新型單細(xì)胞分析技術(shù)
——質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)在白血病治療中的應(yīng)用

田紅娟，張任樂，喬艷紅，張登霞，劉蓓,3

0 引言

白血病是造血干細(xì)胞在不同分化階段由于分化障礙、凋亡受阻及克隆增生引起的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，目前白血病的治療方法有化療、放射治療、免疫治療、靶向治療、干細(xì)胞移植等。白血病治療期望實(shí)現(xiàn)個體化，質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（cytometng by time-of-flight,CyTOF）將流式細(xì)胞分析方法與質(zhì)譜檢測方法相結(jié)合，可同時測量單細(xì)胞中幾十種甚至上百種特征標(biāo)志物，既有熒光流式細(xì)胞術(shù)高速分析的特點(diǎn)，又有質(zhì)譜檢測的高精確度與高識別能力[1-2]，可實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞水平分析異質(zhì)白血病細(xì)胞的免疫表型及復(fù)雜的信號通路變化[3]，研究高度異質(zhì)性白血病細(xì)胞群的生物學(xué)[4-5]，分析血液腫瘤與免疫系統(tǒng)的相互作用[6-7]，有助于深入了解白血病發(fā)生、發(fā)展及耐藥機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更多白血病潛在治療靶點(diǎn)[8-9]，為白血病治療提供新的啟示，并監(jiān)測白血病患者靶向治療和細(xì)胞毒性治療反應(yīng)[10]。CyTOF作為一種新技術(shù)，有助于指導(dǎo)白血病個體化治療，體現(xiàn)了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的新發(fā)展。

1 CyTOF工作原理

CyTOF是一種新的高維多參數(shù)單細(xì)胞分析技術(shù)，其測量參數(shù)多、單細(xì)胞識別準(zhǔn)確率高，克服了傳統(tǒng)熒光流式細(xì)胞術(shù)光譜重疊的局限性[11-13]。Cy-TOF基本原理是用金屬標(biāo)簽抗體標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)入質(zhì)譜流式細(xì)胞儀后，用流式細(xì)胞技術(shù)分離成單個細(xì)胞，并逐個通過電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）檢測裝置，然后對每個細(xì)胞中各種金屬標(biāo)簽進(jìn)行檢測，形成原子質(zhì)量譜，再將測量的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面或內(nèi)部的信號分子數(shù)據(jù)，通過專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，從而達(dá)到對細(xì)胞表型和信號網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)觀測的目的[2,14-15]，見圖1（自繪）。

2 CyTOF的技術(shù)特點(diǎn)及優(yōu)勢

與流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM）相比，CyTOF主要有兩點(diǎn)不同：第一，抗體標(biāo)記系統(tǒng)不同。前者主要使用各種熒光素作為抗體標(biāo)志物，后者則使用各種金屬元素作為標(biāo)志物；第二，檢測系統(tǒng)不同。前者檢測系統(tǒng)為激光器和光電倍增管，而后者檢測系統(tǒng)為ICP-MS技術(shù)。因此CyTOF具有如下優(yōu)勢：（1）全新概念的金屬標(biāo)志物，理想的標(biāo)志物需要滿足4個條件：無放射性、生物樣品中含量低、易于標(biāo)記和檢測、種類多。金屬標(biāo)志物與細(xì)胞的非特異性結(jié)合極弱，在細(xì)胞中的含量極低，背景極低，不會影響細(xì)胞正常的生理功能，目前已發(fā)現(xiàn)的金屬元素種類有一百多種，用于抗體標(biāo)記的金屬元素有30多種，所以金屬元素是細(xì)胞標(biāo)志物的極佳選擇。（2）測量參數(shù)多，上百個獨(dú)立的檢測通道。質(zhì)譜流式細(xì)胞儀中的ICP-MS裝置具有非常寬的原子量檢測范圍（88～210 Da），可以同時檢測上百個不同的參數(shù)，使通道數(shù)量增加到上百個。（3）質(zhì)譜檢測的分辨率高，通道間無干擾，無需補(bǔ)償計算。（4）高靈敏度和高穩(wěn)定性。熒光流式細(xì)胞儀通道間靈敏度相差很大，CyTOF流式細(xì)胞儀各通道間靈敏度相差較小，且穩(wěn)定性高，不同時間對同一樣品檢測結(jié)果變異系數(shù)（coefficient of variation,CV）值<3%，結(jié)果具有很好的重復(fù)性。（5）多元化的數(shù)據(jù)分析方法，實(shí)現(xiàn)對樣品的深入分析，除了傳統(tǒng)的流式分析方法外，研究者可以根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的數(shù)據(jù)分析方法，常用的分析方法有：SPADE（spanning-tree progression analysis of density normalized events）、主成分分析（principal component analysis,PCA）、viSNE（visualization for high-dimensional single-cell data based on the t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE)algorithm）及Gemstone等[2,16]。

