綠葉蔬菜中活性成分對(duì)亞硝化反應(yīng)抑制作用的比較研究

盧 強(qiáng)

（新干縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江西 吉安 331399）

隨著人們生活水平的提高，越來(lái)越多的人認(rèn)識(shí)到健康飲食的重要性。良好合理的健康飲食是保證人體健康的關(guān)鍵。健康飲食的關(guān)鍵是平衡飲食，即適量攝入各種不同食物，也就是說(shuō)，我們不僅僅要吃魚、肉、蛋等高蛋白的食物，還應(yīng)該食用蔬菜之類的膳食纖維高的食物。膳食纖維是健康飲食不可缺少的，纖維在保持消化上起著非常重要的作用，攝取足夠的纖維也可以預(yù)防各種疾病，如心血管疾病、癌癥等。其實(shí)蔬菜中不僅含有豐富的膳食纖維，也含有許多活性成分，如還原糖、維生素C、多酚等。其中，還原糖主要成分是葡萄糖和果糖，是非常好的可再生糖質(zhì)資源[1]；多酚類物質(zhì)有防治腫瘤、冠心病和骨質(zhì)疏松的作用[2]；維生素C是維持人體正常生理功能的重要化合物，可以促進(jìn)人體膠原蛋白的合成及傷口愈合，降低毛細(xì)血管脆性，改善心肌功能，還具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力及防癌效果[3]，維生素C在體內(nèi)不能合成，主要從新鮮果蔬中攝取[4]。

N-亞硝基化合物是一種具有強(qiáng)致癌作用的化合物。在如今已研究的近300種N-亞硝基化合物中有90%的化合物具有致癌性[5-6]。亞硝酸鹽和胺類物質(zhì)廣泛存在于食物中或者在人體新陳代謝中產(chǎn)生[7]，在人體代謝過(guò)程中，尤其是在胃液中容易變成亞硝胺。所以清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成是一種有效預(yù)防癌癥的重要方法之一。本實(shí)驗(yàn)就是研究綠葉蔬菜中活性成分對(duì)清除亞硝酸鹽的作用效果以及對(duì)亞硝胺合成的阻斷效果。其中，綠葉蔬菜采用的是市場(chǎng)上普遍存在的蔬菜，如韭菜、芹菜、小白菜、菠菜。希望通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以為人們找到簡(jiǎn)單實(shí)用的預(yù)防癌癥的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：市場(chǎng)上的新鮮蔬菜，分別為芹菜、韭菜、小白菜、菠菜。

試劑：斐林甲液、斐林乙液、乙酸鋅溶液、亞鐵氰化鉀、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、抗壞血酸、2，6-二氯靛酚鈉鹽、2%草酸、白陶土、Folin-ciocalteu試劑、亞硝酸鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、對(duì)氨基泵磺酸、鹽酸萘乙二胺、二甲苯、α-萘胺、碳酸鈉。

主要儀器：

BS224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司

可調(diào)電爐：南通市長(zhǎng)江光學(xué)儀器有限公司

離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠

HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州賽普試驗(yàn)儀器廠

紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司

超聲提取機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司

移液器：Thermos

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠葉蔬菜中還原糖含量的測(cè)定——直接滴定法

（1）綠葉蔬菜汁的制備

用天平稱取約10g不同種類綠葉蔬菜，放入研磨缽中研磨充分后轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，加50ml水，搖勻后加入5ml乙酸鋅溶液，搖勻，加入5ml亞鐵氰化鉀溶液，加水定容，在超聲提取機(jī)下30min，用濾紙過(guò)濾，濾液作為樣液。

（2）測(cè)定原理

在加熱條件下，用次甲基藍(lán)作指示劑，滴定標(biāo)定過(guò)的斐林試劑，還原糖將溶液中的二價(jià)銅還原成氧化亞銅。以稍過(guò)量的還原糖使次甲基藍(lán)指示劑褪色作為終點(diǎn)。根據(jù)試樣溶液消耗體積，計(jì)算還原糖量。

（3）測(cè)定方法

吸取5.0ml斐林試劑及5.0ml乙液，置于150ml錐形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，加入樣液10ml，從滴定管滴加比預(yù)測(cè)體積少1ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液至錐形瓶中，使其在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸繼續(xù)以每?jī)擅?滴的速度滴定，直至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積，同法平行操作3份，得出平均消耗體積。

