澤蘭不同部位UPLC 特征圖譜和酚酸類成分含量測定研究

李國衛(wèi)，何民友，周 密，索彩仙，梁 慧，吳文平，魏 梅

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

《中國藥典》2020 年版收載澤蘭為唇形科植物毛葉地瓜兒苗Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel的干燥地上部分，夏、秋二季莖葉茂盛時采割，曬干。具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀消癰、利水消腫的功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉、經(jīng)痛、產(chǎn)后瘀血腹痛、水腫[1]等癥。澤蘭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，歷代本草書籍皆有記載[2-3]，澤蘭主要生長在沼澤地、水邊、溝邊等潮濕處，亦見有栽培品，分布于黑龍江、河北、山西、河南、江蘇、江西、四川等地。澤蘭的化學(xué)成分包括酚酸類、黃酮類、萜類和甾體類等結(jié)構(gòu)類型化合物，其主要活性成分為酚酸和黃酮類化合物[4-7]?，F(xiàn)代研究表明澤蘭具有抗肝炎病毒、擴張血管及治療心血管疾病等藥理作用，其中有效成分咖啡酸、迷迭香酸有著抗菌消炎、抑制血小板聚集的作用[8-13]。傳統(tǒng)經(jīng)驗上常以葉的顏色、氣味、外觀性狀等劃分規(guī)格等級，因此，可依據(jù)不同藥用部位進(jìn)行質(zhì)量評價。

《中國藥典》2020 年版澤蘭藥材項下的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)僅限于薄層定性，有關(guān)特征圖譜或含量測定研究的文獻(xiàn)報道較少[14-19]，因此，本文建立澤蘭藥材特征圖譜以及酚酸類成分的含量測定方法，并圍繞不同產(chǎn)地澤蘭藥材及其莖、葉部位中含有活性成分的分布進(jìn)行分析評價，以期建立更加全面合理的中藥材質(zhì)量評價方法，為澤蘭藥材標(biāo)準(zhǔn)化種植、合理利用藥材資源及藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全面提升提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與材料

Waters H-Class 型超高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Agilent SB C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；ME204E型萬分之一天平，XP26型百萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 型超純水機（美國默克公司）；KQ500D 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

迷迭香酸對照品（含量：90.5%，批號：111871-201706）、咖啡酸對照品（含量：99.7%，批號：110885-201703）均為中國食品藥品檢定研究院提供；乙醇為分析純；磷酸、乙腈為色譜純；水為超純水。9 批澤蘭藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為唇形科植物毛葉地瓜兒苗Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel 的干燥地上部分，將每批藥材的莖、葉分開，備用，來源信息見表1。

表1 澤蘭藥材信息表Tab. 1 Lycopus lucidus medicine information table

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Agilent SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8μm）為色譜柱；以乙腈為流動相A，0.05%磷酸為流動相B，梯度洗脫（0 ～3 min，10%→13%A；3 ～9 min，13%A；9 ～10 min，13% →15%A；10 ～15 min，15% →20%A；15 ～24 min，20% →30% A；24 ～26 min，30%→90%A）；流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為330 nm；進(jìn)樣體積為1 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸對照品、迷迭香酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含咖啡酸6.256 μg、迷迭香酸80.473 μg 的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取澤蘭藥材粉末（過三號篩）適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）30 min，再稱定重量，補重，搖勻，濾過，即得。

2.4 特征圖譜的建立及評價

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以迷迭香酸色譜峰為參照峰（S），計算得各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD 值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取澤蘭藥材供試品（S3）共6份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣測定，以迷迭香酸色譜峰為參照峰（S），計算得各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD 值均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測定，以迷迭香酸色譜峰為參照峰（S），計算得各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD 值均小于3%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 特征圖譜分析與評價 （1） 共有峰的確定 取9 批澤蘭藥材（S1 ～ S9）及其對應(yīng)的莖（J1 ～ J9）、葉（Y1 ～ Y9），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用 《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》 （2012 版）分別對9 批澤蘭藥材、莖、葉特征圖譜進(jìn)行共有峰標(biāo)識，以S1 號圖譜作為參照圖譜，以“平均數(shù)”法作為對照圖譜生成方式，全譜峰匹配分別生成9 批澤蘭藥材、莖、葉的共有特征圖譜，共標(biāo)定了4 個共有峰，同時分別生成對照圖譜R1、R2、R3，結(jié)果見圖1 ～ 4。經(jīng)對照品指認(rèn)，確定峰1 為咖啡酸，峰3 為迷迭香酸，結(jié)果見圖4。因峰3 分離效果好、出峰穩(wěn)定，故選定為參照峰S。