3 CyTOF在白血病治療中的應(yīng)用

隨著免疫學(xué)研究的發(fā)展，白血病個體化靶向治療已成為新的發(fā)展方向。CyTOF是一種新型單細(xì)胞分析技術(shù)，可以全面分析細(xì)胞表型和信號網(wǎng)絡(luò)。近年來，CyTOF在白血病治療研究中的應(yīng)用日益廣泛，為白血病精細(xì)化個體治療提供指導(dǎo)，CyTOF在白血病治療中的研究應(yīng)用及特點(diǎn)，見表1。

3.1 藥物作用機(jī)制的研究

圖1 CyTOF工作原理Figure 1 Working principle diagram of cytometry by time-offlight

表1 CyTOF在白血病中治療中的應(yīng)用及特點(diǎn)Table 1 Application and characteristics of CyTOF in treatment of leukemia

質(zhì)譜流式細(xì)胞儀的ICP-MS技術(shù)具有檢測背景低、干擾少、靈敏度高、動態(tài)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，可精確測定單細(xì)胞內(nèi)元素含量，用于藥物作用機(jī)制的研究。Zhou等[17]用CyTOF研究砷劑治療白血病的機(jī)制，砷劑可用于治療多種類型的白血病，對急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia,APL）療效顯著，可達(dá)到完全緩解，目前三氧化二砷（As2O3）治療APL的機(jī)制主要有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、抑制血管生成[18-20]，鑒于砷劑治療白血病取得了很好的效果，為進(jìn)一步探索砷劑治療白血病的機(jī)制及影響藥物作用的因素，研究者用CyTOF測定含砷藥物在單個白血病細(xì)胞不同細(xì)胞周期中的攝取量及細(xì)胞毒性作用，通過對比兩種含砷藥物（ATO和ZIO-101）在白血病細(xì)胞中跨細(xì)胞周期的攝取及細(xì)胞毒性作用，在單細(xì)胞水平上證實(shí)了含砷藥物的細(xì)胞周期依賴性攝取和細(xì)胞毒性作用，為進(jìn)一步研究細(xì)胞周期時相變化對抗癌藥物的影響提供了理論依據(jù)。

