遠(yuǎn)志皂苷對(duì)轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型行為學(xué)及壽命的影響

劉 瑩，劉 莉，關(guān)慧波

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床博士后流動(dòng)站，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管病一科，哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)診斷教研室，哈爾濱 150040）

阿爾茨海默病（alzheimer disease,AD）是臨床常見(jiàn)的一種癡呆類型，也稱為“老年性癡呆”。其發(fā)病多見(jiàn)于老年人群，在我國(guó)60 歲以上阿爾茨海默病的發(fā)病率達(dá)7.2%。是一種以認(rèn)知障礙、記憶力減退、行為異常等為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。在阿爾茨海默病發(fā)病的多種致病因素中，基因突變或表達(dá)異常是已確定的病因，至少有70%與其相關(guān)。老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)是阿爾茨海默病患者腦內(nèi)相同的病理特點(diǎn)，Tau 蛋白是神經(jīng)纖維纏結(jié)的結(jié)構(gòu)蛋白，tau 蛋白和tau蛋白基因在阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展中起到極為重要的作用。

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科多年生草本植物遠(yuǎn)志（Polygala tenuifoliaWill.）或?qū)捜~遠(yuǎn)志（P.sibirica L.）的根，最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》。遠(yuǎn)志具有寧心安神功效，治療心神不安、驚悸、失眠、健忘等證。《神農(nóng)本草經(jīng)》：“利九竅，益智慧，耳目聰明，不忘，強(qiáng)志，倍力”?！端幮哉摗罚骸爸谓⊥?，安魂魄，令人不迷”[1]。有學(xué)者對(duì)遠(yuǎn)志做了大量的腦保護(hù)及記憶改善實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均表明遠(yuǎn)志可以改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的記憶能力。遠(yuǎn)志皂苷是遠(yuǎn)志屬植物中的主要藥效成分[2]。研究顯示，遠(yuǎn)志皂苷具有改善記憶能力，抑制腦組織的氧化應(yīng)激[3]，腦保護(hù)[4]等作用。

本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)tau 基因果蠅為模型，通過(guò)果蠅攀爬能力實(shí)驗(yàn)、果蠅嗅覺(jué)記憶實(shí)驗(yàn)及果蠅壽命實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志皂苷對(duì)阿爾茨海默病的治療作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

野生型Canton special（CS）黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）（由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所果蠅資源與技術(shù)平臺(tái)提供）；轉(zhuǎn)tau 基因果蠅（印第安納大學(xué)伯明頓果蠅儲(chǔ)存中心）；遠(yuǎn)志皂苷（成都曼思特生物科技有限公司提供）。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備：玉米粉42 g，瓊脂3 g，蔗糖31 g，酵母粉3 g，以上材料倒入460 mL 蒸餾水，不斷攪拌并加熱，煮沸后4 min，加入2.5 g 丙酸，持續(xù)攪拌，直至冷卻。倒入高12 cm，直徑3 cm 經(jīng)高溫滅菌的指管中，培養(yǎng)基厚度約2 cm。培養(yǎng)基需倒置于干燥實(shí)驗(yàn)室內(nèi)24 h 以上。遠(yuǎn)志皂苷培養(yǎng)基的制備：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入遠(yuǎn)志皂苷，制成2%濃度遠(yuǎn)志皂苷培養(yǎng)基（前期實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論2%為實(shí)驗(yàn)最佳濃度）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 收集處女蠅 12 h 內(nèi)孵化出的幼蟲(chóng)不交配，在12 h內(nèi)把雌雄果蠅分開(kāi)培養(yǎng)，所得的果蠅即為處女蠅。每天晚上18:00－19:00 將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的成蠅轉(zhuǎn)移，次日早晨6:00－7:00 對(duì)新羽化的果蠅進(jìn)行挑選，麻醉后收集12 h 內(nèi)羽化的雄性處女蠅，將其移入裝有新鮮培養(yǎng)基的玻璃指管內(nèi)，每個(gè)玻璃指管30 只左右，并標(biāo)明日齡。每3 d 更換1 次培養(yǎng)基。

2.2 分組方法 收集正常雄性CS 型處女蠅，喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（空白組）；轉(zhuǎn)tau 基因雄性處女蠅，喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（模型組）；轉(zhuǎn)tau 基因雄性處女蠅，喂2%濃度遠(yuǎn)志皂苷培養(yǎng)基（遠(yuǎn)志組）。連續(xù)喂養(yǎng)5 d（前期實(shí)驗(yàn)結(jié)論，5 d 為最佳給藥天數(shù)），每2 d 更換1 次培養(yǎng)基。測(cè)試時(shí)每組果蠅各取40 只。