試樣中還原糖（以葡萄糖計(jì)）的含量為：

式中：還原糖（%）-每100g試樣中還原糖（以葡萄糖計(jì)）所含百分比；A-10ml斐林試劑（甲、乙液各5ml）相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量，mg；m-試樣質(zhì)量，g；V-測(cè)定時(shí)平均消耗試樣溶液體積，ml。

1.2.2 綠葉蔬菜中維生素C含量的測(cè)定——2，6-二氯靛酚法

（1）綠葉蔬菜汁的制備

稱取切碎的果蔬樣品10g，放在研缽中加2%草酸溶液少許研碎，注入100ml容量瓶中，加2%草酸溶液稀釋至刻度，過(guò)濾備用。如果濾液有顏色，在滴定時(shí)不易辨別終點(diǎn)，可先用白陶土脫色、過(guò)濾，或用離心機(jī)沉淀備用。

（2）測(cè)定原理

抗壞血酸有還原糖和脫氫型兩種，還原型抗壞血酸分子結(jié)構(gòu)中有烯醇（COH=COH）存在，故為一種極敏感的還原劑，它可失去兩原子氫而氧化為脫氫型抗壞血酸。染料2，6-二氯靛酚鈉鹽作為氧化劑，可以氧化抗壞血酸，而其體身亦被還原成無(wú)色的衍生物。

（3）測(cè)定方法

吸取濾液10ml于100ml三角瓶中，加水30ml，用已標(biāo)定過(guò)的2.6-二氯靛酚鈉鹽溶液滴定，至桃紅色15s不褪為止，記下染料的用量。吸取2%草酸溶液10ml，用染料作空白滴定記下用量。

計(jì)算公式：

式中：W-100g樣品含的抗壞血酸毫克數(shù)；V-滴定樣品所用的染料毫升數(shù)；V1-空白滴定所用的染料毫升數(shù)；A-1ml染料溶液相當(dāng)?shù)目箟难岷量藬?shù)；B-滴定時(shí)吸取的樣品溶液毫升數(shù)；b-樣品液稀釋后總毫升數(shù)；a-樣品的克數(shù)。

1.2.3 綠葉蔬菜中多酚含量的測(cè)定

（1）綠葉蔬菜汁的制備

稱取綠葉蔬菜約20g，弄碎放入馬弗爐中4h，待冷卻后研成粉狀，稱取1g于100ml容量瓶中，用乙醇水溶液定容，靜止，用濾紙過(guò)濾，濾液備用。

（2）測(cè)定原理

以沒食子酸為主的多酚類化合物在堿性溶液中可將鎢鉬酸還原成藍(lán)色化合物，該化合物在760nm處有最大吸收，且吸收值與多酚化合物含量成正比，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出樣品溶液的溶度，再計(jì)算多酚含量。

（3）測(cè)定方法

精密吸取4種樣品溶液0.5ml分別于50ml容量瓶中，加入25ml蒸餾水，精密吸取2.5ml Folin-ciocalteu試劑于容量瓶中，再精密加入7.5ml 20%的碳酸鈉溶液，搖勻后定容，于30℃反應(yīng)2h。以空白溶液為參比，在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定4種樣品溶液的吸光度。由吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品溶液的濃度C，按以下公式計(jì)算出樣品的多酚含量。

式中：C-吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品溶液的濃度，mg/ml；m-樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 綠葉蔬菜清除亞硝酸鹽的測(cè)定

（1）綠葉蔬菜汁的制備

稱取不同種類蔬菜10g，用液氮研磨充分后，裝入100ml容量瓶，用蒸餾水定容，用超聲提取機(jī)提取30min，放入冰箱過(guò)濾。

（2）測(cè)定方法

分別吸取各種濾液 0、1、2、3ml于 50ml的容量瓶中，加入pH3.0的0.5mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液2ml、5μg/ml的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5ml，然后加蒸餾水至10ml，加入0.4%的對(duì)氨基苯磺酸2.0ml，混勻，靜置3～5min，后各加入1.0ml的0.2%鹽酸萘乙二胺，加蒸餾水至50ml，混勻，靜置15min，在波長(zhǎng)538nm下測(cè)定吸光度。用亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程算出亞硝酸鈉的殘留量，計(jì)算清除率。