CyTOF可監(jiān)測藥物治療期間信號通路的變化，可從藥物影響信號通路變化方面研究抗白血病藥物的作用機(jī)制。阿帕替尼是一種新型血管內(nèi)皮生長因子-2受體（vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2）酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制VEGFR-2磷酸化，下調(diào)其下游胞外信號通路調(diào)節(jié)激酶的磷酸化水平，繼而抑制腫瘤血管生成達(dá)到抗腫瘤的目的[21]，為了解阿帕替尼抗白血病細(xì)胞毒作用的潛在機(jī)制，Deng等[22]用CyTOF在單細(xì)胞水平測量細(xì)胞內(nèi)信號通路，結(jié)果顯示，VEGFR-2下游多條信號通路受到阿帕替尼的抑制，包括PI3K（AKT，S6，4E-BP1）、MAPK（p38,MAPKAPK2,ERK1/2）和STAT3通路，表明阿帕替尼通過抑制VEGFR-2磷酸化及其下游信號通路誘導(dǎo)白血病細(xì)胞死亡，支持阿帕替尼在白血病治療中的潛在作用。Bandyopadhyay等[23]聯(lián)合使用伊馬替尼（imatinib,IM）和阿伐麥布（?；o酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（ACAT-1）抑制劑）治療IM耐藥的慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia,CML）患者，發(fā)現(xiàn)二者對IM耐藥的CML細(xì)胞在抑制細(xì)胞增殖方面有協(xié)同效應(yīng)，在正常細(xì)胞或IM敏感CML細(xì)胞中無協(xié)同效應(yīng)。用CyTOF分析其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)這種協(xié)同作用部分是由于阿伐麥布下調(diào)了MAPK通路，后者在IM耐藥的CML 中被激活，從而使CML細(xì)胞對IM治療敏感。通過對藥物作用機(jī)制及其作用靶點(diǎn)分析，可了解到在白血病治療中，可能需要靶向白血病增殖的多種驅(qū)動因子的治療才能獲得更深的治療應(yīng)答。

3.2 識別白血病治療的潛在靶點(diǎn)

CyTOF作為一種新型的單細(xì)胞分析工具，可以分析免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性，描述異質(zhì)微環(huán)境中復(fù)雜的細(xì)胞表型群體，表征信號通路，可用于潛在治療靶點(diǎn)的研究。Jiang等[24]利用CyTOF等技術(shù)研究了Wnt/β-catenin和FLT3聯(lián)合抑制在FLT3突變型AML中的抗白血病活性，發(fā)現(xiàn)阻斷Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對AML干細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，并與FLT3抑制有協(xié)同作用，這為臨床治療FLT3突變的AML提供了理論依據(jù) 。Edwards等[25]研究發(fā)現(xiàn)集落刺激因子1受體（CSF1R）不是在大多數(shù)白血病細(xì)胞上表達(dá)，而是在支持細(xì)胞亞群中表達(dá)，用CyTOF分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)CSF1R的細(xì)胞通過分泌肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）等細(xì)胞因子促進(jìn)白血病細(xì)胞生長，從而將CSF1R確定為AML的一種新的治療靶點(diǎn)，并提供了一種旁分泌細(xì)胞因子/生長因子信號通路的機(jī)制，CSF1R抑制劑通過阻斷支持細(xì)胞的旁分泌信號，在AML中表現(xiàn)出抗腫瘤活性。Carter等[26]利用CyTOF等技術(shù)的研究表明，黏著斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）調(diào)節(jié)白血病-基質(zhì)相互作用，并支持白血病細(xì)胞存活，抑制FAK可降低間質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的 AML細(xì)胞遷移和活性，并延長生存期，因此FAK是AML的一個潛在治療靶點(diǎn)。

Wierz等[11]用CyTOF分析慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia,CLL）腫瘤微環(huán)境表型復(fù)雜性，表明在CLL微環(huán)境中，大多數(shù)免疫細(xì)胞群上調(diào)PD1（programmed cell death protein 1）和LAG3（lymphocyte-activation gene 3），雙重PD1/LAG3阻斷有效地限制了CLL的發(fā)展，并恢復(fù)了免疫微環(huán)境活性，證明雙抗PD1/LAG3治療是一種可能對CLL患者有益的潛在組合，為白血病的治療提供了潛在靶點(diǎn)。Sarno等[27]用CyTOF分析高表達(dá)CRLF2（cytokine Receptor Like Factor 2）的B前體細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia,BCP-ALL）細(xì)胞，對TSLP/CRLF2信號通路進(jìn)行詳細(xì)的表征，觀察信號通路中的異質(zhì)細(xì)胞群，發(fā)現(xiàn)SRC/ABL抑制劑使TSLP下游的信號通路中斷，發(fā)現(xiàn)了新的靶向治療的關(guān)鍵點(diǎn)，為攜帶CRLF2突變的BCP-ALL患者提供了新的治療前景。隨著白血病潛在治療靶點(diǎn)的不斷發(fā)現(xiàn)，白血病的治療效果有望得到改善。