2.3 果蠅攀爬能力實(shí)驗(yàn) 果蠅攀爬能力實(shí)驗(yàn)是利用果蠅的反趨地性，通過(guò)觀察果蠅在垂直的指管內(nèi)的爬行情況來(lái)測(cè)試果蠅的運(yùn)動(dòng)能力。將3 組待測(cè)果蠅分別裝入高×外徑×厚為12 ×3 ×0.1 cm3空指管中，果蠅置空指管內(nèi)適應(yīng)5 min，輕晃指管將果蠅搖至瓶底，果蠅由于習(xí)性將向上爬（正常果蠅具有反趨地性行為，即在一個(gè)垂直地面的空間內(nèi)會(huì)自發(fā)地向上運(yùn)動(dòng)）。暗室紅燈下測(cè)試10 s 到達(dá)指管頂部的果蠅個(gè)數(shù)（A），至少連續(xù)記錄5 次，每次至少間隔1 min，每次晃動(dòng)的力度一致。計(jì)算攀附指數(shù)CI ＝A／總數(shù)。記錄5 次攀爬指數(shù)取平均值。

2.4 果蠅嗅覺(jué)記憶實(shí)驗(yàn) 將3 組待測(cè)果蠅分別放入空指管內(nèi)饑餓2 h 后，放入1 000 mL 的燒杯中。燒杯中放有2 個(gè)50 mL 帶孔離心管，其中一個(gè)離心管內(nèi)直接放入香蕉，果蠅可聞到氣味，并且通過(guò)孔洞進(jìn)入離心管內(nèi)時(shí)可直接吃到香蕉；另一個(gè)在香蕉的外面包有兩層紗布，果蠅可聞到氣味，但無(wú)法吃到香蕉。每隔1 h記錄進(jìn)入無(wú)障礙離心管果蠅的數(shù)目，連續(xù)記錄8 h，每組記錄5 次，取平均值。

2.5 果蠅壽命實(shí)驗(yàn) 每天早8 時(shí)統(tǒng)計(jì)3 組果蠅的死亡數(shù)目，直到果蠅全部死亡。每組中所有果蠅存活天數(shù)的代數(shù)平均數(shù)為本組平均壽命；每組中前半數(shù)果蠅存活天數(shù)的平均值為半數(shù)死亡時(shí)間；每組中最后死亡的10 只果蠅存活天數(shù)的平均值為本組的最高壽命。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 果蠅攀爬能力實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SPSS 19.0 進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，果蠅嗅覺(jué)記憶及壽命實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SPSS 19.0 進(jìn)行t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 遠(yuǎn)志皂苷對(duì)轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型攀附指數(shù)的影響 見(jiàn)表1。

表1 遠(yuǎn)志皂苷對(duì)轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型攀附指數(shù)的影響（）

表1 遠(yuǎn)志皂苷對(duì)轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型攀附指數(shù)的影響（）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.2 遠(yuǎn)志皂苷對(duì)轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型嗅覺(jué)記憶的影響 見(jiàn)表2。

3.3 遠(yuǎn)志皂苷對(duì)轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型壽命的影響 見(jiàn)表3。

表2 遠(yuǎn)志皂苷對(duì)轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型嗅覺(jué)記憶的影響（）

表2 遠(yuǎn)志皂苷對(duì)轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型嗅覺(jué)記憶的影響（）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

表3 遠(yuǎn)志皂苷對(duì)轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型壽命的影響（）

表3 遠(yuǎn)志皂苷對(duì)轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型壽命的影響（）

注：與空白組比較，P ＜0.05；與模型組比較，# P ＜0.05

4 討論

實(shí)驗(yàn)研究從抗氧化應(yīng)激、抗炎、影響細(xì)胞周期等不同機(jī)制方面和調(diào)節(jié)不同通路方面證實(shí)遠(yuǎn)志皂苷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。劉威等[5]研究表明遠(yuǎn)志皂苷能通過(guò)下調(diào)Caspase-3、Bax 表達(dá)、提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性來(lái)減輕新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷，對(duì)其神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。還有研究[6]證實(shí)，遠(yuǎn)志皂苷對(duì)NAPP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有保護(hù)作用，機(jī)制同樣與上調(diào)Bcl-2,下調(diào)Bax、Caspase-3 表達(dá)有關(guān)。遠(yuǎn)志皂苷對(duì)丙泊酚重復(fù)麻醉大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有保護(hù)作用，與其降低氧化應(yīng)激損傷及減少細(xì)胞凋亡有關(guān)[7]。李巧[8]研究結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志皂苷能抑制Aβ的神經(jīng)毒性，提高細(xì)胞抗氧化能力，減輕炎性損傷，從而起到神經(jīng)保護(hù)的作用，可能與其調(diào)節(jié)AMPK/m TOR/ULK1通路，上調(diào)Beclin-1,LC3-II/I 蛋白表達(dá)而活化自噬過(guò)程，降低BACE1 活性，使Aβ 減少有關(guān)。郭新明[9]研究結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志皂苷能改善快速老化小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與降低腦組織乙酰膽堿酯酶水平相關(guān)。倪杰等[10]以阿爾茨海默病大鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志皂苷可以提高Aβ1-40 誘導(dǎo)的阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與提高海馬低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRPP1）含量有關(guān)。鄭堯杰[11-12]對(duì)遠(yuǎn)志皂苷干預(yù)Aβ 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞功能的研究結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志皂苷能抑制PC12 細(xì)胞周期活化進(jìn)程，與降低細(xì)胞周期蛋白表達(dá)有關(guān)，并能提高Aβ 轉(zhuǎn)運(yùn)，減輕Aβ 導(dǎo)致的過(guò)度氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷等機(jī)制有關(guān)。

