自噬水平與白血病K562/ADM細(xì)胞耐藥的關(guān)系研究

李彩麗，高 靜，黃雙盛，趙永勛，劉 進(jìn)，黃 濤，李 敏

(1.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)教研室, 2. 西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅 蘭州 730030；3. 蘭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，甘肅 蘭州 730000)

白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，主要臨床表現(xiàn)為出血、感染、貧血和多器官浸潤(rùn)等，病情進(jìn)展迅速，病死率高。其發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚[1]。白血病的治療方針是通過(guò)合理的綜合性治療，使白血病患者的預(yù)后得到極大改善，獲得治愈或長(zhǎng)期穩(wěn)定生存[2]?；熞廊皇侵委煱籽〉闹饕椒?，但化療過(guò)程中藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥現(xiàn)象是臨床化療失敗的主要原因之一。白血病耐藥發(fā)生率約占白血病治療人數(shù)的33%[3]，根據(jù)其發(fā)生原因不同分為兩類：一類是細(xì)胞天然對(duì)某種化療藥物產(chǎn)生耐受，稱為原發(fā)性耐藥(primary drug resistance);另一類是化療藥物長(zhǎng)期作用后細(xì)胞對(duì)該種藥物產(chǎn)生抵抗或耐受現(xiàn)象，稱為繼發(fā)性耐藥(secondary resistance),有些白血病細(xì)胞甚至?xí)a(chǎn)生繼發(fā)性多藥耐藥現(xiàn)象(multidrug resistance，MDR)[4]。MDR的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，鉑類藥物和烷化劑等耐藥與細(xì)胞自噬水平有關(guān)[5]。本研究以慢性髓系白血病K562細(xì)胞為研究對(duì)象，用蒽環(huán)類化療藥物阿霉素(adriamycin，ADM)體外“逐步提高藥物濃度+間歇性刺激”的方式逐步誘導(dǎo)建立對(duì)ADM有穩(wěn)定耐藥性的K562/ADM細(xì)胞，一方面觀察K562/ADM細(xì)胞對(duì)吡柔比星、柔紅霉素等其它化療藥物是否有交叉耐藥現(xiàn)象，從而篩選出與常規(guī)化療藥物不存在交叉耐藥的新型藥物，為臨床攻克白血病MDR提供研究基礎(chǔ)。另一方面我們通過(guò)觀察耐藥前后細(xì)胞自噬水平的變化，并用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制細(xì)胞自噬，觀察自噬水平對(duì)K562/ADM細(xì)胞化療敏感性及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，旨在研究K562/ADM細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

1.1.1細(xì)胞株 人類白血病K562細(xì)胞購(gòu)自American Type Culture Collection (ATCC，Manassas，USA)。

1.1.2K562/ADM細(xì)胞的誘導(dǎo)與建立 以K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，從ADM濃度0.02 μmol·L-1開(kāi)始，采用“逐步提高藥物濃度+間歇性刺激”的方式逐步誘導(dǎo)其對(duì)ADM產(chǎn)生耐藥，最終誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠穩(wěn)定耐受15 μmol·L-1ADM的耐藥細(xì)胞，稱之為K562/ADM細(xì)胞，該細(xì)胞在液氮中凍存3個(gè)月以上復(fù)蘇后其耐藥性依然維持穩(wěn)定。

