Fluspirilene下調(diào)Akt抗肝癌的分子機制研究

石西南，張榮平，解宇環(huán)，孟卓然，吳施國，陳 嶸，萬偉萍，張 珊，陳 偉，王 健

(1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室， 昆明 650500；2. 黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥系， 興義 562400；3. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院南藥研究院， 4.云南省高校芳香中藥研究重點實驗室；5. 云南省中醫(yī)治未病理論應(yīng)用研究創(chuàng)新團隊，6. 云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑學(xué)教研室，7. 云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 昆明 650500；8.昆明市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，昆明 650032；9. 云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 昆明 650000)

肝癌(hepatic cell carcinoma，HCC)是常見且晚期的慢性肝臟疾病，其死亡率占全世界疾病死亡率的9.1%，在癌癥發(fā)病率排第5位[1]。其疾病形成高風(fēng)險因子多與乙/丙型肝炎病毒感染[2]、肝毒性化合物、酒精及非酒精性脂肪肝等有關(guān)[3]。

細胞周期紊亂(abnormal cell cycle)是惡性腫瘤形成的一個主要特征。細胞周期蛋白依賴性激酶( cyclin-dependent kinases，CDKs) 的激活與失活維持著細胞周期各時相有序進行[4]。CDK2 與Cyclin E形成細胞周期激酶復(fù)合體可磷酸化激活Rb，形成G1過渡到S期的關(guān)鍵步驟[5-6]。抑制CDK2可以抑制腫瘤細胞的增生，為一個很好的腫瘤藥物靶點[7]。

我們前期通過體內(nèi)外分子生物學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)小分子化合物Fluspirilene通過下調(diào)了CDK2的表達，阻滯了細胞周期G1期，抑制肝癌細胞增殖[8-12]。但是Fluspirilene抗肝癌具體分子通路機制不明。

CDK4/6-cyclin D 和 CDK2-cyclin E兩種細胞周期激酶復(fù)合體可解除對含有視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白 (Rb) 和 E2F 的動態(tài)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的抑制作用，從而啟動細胞周期G1期到S期的順利轉(zhuǎn)換。在生長因子的作用下，Akt 可以磷酸化 FoxO1/3，并活化FoxO1/3出核功能，實現(xiàn)細胞存活和增殖。大量不同的刺激如TGF-β、DNA 損傷、復(fù)制性衰老等可通過轉(zhuǎn)錄因子作用誘導(dǎo)周期依賴性激酶抑制劑 (cyclin-dependent kinas inhibitors，CKIs) 的 Kip/Cip 家族成員p21、p27等水平上調(diào)從而抑制周期依賴性激酶CDK2/4/6的活性達到抑制細胞增殖的作用。前期實驗驗證了Fluspirilene下調(diào)了CDK2水平[12]，抑制肝癌細胞增殖作用，具體分子機制不明。本實驗通過mRNA轉(zhuǎn)錄組篩查：Fluspirilene干預(yù)了肝癌細胞的基因差異表達，進一步分子功能實驗驗證：Fluspirilene通過調(diào)控Akt激酶活性，下調(diào)磷酸化CDK2蛋白水平，干預(yù)細胞周期G1期，達到抗肝癌作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料Fluspirilene(Lot#103M4604V, Sigma)購自于美國Sigma公司。肝癌細胞系 HepG2和Huh7 購自于中國科學(xué)典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。胎牛血清購自于Invitrogen, Rockville, Maryland, USA。Akt、GAPDH抗體購自于Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Massachusetts, USA。細胞用含10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基在溫度37 ℃、5% CO2及 95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[13]。

1.2 儀器CO2細胞培養(yǎng)箱(S111)(Thermo, 美國); Min-PROTEAN Western blot電泳儀器(美國Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)SYSTEM GelDoc XR+IMAGELAB(美國Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1mRNA轉(zhuǎn)錄組篩查(mRNA array) 將處于對數(shù)生長的HepG2細胞進行消化、計數(shù)，加入六孔板中，每孔加入2 mL培養(yǎng)基，加入2×105個細胞懸液，孵育至細胞長滿到每孔70%-80%，加入Fluspirilene 15 μmol·L-1，4 h后進行細胞收集，加入適量TRIzol裂解液反復(fù)吹打混勻至形成清亮的透明液體，轉(zhuǎn)移到無酶管中干冰保存，送檢。實驗重復(fù)3次。

1.3.2BALB/C裸鼠移植瘤動物實驗 購買BALB/C裸鼠50只，4-5周,♂,體質(zhì)量(17±2)g(Vital River Laboratory Technology Co. Ltd, Peking, China)動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK(京)2012-0001,遵照昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗室倫理委員會制定的原則在特殊無菌的條件下進行喂養(yǎng)。成瘤時,先用含5×109/L肝癌細胞Huh7的PBS 注射到裸鼠右側(cè)腋窩皮下(同樣的實驗重復(fù)3次),1周后當(dāng)瘤塊長到80-100 mm3, 裸鼠隨機的分組(每組5只),用含有不同濃度Fluspirilene (8、15 mg·kg-1)或5-Flurouracil(5-Flurouracil,5-FU,)(Sigma) 10 mg·kg-1[14]的0.5% CMC-NaCl進行口服灌胃21 d后,裸鼠斷頸處死。腫瘤體積用公式V= ab2/2進行計算(a=最長直徑,b=最短直徑)。實驗重復(fù)3次。

