(zhì)納米粒的酶活性和藥動學研究

楊 強，馮 嬌，劉煜瑩，李開鈴，鐘彩靈，張景勍

(1. 重慶醫(yī)科大學藥學院，重慶 400016；2. 陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400036)

精氨酸脫亞胺酶(arginine deiminase，ADI)來源于各種微生物，如支原體、幽門螺桿菌等，是精氨酸專一水解酶，能將機體中精氨酸分解為瓜氨酸[1]。精氨酸屬于半必需氨基酸，也是腫瘤生存的營養(yǎng)來源之一，在正常情況下機體能夠在精氨酸琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthetase 1,ASS1)的參與下自主合成[2]。而在部分實體瘤中，如肝癌、黑色素瘤，腫瘤細胞由于缺乏ASS1基因而不能自主合成精氨酸，必須依賴血液循環(huán)中的外來精氨酸才能生存。ADI能將進入腫瘤微環(huán)境中的精氨酸直接分解為瓜氨酸，阻斷實體瘤的營養(yǎng)來源，故實體瘤對ADI誘發(fā)的營養(yǎng)剝奪療法敏感[3]，這顯示出ADI在抗癌方面的廣闊潛力。但ADI作為典型的外來蛋白質(zhì)類抗癌酶，在體內(nèi)具有極不穩(wěn)定、明顯的免疫原性、靶向能力差、易耐受等缺點，這嚴重限制了其臨床應(yīng)用[4]。

ADI-PEG20為改良的聚乙二醇化的ADI，目前已經(jīng)在多種腫瘤中進行了大量單獨或聯(lián)合使用的臨床研究，結(jié)果表明在肝癌患者中，接受ADI-PEG20協(xié)同治療后患者的中位生存期得到提高[5]。除了進行聚乙二醇化修飾外，還有研究者采用羧甲基殼聚糖來遞送ADI，通過納米粒遞送系統(tǒng)提高其穩(wěn)定性和生物利用度[6]。但是目前尚沒有關(guān)于ADI脂質(zhì)納米遞送系統(tǒng)的相關(guān)報道。已有研究使用羥丙基-β-環(huán)糊精脂質(zhì)納米粒封裝天冬酰胺酶，以此提高了酶的生物利用度[7]。脂質(zhì)體是一種常見的擬細胞膜的納米載體，具有良好的組織相容性，已用來包載尿酸酶和過氧化氫酶[8-9]。TPGS作為各國藥監(jiān)局批準的安全佐劑，在藥物遞送中常作為抗藥物耐藥的有效輔料[10]，且有研究表明其具有肝臟靶向性，可更有效遞送藥物至肝臟[11]。

鑒于此，我們首次制備了新型D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修飾的載精氨酸脫亞胺酶環(huán)糊精脂質(zhì)納米粒(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate-modified arginine deiminase cyclodextrin lipid nanoparticles，ACLN)，擬解決ADI應(yīng)用上的缺點。本文初步考察了ACLN的酶活性特點和體內(nèi)藥代動力學行為，初步得知ACLN在包封ADI后，能夠提高ADI的酶活性和生物利用度，這為下一步研究ACLN的靜脈給藥療效奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑重組精氨酸脫亞胺酶(來源支原體，規(guī)格：10 g·L-1，批號：20170901，重慶艾美迪生物科技有限公司)；羥丙基-β-環(huán)糊精(規(guī)格：500 g，江蘇泰興新鑫醫(yī)藥輔料有限公司)；Lipoid S 100(規(guī)格：25 g，德國Lipoid Gmb H公司)；D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(規(guī)格：1 g，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；L-精氨酸(規(guī)格：100 g，美國Sigma)；L-瓜氨酸(規(guī)格：25 g，上海維塔化學試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器UV-2600型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)；SB-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；Zetasizer Nano ZS型粒度儀(英國馬爾文公司)；JEM-1400Plus型透射電鏡(日本電子株式會社)。

1.3 實驗動物SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(220 ± 10)g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，使用許可證號：SYXK(渝)2016-0001。

1.4 制備采用逆相蒸發(fā)法制備TPGS修飾脂質(zhì)體。稱取適量的磷脂、膽固醇和TPGS(摩爾比為1 ∶3 ∶1)，加入適量二氯甲烷溶解，避光、45 ℃條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至形成均勻薄膜。加入乙醚使薄膜溶解，再加入含多種微量金屬離子(Co2+、Ca2+、K+、Na+)的ADI的羥丙基-β-環(huán)糊精溶液，冰浴中超聲，再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，直至形成均勻的乳白色混懸液，最后通過0.22 μm濾膜即得ACLN。

1.5 酶活性

1.5.1測定方法 采用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法測定ADI酶活性[12]。簡單來講，在酸性高溫下，精氨酸水解產(chǎn)物L-瓜氨酸能與二乙酰一肟-氨基硫脲反應(yīng)顯紅色。精氨酸溶液置于37 ℃下水浴10 min，加入ADI或ACLN溶液，反應(yīng)5 min后，混合酸-鐵溶液終止反應(yīng)。加入顯色液混勻后在高溫下進行顯色反應(yīng)，最后測定紫外吸收值(λ=530 nm)。1個酶活力單位是指特定條件(37 ℃、pH 6.5)下，1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol L-精氨酸所需的ADI的量。