1.1.3試劑 MTT(M2003)，三氧化二砷(arsenictrioxide，As2O3)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，As2O3用0.1 mol·L-1NaOH溶解后，用PBS配制成10 mmol·L-1的貯存液；ADM(國(guó)藥準(zhǔn)字：H44024359)購(gòu)自深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司；柔紅霉素(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20058349)、吡柔比星(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20045982)購(gòu)自浙江海正藥業(yè)有限公司；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil， 5-FU)(國(guó)藥準(zhǔn)字：H31020593)購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；長(zhǎng)春新堿(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20064346)購(gòu)自廣東嶺南制藥有限公司；單丹黃酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)(貨號(hào)：30432)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白提取及定量試劑盒(索萊寶公司)；兔源LC3-Ⅰ/Ⅱ(貨號(hào)：#4108)、Beclin-1(貨號(hào)：#3495)、p62(貨號(hào)：#5114)、P-gp(貨號(hào)：#13978)、MRP1(貨號(hào)：#72202)、BCRP(貨號(hào)：#4477)一抗和鼠源β-actin一抗(貨號(hào)：#3700)均購(gòu)自美國(guó)CST公司；IRDye800DX標(biāo)記的羊抗鼠(C80816-10)和IRDye700DX標(biāo)記的羊抗兔(C81106-06)紅外熒光抗體均購(gòu)自LI-COR公司。

1.1.4儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；透射電鏡(日本電子公司)；轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN COULTER)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 K562細(xì)胞及K562/ADM細(xì)胞以5×104個(gè)·L-1接種到含10%胎牛血清及2 mmol·L-1谷氨酰胺的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，置于5% CO2、37 ℃ 及飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞分別按5×107·L-1接種96孔板，按照一定梯度分別加入不同濃度的阿霉素、柔和霉素、As2O3、吡柔比星、5-FU、長(zhǎng)春新堿等，5 % CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h,于培養(yǎng)終止前4 h 每孔加入MTT(5 g·L-1)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入10%SDS后放培養(yǎng)箱過(guò)夜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值(A值)，依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%=(對(duì)照組A值 -實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值 ×100%。

1.2.3透射電鏡觀察細(xì)胞的自噬形態(tài)學(xué)改變 收集細(xì)胞，PBS洗滌，3%戊二醛固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片，枸櫞酸鉛及醋酸鈾雙重染色，透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4MDC染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬水平 在培養(yǎng)的K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞中分別加入酸性囊泡染液MDC使其終濃度為0.05 mmol·L-1，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度并滴片，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬變化。

1.2.5Annexin-V/PI 雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin-V和PI染液，避光孵育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Western blot法檢測(cè)自噬及耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸5 min后上樣，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉+PBST封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后按1 ∶10 000比例加入IRDye700DX和IRDye800CW二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，用Odyssey紅外熒光掃描儀掃描并分析。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析處理，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ADM對(duì)K562細(xì)胞及K562/ADM細(xì)胞的增殖抑制作用不同濃度ADM對(duì)親本K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞的增殖抑制程度存在明顯差異(Fig 1A)。ADM對(duì)K562細(xì)胞24 h、48 h和72 h的IC50分別為5.53、3.87和0.74 μmol·L-1；而ADM對(duì)K562/ADM細(xì)胞24 h、48 h和72 h的IC50分別為134.4、79.7和53.8μmol·L-1(Fig 1B)，3個(gè)時(shí)間段的藥物抗性系數(shù)均大于20。

2.2 K562/ADM細(xì)胞出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象用不同濃度5-FU、吡柔比星、柔紅霉素、長(zhǎng)春新堿和As2O3分別作用于親本K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞24、48和72h，計(jì)算IC50值并比較這兩種細(xì)胞對(duì)以上幾種化療藥物的敏感性。結(jié)果表明K562/ADM細(xì)胞對(duì)5-FU、吡柔比星、柔紅霉素、長(zhǎng)春新堿等4種化療藥物均出現(xiàn)明顯的交叉耐藥現(xiàn)象，但對(duì)As2O3并不出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。相反，K562/ADM細(xì)胞對(duì)As2O3更加敏感，24 h、48 h和72 h的IC50值較K562細(xì)胞分別下降31.6%、36.3%和42.7%(Fig 2)。這也進(jìn)一步說(shuō)明As2O3與其他化療藥物的作用靶點(diǎn)不同，可用于治療對(duì)其他化療藥物耐受或化療后復(fù)發(fā)的白血病患者。