1.3.3免疫組化(immunohistochemistry，IHC) 室溫二甲苯對樣本脫蠟、水化切片、熱抗原修復(fù)、封閉非特異性位點后，滴加一抗蓋住組織，然后放入濕盒內(nèi)4 ℃過夜。d 2，室溫復(fù)溫、PBS及蒸餾水沖洗后，加二抗，室溫孵育10 min后，PBS及蒸餾水沖洗。滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS及蒸餾水再沖洗。沖洗后每張切片快速滴加兩滴或者100 μL DAB溶液，染色合適即可終止染色，自來水沖洗。蘇木素復(fù)染，細胞核變藍色即可終止，自來水或者PBS沖洗還藍。1%鹽酸酒精分化后，自來水沖洗，脫水、涼干后滴加適量中性樹膠封片，蓋上蓋玻片、晾干。顯微鏡下拍照即可。實驗重復(fù)3次。

1.3.4Western blot實驗 HepG2細胞在六孔板內(nèi)用含10% FBS的 RPMI 1640 培養(yǎng)到每孔細胞長滿90%以后，倒掉培養(yǎng)基，加入含 Fluspirilene的10% FBS的 新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基，6 h后收集細胞，用含 1 mmol·L-1PMSF及蛋白酶抑制劑的RIPA buffer進行蛋白裂解后，把收集的樣本放在 4 ℃， 13 000 r·min-1，離心15 min，收集上清，用 BCA Protein Assay Kit (Thermo)進行蛋白濃度檢測。把測定濃度的蛋白樣本按不同目的濃度加入到 10% SDS-PAGE電泳液中進行目的蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗、加二抗。用ECL蛋白印跡底物(Pierce，Thermo，USA)化學(xué)發(fā)光法顯影拍照即可。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 mRNA轉(zhuǎn)錄篩查Fluspirilene處理肝癌細胞的基因差異表達我們前期試驗結(jié)果驗證了小分子化合物Fluspirilene具有強烈抗肝癌作用，但是具體分子機制不明。本實驗通過mRNA轉(zhuǎn)錄組篩查試圖尋找Fluspirilene處理肝癌細胞的差異基因表達，結(jié)果如Tab 1所示，F(xiàn)luspirilene對Akt基因表達量呈現(xiàn)3.07倍差異。Fig 1A紅色箭頭所示，F(xiàn)luspirilene處理肝癌細胞HepG2后，差異基因分類顯示Fluspirilene對細胞增殖分化過程影響明顯。Fig 1B轉(zhuǎn)錄組熱圖顯示，F(xiàn)luspirilene對Akt基因表達量呈現(xiàn)明顯差異；Akt蛋白表達水平呈現(xiàn)明顯低表達(Fig 1C)。

Tab 1 Quantity of gene expression on Fluspirilene treatment HCC cells

Fig 1 Effect of Fluspirilene treatment on HCC cells

2.2 Fluspirilene對BALB/C移植瘤裸鼠治療效果為了觀察Fluspirilene對動物體內(nèi)瘤體的抑制作用，通過對 BALB/C裸鼠皮下注射肝癌細胞Huh7成瘤實驗后,進行隨機分組(每組6只),通過口服灌胃21 d含不同劑量Fluspirilene (8、15 mg·kg-1)的0.5% CMC-NaCl。同時比較了5-Fu (10 mg·kg-1)對BALB/C裸鼠移植瘤的治療效果。我們的結(jié)果如Fig 2所示，當(dāng)治療21 d后，與對照組相比，F(xiàn)luspirilene治療組強烈的抑制了腫瘤的生長，且腫瘤瘤體重量及體積呈現(xiàn)濃度依賴性抑制作用。且與臨床常用抗肝癌藥物5-Fu呈現(xiàn)相同的抑制腫瘤的效果。

Fig 2 Effect of Fluspirilene treatment on HCC

2.3 Fluspirilene對腫瘤組織蛋白水平的影響Fig 2實驗表明Fluspirilene處理肝癌移植瘤小鼠后腫瘤體積及重量呈現(xiàn)明顯濃度依懶性抑制趨勢。進一步瘤體組織免疫組化檢測如Fig 3所示: Fluspirilene處理肝癌移植瘤小鼠后，與對照組織相比，F(xiàn)luspirilene處理組磷酸化-Akt(phosphorylate-Akt，p-Akt)呈現(xiàn)濃度依賴性低表達(Fig 3A)。