3.3 監(jiān)測治療效果

CyTOF可監(jiān)測治療期間的骨髓細(xì)胞類型及信號通路，Behbehani等[10]用CyTOF檢測FLT3-ITD+AML中的異常信號以及測量羥基脲治療的細(xì)胞周期效應(yīng)，從而監(jiān)測白血病患者對靶向治療和細(xì)胞毒性治療的反應(yīng)。由于CyTOF可以同時評估多種骨髓細(xì)胞類型，可用于監(jiān)測免疫治療方法(如嵌合抗原受體T細(xì)胞)的療效。CyTOF還可用于評估新型藥物的治療效果，Saenz等[28]用CyTOF監(jiān)測AML干/祖細(xì)胞對新型BET（bromodomain and extra terminal domain）抑制劑的治療反應(yīng)。利用CyTOF高維多參數(shù)單細(xì)胞分析技術(shù)的優(yōu)勢，Gullaksen等[29]用其監(jiān)測CML患者酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TKI）治療期間單個細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)變化，通過提供接近實(shí)時的癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)圖譜，揭示TKI調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與臨床應(yīng)答之間的關(guān)系。

3.4 白血病復(fù)發(fā)和耐藥機(jī)制的研究

CyTOF將單細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)與質(zhì)譜分析相結(jié)合，能在單細(xì)胞水平上了解白血病生物學(xué)的特點(diǎn)。該技術(shù)與先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析方法結(jié)合，能夠發(fā)現(xiàn)額外的表面和胞內(nèi)分子所致的AML的表型復(fù)雜性和多樣性，表征信號通路和代謝狀態(tài)，識別在白血病復(fù)發(fā)中起關(guān)鍵作用的白血病干細(xì)胞（leukemia stem cell,LSC），改善LSC的特性對于防止AML復(fù)發(fā)和提高AML治愈率至關(guān)重要。此外，CyTOF亦可識別治療后AML表型和細(xì)胞內(nèi)暫時或永久的改變，描述治療后存活的單個LSC的特征，確定導(dǎo)致AML耐藥機(jī)制發(fā)展的因素，從而發(fā)現(xiàn)AML耐藥的新治療方法[30]。白血病復(fù)發(fā)和耐藥是影響患者預(yù)后的主要因素，闡明白血病復(fù)發(fā)和耐藥機(jī)制是有效治療白血病的關(guān)鍵。

4 結(jié)語

CyTOF作為一種新型高維多參數(shù)的單細(xì)胞分析技術(shù)，可精確全面的分析細(xì)胞群免疫分型及細(xì)胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)。利用CyTOF高通量、多參數(shù)、高靈敏度及高穩(wěn)定性等檢測分析特點(diǎn)，該技術(shù)可用于白血病腫瘤微環(huán)境的研究，可在異質(zhì)微環(huán)境中描述免疫背景和復(fù)雜細(xì)胞表型，分析細(xì)胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)傳導(dǎo)，深入探究白血病發(fā)病機(jī)制，研究藥物作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)更多白血病治療的潛在新靶點(diǎn)，評估治療效果，闡述白血病復(fù)發(fā)和耐藥機(jī)制，有望為白血病的治療帶來新的進(jìn)展。未來白血病治療期望實(shí)現(xiàn)個體化、靶向治療，CyTOF作為一種新型單細(xì)胞分析技術(shù)出現(xiàn)，允許快速實(shí)施和應(yīng)用，可作為指導(dǎo)白血病個體化治療的一個重要工具。