2.3 K562/ADM細(xì)胞耐藥前后細(xì)胞自噬水平的變化用透射電鏡和MDC染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，K562/ADM細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量和MDC點(diǎn)塊狀熒光強(qiáng)度較K562細(xì)胞顯著增多。用Western blot檢測(cè)K562/ADM細(xì)胞耐藥前后自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、p62的表達(dá)水平。結(jié)果表明，K562/ADM細(xì)胞內(nèi)與自噬體形成有關(guān)的蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)水平較親本K562細(xì)胞分別增加了0.78倍和6.5倍。而p62作為自噬的底物蛋白，其表達(dá)水平隨著細(xì)胞自噬水平的增高反而降低(Fig 3)。這說(shuō)明K562細(xì)胞對(duì)ADM耐藥后細(xì)胞自噬水平較耐藥前明顯增強(qiáng)。

Fig 1 The inhibitory effect of ADM on K562 and

2.4 3-MA對(duì)K562/ADM細(xì)胞化療敏感性的影響用3 mmol·L-13-MA預(yù)處理K562/ADM細(xì)胞3 h后再用不同濃度ADM作用細(xì)胞72 h，對(duì)K562/ADM細(xì)胞的增殖抑制程度較ADM單獨(dú)作用組顯著增加。3-MA與ADM聯(lián)合作用組的IC50為11.3 μmol·L-1，較ADM單獨(dú)作用組降低了74.8%(Fig 4A)。用Annexin V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，3 mmol·L-13-MA與30 μmol·L-1ADM聯(lián)合作用組的總凋亡率為41.4%，而ADM單獨(dú)作用組的總凋亡率為18.5%，兩者相比差異有顯著性(P<0.01)(Fig 4B，4C)。

2.5 3-MA對(duì)K562/ADM細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響P-gp和BCRP均可作為多種親脂性化療藥物(如阿霉素、長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、吡柔比星等)的“外排泵”直接將藥物泵出細(xì)胞外，避免藥物對(duì)細(xì)胞造成損傷，從而導(dǎo)致腫瘤耐藥。MRP1能夠識(shí)別多種化療藥物與谷胱甘肽(GSH)形成的偶合物并將其轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞[6-7]，因此，P-gp、MRP1和BCRP 3種蛋白均與腫瘤耐藥有關(guān)。我們用Western blot檢測(cè)K562/ADM細(xì)胞耐藥前后及3 mmol·L-13-MA作用48 h后耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP1和BCRP的表達(dá)水平。結(jié)果表明，K562/ADM細(xì)胞內(nèi)P-gp、MRP1和BCRP的表達(dá)水平較親本K562細(xì)胞均顯著上調(diào)，而3-MA能有效抑制K562/ADM細(xì)胞內(nèi)P-gp、MRP1和BCRP蛋白的表達(dá)(Fig 5)。

Fig 2 K562 /ADM cells resistance to otherchemotherapeutic drugs n=4)

Fig 3 Comparison of autophagy level between K562 and

3 討論

自噬是細(xì)胞在外環(huán)境刺激下，通過(guò)溶酶體降解其內(nèi)部錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器等內(nèi)容物而實(shí)現(xiàn)自我調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，有眾多基因參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)。細(xì)胞自噬產(chǎn)生的物質(zhì)可以供細(xì)胞重新利用，可以使細(xì)胞在十分嚴(yán)峻的生存條件下通過(guò)降解自身物質(zhì)提供營(yíng)養(yǎng)成分和能量從而得以生存[8]。自噬與腫瘤關(guān)系密切，在不利的腫瘤微環(huán)境中，自噬降解系統(tǒng)及其嚴(yán)密的防御體系構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞賴以生存、增殖甚至耐藥和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[6,9-10]。