式中：No為空白管的亞硝酸鈉殘留量，μg/ml；N1為樣品管的亞硝酸鈉殘留量，μg/ml。

1.2.5 綠葉蔬菜模擬人體胃液條件下亞硝胺合成阻斷率的測(cè)定

分別吸取各種濾液1、2、3ml于25ml試管中，加入pH3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 10.0ml、1mol/l NaNO2溶液1.0ml、1mol/L的二甲胺溶液1.0ml，加入蒸餾水至25ml，在37℃下恒溫1h。用移液管吸取1.0ml上述溶液至25ml小燒杯中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% NaCO3溶液0.5ml，于紫外分析儀上（選用254nm波長(zhǎng)）照15min。取出后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%對(duì)氨基苯磺酸1.5ml，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%α-萘胺1.5ml、蒸餾水0.5ml，搖勻，靜置15min。在最大吸收波長(zhǎng)525nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算阻斷率。

式中：Ao為未加樣液時(shí)的吸光度（以緩沖液為參比溶液）；A1為加入樣液時(shí)的吸光度（以相同樣液為參比溶液）。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠葉蔬菜活性成分百分比

綠葉蔬菜活性成分百分比見圖1。可以從圖1看出芹菜、韭菜、小白菜、菠菜的還原糖含量、多酚含量、維生素C含量。其中，可見韭菜中還原糖含量最高達(dá)到12.17%，芹菜次之3.19%，小白菜和菠菜最少分別是2.74%和2.79%；多酚含量小白菜最高，其含量達(dá)4.14%，菠菜含量也達(dá)到3.44%，芹菜達(dá)到3%，最少的是韭菜2.57%；維生素C含量菠菜>小白菜>韭菜>芹菜，菠菜、小白菜、韭菜、芹菜含量分別為32.54%、28.18%、21%、12.21%。

圖1 綠葉蔬菜活性成分百分比

2.2 綠葉蔬菜汁清除亞硝酸鹽的測(cè)定

從表1可以看出，不同蔬菜汁對(duì)亞硝酸鹽的清除作用明顯不同，可見，芹菜汁和韭菜汁在實(shí)驗(yàn)的溶度范圍內(nèi)對(duì)亞硝酸鹽不具有清除作用（可能是因?yàn)槠渌驅(qū)е聦?duì)亞硝酸鹽的清除作用效果不明顯）。而小白菜和菠菜在溶度為0.1%時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的清除作用效果不明顯，在溶度為0.2%、0.3%的時(shí)候均對(duì)亞硝酸鹽具有清除作用，其中小白菜汁的清除作用會(huì)隨著溶度的升高而增大，在溶度為0.2%時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的清除率為1.43%，在溶度為0.3%時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的清除率為2.86%。菠菜汁在溶度為0.2%、0.3%時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的清除作用都為0.71%。因此，可以得出不同蔬菜種類對(duì)亞硝酸鹽的清除率顯著水平不明顯。

表1 4種蔬菜汁對(duì)亞硝酸鹽的清除作用的方差分析

2.3 綠葉蔬菜汁阻斷亞硝胺合成的阻斷率測(cè)定

從表2可以看出，不同蔬菜汁均對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用結(jié)果。其中菠菜汁對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用效果不明顯，而芹菜、韭菜、小白菜這三種蔬菜汁對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用效果較明顯。小白菜和芹菜這兩種蔬菜汁對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用效果隨著溶度的升高而阻斷率增大，小白菜汁在溶度為0.3%的時(shí)阻斷率最大，達(dá)到30%。從表2可以得出阻斷率顯著水平：小白菜>芹菜=韭菜>菠菜?？梢赃x擇小白菜、芹菜、韭菜三種蔬菜判斷蔬菜汁與亞硝胺合成的抑制作用的相關(guān)性；選擇效果最好的溶度0.3%。

表2 4種蔬菜汁對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用的方差分析

2.4 綠葉蔬菜中活性成分與清除率、阻斷率的相關(guān)性

2.4.1 綠葉蔬菜對(duì)亞硝酸鹽的清除作用效果

從以上數(shù)據(jù)可以得出，本次實(shí)驗(yàn)中的綠葉蔬菜芹菜、韭菜對(duì)亞硝酸鹽的清除作用沒有效果。從表1可以看出，不同蔬菜汁對(duì)亞硝酸鹽的清除作用明顯不同，可見，芹菜汁和韭菜汁在實(shí)驗(yàn)的溶度范圍內(nèi)對(duì)亞硝酸鹽不具有清除作用（可能是因?yàn)槠渌驅(qū)е聦?duì)亞硝酸鹽的清除作用效果不明顯），而小白菜汁和菠菜汁在溶度為0.1%時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的清除作用效果不明顯。小白菜汁和菠菜汁在溶度為0.2%、0.3%時(shí)均對(duì)亞硝酸鹽具有清除作用，其中小白菜汁的清除作用會(huì)隨著溶度的升高而增大，在溶度為0.2%時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的清除率為1.43%，在溶度為0.3%時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的清除率為2.86%。菠菜汁在溶度為0.2%、0.3%時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的清除作用都為0.71%。因此，判斷這4種蔬菜與清除作用沒有一定的顯著關(guān)系，也就是說(shuō)，不能判斷蔬菜中活性成分與清除率的相關(guān)性。