1.5.2線性范圍 配制系列L-瓜氨酸標準溶液，濃度分別為0、60、70、80、90、100、110、120、130、140 mg·L-1，按“1.5.1”項下處理后，以濃度為0 mg·L-1的L-瓜氨酸標準溶液為對照，測定其它樣品在530 nm處的吸光度值，繪制標準曲線。

1.5.3重復性 配制5份低、中、高(60、100、140 mg·L-1)濃度的L-瓜氨酸標準溶液，按“1.5.1”項下方法測定吸光度值，計算測量值RSD，考察方法的重復性。

1.5.4回收率 配制“1.5.3”項溶液，同法處理后，計算測量值與實際值的比，以考察方法的準確性。

1.5.5最適溫度、pH及4℃穩(wěn)定性 設(shè)置系列溫度(20-70 ℃)和系列pH(5.0-9.0)的反應(yīng)體系，按照“1.5.1”的方法分別測定ADI和ACLN的酶活性，取ADI最高活性為100%，計算其他樣品的相對活性，取最大相對活力的點為最適溫度或pH。將ADI和ACLN放置在4 ℃條件下，按預設(shè)的天數(shù)取適量樣品，同“1.5.1”法計算ADI相對活性，考察穩(wěn)定性。

1.5.6體外酶動力學 在特定條件下，以0.50、1.00、1.25、2.00、2.50、5.00和10.00 mmol·L-1的精氨酸溶液為底物，按“1.5.1”方法進行，計算L-瓜氨酸的量。以生成的L-瓜氨酸的量除以反應(yīng)時間計算反應(yīng)速度V，而L-精氨酸濃度為S，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，計算ADI和ACLN的Km、Vmax值。

1.6 體內(nèi)藥代動力學

1.6.1動物分組及處理 取12只♂ SD大鼠稱重后，隨機分為平均體重相似的兩組，按照80 U·kg-1分別尾靜脈給予原料藥ADI和ACLN，給藥前禁食24 h，處理整個過程中不禁水。

1.6.2樣品采集與處理方法 在給藥后168 h內(nèi)的各個時間點，眼底靜脈叢取血300 μL。標本需進行抗凝處理。5 000 r·min-1離心15 min，取血漿100 μL于-80 ℃保存待用。血漿樣本用去離子水稀釋后，按“1.5.1”項下方法進行測定，計算酶的活性并繪制時間-酶活性曲線。

1.6.3數(shù)據(jù)分析 用DAS 2.1.1軟件計算主要藥代動力學參數(shù)。將游離ADI與ACLN的藥時曲線下面積AUC(0-168 h)及藥峰濃度Cmax進行方差分析，再采用雙向單側(cè)t檢驗、90%置信區(qū)間考察，達峰時間Tmax采用非參數(shù)統(tǒng)計Wilcoxon檢驗，評價游離ADI與ACLN相比是否具有生物等效性(α=0.05)。

2 結(jié)果

2.1 測定方法學L-瓜氨酸在60-140 mg·L-1濃度范圍內(nèi)時，吸光度值與濃度呈線性相關(guān)。線性回歸方程為：A = 0.006 2 C-0.043 9，r=0.999。低、中、高濃度的L-瓜氨酸溶液測量結(jié)果RSD分別為3.55%、1.55%、1.93%，平均回收率分別為96.2%、101.4%、99.7%。結(jié)果表明，該方法重復性、準確性好，符合測定要求。

2.2 酶活性研究

2.2.1ACLN表征 ACLN為圓形或類圓形，ACLN粒徑為(201.23 ± 1.09)nm，表面電位為(-16.46 ± 0.48)mV，包封率為(59.39 ± 4.27)%。

2.2.2最適溫度、pH及4 ℃穩(wěn)定性 如Fig 1A，B所示，ADI和ACLN的最適溫度均為37 ℃，最適pH均為6.5，而且在最適溫度或pH下，ACLN的活性分別為ADI的1.35和1.3倍。如Fig 1C所示，在低溫下放置約70 d后，ADI的活性幾乎消失，而ACLN酶活性保留了60%左右，表明ACLN在4 ℃條件下放置穩(wěn)定性明顯高于ADI。

Fig 1 Optimum temperature, optimum pH and stability of ADI and ACLN n=3)

2.2.3體外酶學動力學 如Fig 2所示，由Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖計算得到ADI和ACLN的Km值分別為0.87 mmol·L-1、0.74 mmol·L-1，Vmax值分別為53.28 μmol·L-1·min-1、62.50 μmol·L-1·min-1。ACLN的Km低于ADI酶，Vmax約為ADI的1.17倍。表明ACLN提高了酶與底物的親和性，提高了ADI酶活性。

Fig 2 Lineweaver-Burk plot of ADI and ACLN n=3)