白血病化療過(guò)程中由化療藥物誘發(fā)的MDR現(xiàn)象往往是白血病治療失敗和復(fù)發(fā)的主要原因之一。目前關(guān)于MDR現(xiàn)象的確切機(jī)制尚不明確，而且至今也缺乏有效的干預(yù)措施。有文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，自噬參與胃癌、食道癌和肝癌等實(shí)體瘤的耐藥性形成[11-13]?；谶@些研究背景我們考慮：白血病細(xì)胞在某種化療藥物誘導(dǎo)下是否會(huì)產(chǎn)生MDR現(xiàn)象？耐藥是否與自噬有關(guān)？在本研究中，我們通過(guò)模擬臨床化療過(guò)程，從0.02 μmol·L-1ADM開(kāi)始，逐漸提高藥物濃度、間歇性誘導(dǎo)K562細(xì)胞對(duì)ADM產(chǎn)生耐藥并建立穩(wěn)定耐受15 μmol·L-1ADM的K562/ADM細(xì)胞，并測(cè)定該細(xì)胞對(duì)阿霉素、吡柔比星、柔紅霉素、5-FU、長(zhǎng)春新堿和As2O3的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)K562/ADM細(xì)胞對(duì)吡柔比星、柔紅霉素、5-FU和長(zhǎng)春新堿均產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象，而對(duì)As2O3較K562細(xì)胞更加敏感。這一方面說(shuō)明K562/ADM細(xì)胞出現(xiàn)MDR現(xiàn)象,另一方面說(shuō)明As2O3在治療白血病方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，且沒(méi)有明顯的骨髓抑制和其他毒副作用。臨床發(fā)現(xiàn)在維甲酸治療后達(dá)到緩解的急性早幼粒細(xì)胞白血病患者中，聯(lián)合使用As2O3可以鞏固維甲酸的療效，因此As2O3被認(rèn)為是維甲酸的黃金搭檔[14-15]。陳竺、陳賽娟等科學(xué)家通過(guò)臨床試驗(yàn)使用As2O3對(duì)抗全反式維甲酸耐藥取得了成功，這表明As2O3在抗白血病和抗耐藥方面有顯著的效果和獨(dú)特的作用機(jī)制。因此，開(kāi)發(fā)出與常規(guī)化療藥物不存在交叉耐藥并能增強(qiáng)常規(guī)藥物療效的新型藥物是攻克白血病MDR的潛在有效機(jī)制，也是我們進(jìn)一步研究的方向。

阿霉素曾被認(rèn)為是最有效的化療藥物之一，但近年來(lái)日趨嚴(yán)重的MDR現(xiàn)象嚴(yán)重制約了其臨床使用，其引起MDR的機(jī)制非常復(fù)雜，主要與ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族有關(guān)，該家族成員P-gp、MRP1和BCRP等耐藥相關(guān)蛋白能通過(guò)不同機(jī)制將化療藥物外排[16]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，K562/ADM細(xì)胞通過(guò)高表達(dá)P-gp、MRP1和BCRP等蛋白將吡柔比星、柔紅霉素、5-FU和長(zhǎng)春新堿等化療藥物泵出細(xì)胞，是K562/ADM細(xì)胞出現(xiàn)交叉耐藥的重要原因之一。此外，我們通過(guò)觀察自噬形態(tài)學(xué)改變和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化客觀反映細(xì)胞自噬強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)K562/ADM細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬水平較親本K562細(xì)胞顯著增加，抑制自噬既能顯著提高K562/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，也能抑制耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，這說(shuō)明細(xì)胞自噬水平增高是K562/ADM細(xì)胞出現(xiàn)耐藥的另一重要原因。

Fig 4 Effectof 3-MA on sensitivity of K562/ADM cells to n=3)

Fig 5 Expression of resistance-associated n=3)

如今，靶向自噬也逐漸成為靶向治療白細(xì)胞等血液腫瘤的重要機(jī)制之一，使自噬在血液系統(tǒng)腫瘤中的作用機(jī)制得到越來(lái)越多的研究和認(rèn)識(shí)。本研究從MDR和自噬角度對(duì)K562/ADM細(xì)胞進(jìn)行了初步探究，還需要進(jìn)一步深入研究。相信隨著科學(xué)的發(fā)展，自噬與白血病復(fù)發(fā)、自噬調(diào)控及耐藥等問(wèn)題將會(huì)不斷得到揭示。