（2） 相似度評價 分別以澤蘭藥材、莖、葉生成的共有模式（R1、R2、R3）為對照圖譜，9 批次澤蘭藥材與其對照圖譜的相似度均在0.90 以上，說明澤蘭藥材、莖、葉組內(nèi)具有較好的相似性，結(jié)果見表2。R1 與R2 的相似度為0.869，R1 與R3 的相似度為0.983，R2 與R3 的相似度為0.835，結(jié)果顯示，莖與藥材/葉之間的差異較大，而藥材與葉的相似度較高，樣品比較接近。

圖1 澤蘭藥材特征圖譜Fig. 1 Atlas of Lycopus lucidus medicinal herbs

圖2 澤蘭莖特征圖譜Fig. 2 Atlas of Lycopus lucidus stem

圖3 澤蘭葉特征圖譜Fig. 3 Lycopus lucidus leaf feature map

（3） 聚類分析 將9 批澤蘭藥材、9 批澤蘭莖、9 批澤蘭葉共有峰峰面積除以稱樣量后，運用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以平均Euclidean 距離為度量標(biāo)準(zhǔn)。27 個樣品被分為三類，I 類包括J1～J9，即澤蘭莖的9 批樣品聚為一類；Ⅱ 類包括S1、S2、S3、S4、S6、S7、S8、S9、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9，即澤蘭藥材的8 批樣品和澤蘭葉的5 批樣品聚為一類；Ⅲ類包括Y1、Y2、Y3、Y5、S5，即澤蘭葉的4 批樣品和澤蘭藥材的1批樣品聚為一類，結(jié)果見圖5。

圖4 對照品與供試品色譜圖Fig. 4 Chromatograms of reference and test products

表2 澤蘭UPLC 特征圖譜與對照圖譜（R1、R2、R3）相似度評價結(jié)果Tab. 2 Evaluation result of similarity between Lycopus lucidus UPLC feature map and control map (R1, R2, R3)

圖5 聚類分析結(jié)果Fig. 5 Cluster analysis results

（4） 主成分分析 將9 批澤蘭藥材、9 批澤蘭莖、9 批澤蘭葉共有峰峰面積相對于稱樣量量化后，用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行主成分分析，得出相關(guān)矩陣的特征值及其貢獻(xiàn)率，見表3。

表3 主成分特征值及貢獻(xiàn)率結(jié)果Tab. 3 Principal component characteristic values and contribution rate results

結(jié)果顯示，只有1 個主成分的特征值大于1，即3.087，其方差貢獻(xiàn)值達(dá)79.683%，故主成分1 可代表澤蘭特征圖譜共有峰的大部分信息。由表4 可知，第1 主成分主要反映了來自原始指標(biāo)色譜峰1、峰2、峰3、峰4 的信息。前3 名變量的權(quán)重值分別為0.923（峰1 咖啡酸）、0.893（峰2）、0.880（峰3 迷迭香酸），即可判定峰1、峰2、峰3 在區(qū)分澤蘭不同藥用部位特征圖譜占了決定性作用。針對第1 個主成分對澤蘭藥材、莖、葉進(jìn)行評價，計算得分，結(jié)果見表5。排名前9 的樣品中，葉有6 批，藥材有3 批（S3、S4、S5：河南省南陽市）；排名倒數(shù)9 名的均為澤蘭莖的樣品?？傮w來說，同一產(chǎn)地澤蘭葉品質(zhì)最優(yōu)，藥材居中，莖最差，且莖與葉、藥材差異明顯；河南省南陽市產(chǎn)地的澤蘭藥材樣品綜合得分排名較靠前，說明河南省南陽市產(chǎn)地的澤蘭藥材整體品質(zhì)較優(yōu)。

表4 主要因子載荷矩陣表Tab. 4 Main factor load matrix table

表5 綜合得分排序表Tab. 5 Comprehensive score ranking table

2.5 含量測定方法與評價

2.5.1 線性試驗 精密稱取咖啡酸對照品適量，置于50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL 含30.005 μg 的儲備液；精密稱取迷迭香酸對照品適量，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL 含1 011.464 μg 的儲備液。分別精密量取咖啡酸儲備液、迷迭香酸儲備液0.1、0.5、1.0、2、5 mL 于10 mL 容量瓶中，精密加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，注入液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），對照品濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，計算各成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）、線性范圍，見表6，結(jié)果顯示咖啡酸、迷迭香酸的線性關(guān)系良好。

表6 咖啡酸、迷迭香酸線性關(guān)系考察結(jié)果Tab. 6 Investigation results of linear relationship between caffeic acid and rosmarinic acid