2.4.2 綠葉蔬菜對(duì)亞硝胺的阻斷作用效果

從圖1和表2可以得出，綠葉蔬菜都對(duì)亞硝胺的阻斷作用有效果。

（1）綠葉蔬菜中多酚含量與阻斷率的相關(guān)性

從圖1，表2可以看出，蔬菜中多酚含量與阻斷率有明顯的線性關(guān)系（菠菜的阻斷率可能受其他因素影響，在此無(wú)明顯線性關(guān)系），韭菜、芹菜、小白菜多酚含量分別為2.57%、3%、4.14%，而韭菜、芹菜、小白菜汁溶度在0.3%時(shí)阻斷率分別為13.33%、23.57%、30%，隨著蔬菜中多酚含量的增加，蔬菜汁對(duì)亞硝胺合成的抑制作用也明顯增強(qiáng)。因此，可以得出韭菜、芹菜、小白菜中多酚含量與溶度在0.3%時(shí)阻斷亞硝胺合成的阻斷作用線性關(guān)系是成正相關(guān)的。也就是說(shuō)，阻斷亞硝胺合成的阻斷作用會(huì)隨著多酚含量的增大而阻斷率提高，可以得出，吃多酚含量高的蔬菜可以預(yù)防癌癥，且多酚含量越高預(yù)防癌癥效果越明顯。

（2）綠葉蔬菜中還原糖含量與阻斷率的相關(guān)性

從圖1，表2可知，韭菜、芹菜、小白菜還原糖含量分別為12.17%、3.19%、2.74%，而韭菜、芹菜、小白菜汁溶度在0.3%時(shí)阻斷率分別為13.33%、23.57%、30%，隨著蔬菜中還原糖含量的減少，蔬菜汁對(duì)亞硝胺合成的抑制作用逐漸增強(qiáng)。因此，可以得出綠葉蔬菜中還原糖含量與亞硝胺合成的抑制作用有明顯的負(fù)相關(guān)性。阻斷亞硝胺合成的阻斷作用會(huì)隨著還原糖含量的減少而阻斷率升高，吃還原糖含量低的綠葉蔬菜可以預(yù)防癌癥且還原糖含量越低預(yù)防癌癥效果越明顯。

（3）綠葉蔬菜中維生素C含量與阻斷率的相關(guān)性

從圖1可以得出，小白菜、韭菜、芹菜維生素C含量分別為28.18%、21%、12.21%，從表2也可以得出小白菜、韭菜、芹菜汁溶度在0.3%時(shí)對(duì)亞硝胺合成作用的阻斷率分別為30%、13.33%、25.57%。小白菜維生素C含量最高，小白菜汁對(duì)亞硝胺合成作用的阻斷率也最大；韭菜維生素C含量第二高，但是韭菜汁對(duì)亞硝胺合成作用的阻斷率卻是最低的；芹菜維生素C含量最低，但芹菜汁對(duì)亞硝胺合成作用的阻斷率卻排第二。因此得出結(jié)論：蔬菜中維生素C成分對(duì)亞硝胺合成作用沒有相關(guān)性。也就是說(shuō)，蔬菜中維生素C含量的高低與預(yù)防癌癥效果的好壞沒有一定的關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了綠葉蔬菜的還原糖、多酚、維生素C以及綠葉蔬菜汁對(duì)亞硝酸鹽的清除作用和對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：綠葉蔬菜汁對(duì)亞硝酸鹽的清除率沒有明顯的相關(guān)性，而綠葉蔬菜中多酚含量和還原糖含量對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用有明顯的相關(guān)性，維生素C含量對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用沒有一定的相關(guān)性。其中，綠葉蔬菜對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用為：小白菜>芹菜=韭菜>菠菜，并且綠葉蔬菜中多酚含量對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用呈正相關(guān)；綠葉蔬菜中還原糖含量對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用呈負(fù)相關(guān)。因此，在生活當(dāng)中，我們應(yīng)該多食用多酚含量高、還原糖含量低的蔬菜，可以有效地阻斷亞硝酸鹽在人體中的沉積，達(dá)到身體健康的目的。