2.4 Fluspirilene對肝癌細胞蛋白水平的影響Fig 4A、B所示，F(xiàn)luspirilene處理肝癌細胞HepG2和Huh7后，與對照組相比，F(xiàn)luspirilene處理組Akt、磷

Fig 3 Effect of protein expression of cancer tissues on HCC xenograft BALB/C nude n=3)

Fig 4 Effect of protein expression on Fluspirilene treatment HCC n=3)

Fig 5 Mechanism of Fluspirilene suppressing HCC

酸化CDK2 (phosphorylate-CDK2，p-CDK2)及磷酸化Rb(phosphorylate-Rb，p-Rb)呈明顯濃度依賴性下降趨勢。

3 討論

細胞周期紊亂是惡性腫瘤的特征之一。CDKs作為細胞周期檢測點的重要調(diào)控因子，對細胞周期各時相有序進行起著重要調(diào)控作用。CDK2 與CyclinE形成細胞周期激酶復(fù)合物可磷酸化激活Rb，為G1期轉(zhuǎn)換到S 期的起著關(guān)鍵調(diào)控作用[4-6]。因此抑制CDK2活性可以抑制腫瘤細胞惡性增殖[7]。

Akt激酶是一種重要的蛋白激酶，在生理和病理方面都能夠通過磷酸化下游底物蛋白和轉(zhuǎn)錄因子來影響細胞生長、細胞遷移、腫瘤發(fā)生等許多重要的生理功能。Akt激酶屬于AGC激酶家族，它由3個保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，分別是：N端的PH結(jié)構(gòu)域、中央激酶催化亞基結(jié)構(gòu)域和1個含有調(diào)節(jié)疏水基序的C-末端。Akt激酶是細胞內(nèi)重要的調(diào)控蛋白，Akt的活性與其自身的磷化、去磷酸化密切相關(guān)。當(dāng)細胞分裂素、細胞因子等刺激時，Akt與PI3K結(jié)合并被招募到細胞膜上，然后被蛋白激酶1(PDK1)和mTORC2激活A(yù)kt磷酸化位點。激活的Akt進一步磷酸化其下游的底物，進而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。PI3K / Akt / mTOR 信號通路對肝臟惡性腫瘤細胞的增殖、遷移、存活和腫瘤的形成起到重要調(diào)控作用[15]。高表達Akt、mTOR與肝癌患者預(yù)后呈現(xiàn)直接相關(guān)[16]?；罨蟮腁kt參與細胞周期、腫瘤細胞生存等細胞重要進程[17-18]。

本團隊前期實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fluspirilene下調(diào)了CDK2蛋白表達水平，阻滯了細胞周期G1期，從而抗肝癌細胞增殖作用[12]，但是其具體分子機制不明。為了探索小分子化合物Fluspirilene與活化后的Akt激酶調(diào)控腫瘤細胞周期G1期影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本實驗進行了如下研究。首先通過mRNA轉(zhuǎn)錄組篩查發(fā)現(xiàn)：Fluspirilene處理肝癌細胞后Akt基因呈現(xiàn)3.07倍差異表達，進一步蛋白實驗驗證了其差異表達(Fig 1)。據(jù)此，本實驗推測Fluspirilene有可能通過抑制了CDK2的上游通路Akt激酶的活性，從而降低了CDK2的活性，阻滯了細胞周期G1期抗肝癌作用。為了驗證本假設(shè)，本團隊進一步進行了動物實驗，結(jié)果表明：與對照組相比，F(xiàn)luspirilene治療組強烈的抑制了腫瘤的生長，且腫瘤瘤體重量及體積呈現(xiàn)濃度依賴性抑制作用(Fig 2)。為了驗證Fluspirilene抗肝癌是通過抑制了Akt激酶活性抗肝癌的假設(shè)，接下來對動物瘤體組織進行免疫組化檢測，結(jié)果表明：p-Akt蛋白呈現(xiàn)濃度依賴性低表達(Fig 3)。又為了驗證Fluspirilene通過抑制了CDK2上游通路Akt激酶的活性，而下調(diào)了CDK2的活性達到阻滯細胞周期G1的假設(shè)，進一步通過Western blot實驗處理肝癌細胞，檢測結(jié)果表明：Fluspirilene治療組Akt、p-CDK2、p-Rb蛋白表達水平呈現(xiàn)明顯濃度依賴性下降(Fig 4)。

本實驗通過體內(nèi)外分子生物功能實驗驗證了Fluspirilene抗肝癌的作用，并推測小分子化合物Fluspirilene可能通過下調(diào)Akt活性，干預(yù)下游CDK2/Rb細胞周期信號分子通路, 阻滯細胞周期G1期，從而抑制肝癌細胞增殖作用(Fig 5)。通過mRNA轉(zhuǎn)錄組篩查熱圖(Fig 1)顯示Fluspirilene處理肝癌細胞后同時有幾個基因都有差異表達，我們推測Fluspirilene抗肝癌作用可能通過一個復(fù)雜的分子信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)而實現(xiàn)的，這部分的假設(shè)將是本團隊接下來將要深入探討的內(nèi)容。