2.5.2 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定咖啡酸峰面積、迷迭香酸峰面積的RSD值均小于3%，表明精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜方法分別于0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測定，咖啡酸峰面積、迷迭香酸峰面積的RSD 值均小于3%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取澤蘭藥材供試品（S3）共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)行測定，計算得咖啡酸、迷迭香酸含量RSD 值均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗 取已測質(zhì)量分?jǐn)?shù)澤蘭藥材（S3）約0.25 g，精密稱定分為三組，每組平行3 份。分別按0.5 ∶1、1 ∶1、1.5 ∶1 加入對照品，按照“2.3”項下制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果咖啡酸的平均加樣回收率為97.63%（RSD = 0.68%，n = 9），迷迭香酸的平均加樣回收率為99.31%（RSD = 1.52%，n = 9），見表7，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.6 含量測定結(jié)果 取27 個澤蘭樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣測定，計算咖啡酸、迷迭香酸含量，結(jié)果見表8。由表可知，同一產(chǎn)地澤蘭中咖啡酸、迷迭香酸含量均為：葉＞藥材＞莖；不同產(chǎn)地澤蘭樣品中的咖啡酸含量波動相對較穩(wěn)定（RSD 范圍為5.81% ～ 14.02%），而迷迭香酸含量波動較大（RSD范圍為28.42% ～ 45.19%），說明不同產(chǎn)地澤蘭咖啡酸、迷迭香酸含量具有一定的差異性，但迷迭香酸含量差異更顯著；按澤蘭藥材咖啡酸和迷迭香酸總含量來看，以河南省南陽市產(chǎn)地的澤蘭藥材含量較高且穩(wěn)定，其次是河南省駐馬店市，江蘇淮安、宿遷兩產(chǎn)地含量均較低。

表7 加樣回收試驗結(jié)果Tab. 7 Recovery test result

表8 澤蘭不同部位含量測定結(jié)果Tab. 8 Determination results of different parts of Lycopus lucidus

3 討論

3.1 分析方法的優(yōu)化

本研究分別對流動相體系、檢測波長、提取溶媒、提取方式、提取時間等條件進(jìn)行了考察，最終選取效果最好的乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相，330 nm 為檢測波長，70%乙醇超聲提取30 min 作為澤蘭的供試品溶液制備方法。

3.2 特征圖譜結(jié)果的分析

本研究采用UPLC 法，建立了澤蘭特征圖譜方法，該方法簡便、快捷和準(zhǔn)確。9 批澤蘭藥材及其莖、葉特征圖譜共確定了4 個共有峰，指認(rèn)了其中的峰1為咖啡酸，峰3 為迷迭香酸；相似度、聚類分析、主成分分析結(jié)果一致，表明澤蘭不同藥用部位具有一定的差異性，莖與葉/藥材相似度較低，差異較大，能明顯區(qū)分出來即單獨聚為一類；而葉與藥材相似度良好，即葉分布較散，部分樣品與藥材聚在一起，由得分散點圖可知，得分較低的葉樣品與藥材得分差不多，可判定不同產(chǎn)地澤蘭葉的品質(zhì)差異較大，品質(zhì)較差的葉與藥材難以區(qū)分出來。

3.3 含量測定結(jié)果的分析

2020 年版《中國藥典》中“澤蘭”項下未收載含量測定指標(biāo)，本研究主成分分析結(jié)果顯示，前3 名變量的權(quán)重值分別為0.923（峰1 咖啡酸）、0.893（峰2）、0.880（峰3 迷迭香酸），即可判定峰1、峰2、峰3 在區(qū)分澤蘭不同藥用部位中占決定性作用，因峰1、峰3 已指認(rèn)出成分，且咖啡酸和迷迭香酸為澤蘭活性成分[9-11]，故本研究以咖啡酸、迷迭香酸為含量測定指標(biāo)，對27 個澤蘭樣品進(jìn)行研究。由結(jié)果可知，同一澤蘭樣品中咖啡酸、迷迭香酸含量為葉＞藥材＞莖，與《中國藥典》規(guī)定“夏、秋二季莖葉茂盛時采割”一致，推測澤蘭活性成分主要富集于葉中。因此，為確保臨床療效，建議保持藥材的完整性，采收過程中盡量避免葉片的掉落與損失。不同產(chǎn)地澤蘭咖啡酸、迷迭香酸含量存在一定的差異，其中迷迭香酸含量差異顯著；整體來說，以河南省產(chǎn)地的澤蘭藥材總含量較高且穩(wěn)定，江蘇產(chǎn)地總含量較低。

4 結(jié)論

本研究建立了不同產(chǎn)地以及不同部位澤蘭UPLC特征圖譜，并同時測定澤蘭不同部位中酚酸類成分（咖啡酸、迷迭香酸）的含量， 該方法簡單、穩(wěn)定、可靠，重復(fù)性好，可為澤蘭藥材的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。綜合分析，以河南省產(chǎn)地的澤蘭藥材總含量較高且穩(wěn)定，江蘇產(chǎn)地總含量較低。 建立不同產(chǎn)地以及不同部位澤蘭UPLC 特征圖譜，并同時測定澤蘭不同部位中酚酸類成分（咖啡酸、迷迭香酸）的含量，為澤蘭藥材的質(zhì)量控制及評價提供參考。