2.3 藥動學評價

2.3.1藥動學參數(shù) ACLN和游離酶ADI的活性-時間曲線(Fig 3)中，ADI酶活性下降隨時間較快，48 h失活。ACLN直到72 h仍然保留活性，且活性下降較ADI慢，表明了ACLN在體內(nèi)被消除的速度更慢。DAS 2.1.1軟件分析得知，ADI體內(nèi)代謝過程更符合非房室模型。由主要藥動學參數(shù)(Tab 1)可知，ACLN的AUC(0-168 h)和MRT(0-168 h)分別是ADI的3.81和2.69倍，ACLN的Tmax和Cmax分別是ADI的3.00和1.59倍，與游離ADI相比，ACLN的相對生物利用度為381.42%，以上結(jié)果表明，ACLN能夠延長ADI的體內(nèi)滯留時間，并提高ADI的生物利用度。

Fig 3 Activity-time curves of ADI and ACLN n=6)

Tab 1 Non-compartment model pharmacokinetic parameters of ADI and ACLN after intravenous administration n=6)

2.3.2生物等效性 由Tab 2可見，ACLN與游離ADI的AUC(0-168 h)和Cmax的90%置信區(qū)間均不在生物等效性標準區(qū)間范圍內(nèi)，對Tmax進行非參數(shù)Wilcoxon檢驗后發(fā)現(xiàn)ACLN與游離ADI的Tmax差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，故而可以判定，ACLN與游離ADI不具有生物等效性，ACLN的體內(nèi)生物利用度和藥效學標準更高。

Tab 2 Bioequivalence comparison of ACLN and free ADI after intravenous administration n=6)

3 討論

ADI是一種高效、低毒的抗腫瘤蛋白類藥物，為精氨酸的專一水解酶。ADI可以消耗掉癌癥病灶中的精氨酸，進而誘發(fā)線粒體功能障礙、過度自噬、核DNA泄漏，最終導致癌細胞死亡[13]。ADI承擔的精氨酸剝奪療法能夠在多種腫瘤上發(fā)揮抗癌作用。本研究首次使用TPGS修飾的環(huán)糊精脂質(zhì)體用來包載ADI，初步考察了ACLN的酶活性特點和體內(nèi)藥動學行為。

本實驗中采用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法測定ADI酶活性，方法可靠。與ADI相比，在最適溫度或pH下，ACLN的酶活性提高了約1.35和1.3倍，此外，ACLN的米氏常數(shù)低于ADI，說明ACLN對酶的親和性高于ADI。表明了TPGS修飾的環(huán)糊精脂質(zhì)體包載ADI后，能夠提高ADI的酶活性。影響酶活性的因素有很多，比如超聲作用、溶液環(huán)境、基團互作等，導致蛋白結(jié)構(gòu)域變構(gòu)進而使酶活性中心受到影響[11]。ACLN是一種擁有環(huán)糊精中空結(jié)構(gòu)的納米粒，包載ADI后并不影響酶的最佳反應(yīng)條件(溫度和pH)，但是在同等條件下表現(xiàn)出更高的酶活性，可能的原因在于：① 羥丙基-β-環(huán)糊精的疏水端與二聚體的酶的部分結(jié)構(gòu)域相互作用，使得酶與環(huán)糊精組成一個復雜的超分子共和物，使得酶活性中心更暴露，與底物親和性增強[14]；② 脂質(zhì)體的雙分子層結(jié)構(gòu)仿如質(zhì)膜隔室，能夠?qū)DI-環(huán)糊精復合物約束在磷脂層類，而小分子量的精氨酸和催化產(chǎn)物瓜氨酸是不受限制的自由進出的，這種微型反應(yīng)器能夠為ADI提供一個狹小獨立的反應(yīng)空間，使得底物與ADI接觸的機會更大，這也是酶活性提高的可能原因。

在體內(nèi)藥動學研究中，ACLN的生物利用度為ADI的3.81倍。表明將ADI包載與ACLN中，可以明顯提高藥物的生物利用度。可能原因如下：① 脂質(zhì)體具有緩釋、良好的生物相容性等特點，能夠限制ADI的釋放，并阻止體內(nèi)復雜環(huán)境對酶結(jié)構(gòu)的直接破壞，從而延長的藥物的作用時間[8]；② ACLN納米粒與酶相互作用，維持酶活性中心結(jié)構(gòu)，增強其應(yīng)對環(huán)境變化的能力，提高穩(wěn)定性；③ TPGS是一種天然的P-gp抑制劑，能夠限制細胞將藥物從胞內(nèi)轉(zhuǎn)至胞外，從而增加藥物在組織細胞中的滯留時間；④ 雙親性的TPGS可以加強對酶的包封，提高酶在機體內(nèi)的穩(wěn)定性[15]。綜上所述，本實驗制備的TPGS修飾環(huán)糊精脂質(zhì)體提高了ADI的酶活性和生物利用度。另外，TPGS修飾脂質(zhì)體具有肝臟靶向作用[11]，因此可以進一步研究ACLN在肝癌細胞和動物模型上的靶向抗癌作用。

(致謝：本文實驗在重慶醫(yī)科大學藥學院高校藥物工程研究中心完成，特此致謝！)