陳玉靜等[13]研究表明，在體外培養(yǎng)的PC12 細(xì)胞，其tau 蛋白磷酸化在某些位點(diǎn)上受到O-Glc NAc 糖基化修飾的負(fù)調(diào)節(jié)，遠(yuǎn)志皂苷元能通過(guò)提高O-Glc NAc 糖基化表達(dá)，而降低 PC12 細(xì)胞tau 蛋白磷酸化水平。遠(yuǎn)志皂苷能減輕阿爾茨海默病大鼠腦神經(jīng)元中tau 蛋白Ser396 位點(diǎn)過(guò)度磷酸化，減輕Aβ 造成的神經(jīng)細(xì)胞毒，其作用機(jī)制可能與PKA 蛋白表達(dá)下調(diào)，PP2A 蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)[14]。

在阿爾茨海默病患者腦中的tau 蛋白明顯高于正常人，且表現(xiàn)為異常磷酸化、過(guò)度泛素化和糖基化[15]。Tau 蛋白是神經(jīng)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，參與神經(jīng)細(xì)胞的骨架構(gòu)成和功能。在阿爾茨海默病腦中，tau 蛋白異常磷酸化后失去了與微管蛋白的結(jié)合能力，不再參與穩(wěn)定細(xì)胞骨架及促進(jìn)微管組裝功能的作用[16]。異常磷酸化的tau 蛋白損害細(xì)胞核和線粒體功能，減少軸突起始段的動(dòng)作電位。病理tau 可以進(jìn)一步包裝成外體，由一個(gè)神經(jīng)元釋放，被另一個(gè)神經(jīng)元攝取，促進(jìn)其致病性[17]。干擾神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)障礙[18]，并聚集成雙螺旋纖維絲（PHF），形成神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFTs）[19]，導(dǎo)致阿爾茨海默病的一系列認(rèn)知和行為障礙表現(xiàn)。

果蠅在1901 年被用做實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在生命科學(xué)發(fā)展的歷史長(zhǎng)河中，果蠅扮演了十分重要的角色。各類神經(jīng)疾病的研究，如帕金森病、老年癡呆、衰老與長(zhǎng)壽、學(xué)習(xí)與記憶、認(rèn)知行為等等。以果蠅為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑颍涸诖_定了的13 600 個(gè)果蠅基因中，有一半蛋白與哺乳動(dòng)物序列同源。果蠅的染色體組小且全，給研究操作提供了方便[20]。與脊椎動(dòng)物相比，果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)比較簡(jiǎn)單，所以對(duì)其解剖、生理、病理等方面的研究也就相對(duì)簡(jiǎn)單。果蠅與哺乳動(dòng)物在神經(jīng)疾病發(fā)生的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)和信號(hào)通路，以及病證等方面都高度一致。且果蠅繁殖能力強(qiáng)，能夠在短期內(nèi)繁殖出試驗(yàn)所需數(shù)量。因此，研究神經(jīng)系統(tǒng)基本問(wèn)題，果蠅模型是非常簡(jiǎn)單、有效、易得的。轉(zhuǎn)tau 基因果蠅的制備及鑒定方法：將表達(dá)tau 基因的質(zhì)粒，用PCR 法擴(kuò)增并構(gòu)建到PUAST 表達(dá)載體中，用顯微注射法在果蠅受精卵中注射構(gòu)建好的重組分子，用mini-white 標(biāo)記基因篩選，這種方法可以測(cè)出是否tau 基因整合到果蠅基因能夠表達(dá)的區(qū)域內(nèi)，可以得到獨(dú)立的轉(zhuǎn)tau 基因果蠅品系。當(dāng)整合成功時(shí)，mini-white 在轉(zhuǎn)基因果蠅體內(nèi)編碼蛋白使得其眼睛變成紅色。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：遠(yuǎn)志皂苷可顯著提高轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型的攀附指數(shù)。遠(yuǎn)志皂苷顯著提高轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型進(jìn)入無(wú)障礙離心管的數(shù)量。遠(yuǎn)志皂苷顯著提高轉(zhuǎn)tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型的半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命、最高壽命。以上實(shí)驗(yàn)所得出的結(jié)論，遠(yuǎn)志皂苷可有效提高轉(zhuǎn)tau基因果蠅的運(yùn)動(dòng)能力、記憶力，延長(zhǎng)其壽命。