響應(yīng)曲面法優(yōu)化枳殼中柚皮苷與新橙皮苷的提取工藝及抗氧化研究

徐坤勇，郭建忠，顏 娟，韻國萍*

（1.張家口市第一醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 張家口 075000）

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，味苦、辛、酸，性微寒，歸脾、胃經(jīng)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，枳殼具有行滯消脹、理氣寬中的功效，可用于治療胃下垂、子宮脫垂、痰飲內(nèi)停、脹滿疼痛、胸肋氣滯、食積不化等癥[1]。現(xiàn)代研究證明新橙皮苷和柚皮苷為枳殼中黃酮類成分的主要組成部分，是枳殼行滯祛痰和平喘理氣的主要藥理成分，具有抗腫瘤、抗過敏、抗菌、抗炎、抗微生物、抗基因突變、保護(hù)受損心肌、誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡等多種藥理作用，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[2-5]。目前對(duì)枳殼提取工藝的研究，主要有煎煮法、乙醇回流提取法、超聲提取法等[6-8]，這些方法各有優(yōu)劣。響應(yīng)曲面法能準(zhǔn)確表達(dá)考察指標(biāo)與單因素之間的關(guān)系，可快速得出多因素影響的最佳工藝條件[9]。為了綜合考察各種因素對(duì)枳殼提取工藝的影響，進(jìn)而更好地控制枳殼提取物的質(zhì)量，本研究以柚皮苷、新橙皮苷含量和收膏率的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，對(duì)上述方法進(jìn)行優(yōu)選，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)選枳殼提取工藝，并研究其抗氧化活性，以期為該藥材開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；752 型紫外可見分光光度計(jì)（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；ME204E 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）。

1.2 藥品與試劑

枳殼樣品購自張家口市張?jiān)兴庯嬈邢薰?，?jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所杜茂波博士鑒定符合2020 年版《中國藥典》質(zhì)量規(guī)定。柚皮苷對(duì)照品（純度≥98%，重慶對(duì)照品科技有限公司，批號(hào)：110722-201312），新橙皮苷對(duì)照品（純度≥97%，西安旭煌技術(shù)有限公司，批號(hào)：N-19020）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma-Aldrich，批號(hào)：C10088334）；2, 2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，美國Sigma-Aldrich，批號(hào)：C10076253）；甲醇、乙腈為色譜純，其它試劑為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 柚皮苷、新橙皮苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 參考《中國藥典》（2020 年版），Hypersil C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；波長：283 nm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水（18 ∶82）（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3）；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：

1.0 mL/min。見圖1。

2.1.2 柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品溶液 分別取柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品40.01 mg、40.00 mg，精密稱定，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解，補(bǔ)充甲醇至刻度，搖晃混勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。使用時(shí)，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，制成柚皮苷和新橙皮苷質(zhì)量濃度均為160 μg/mL的對(duì)照品溶液，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 柚皮苷及新橙皮苷HPLC Fig. 1 HPLC of naringin and neohesperidin

2.1.3 供試品溶液 取枳殼粗粉約0.2 g，精密稱定，不同因素條件提取，提取液放冷后濾過，蒸發(fā)皿中蒸干，適量甲醇溶解并洗滌干凈后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，超聲，加甲醇至刻度，搖晃混勻，作為供試品儲(chǔ)備液。使用時(shí)，移取儲(chǔ)備液2 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，取500 μL 續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液 按“2.1.3”項(xiàng)下方法，分別制備不同因素提取條件下不含枳殼的溶液，即得。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取柚皮苷、新橙皮苷質(zhì)量濃度均為800 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，甲醇稀釋，分別制成質(zhì)量濃度為10、40、80、120、150、200 μg/mL 的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。柚皮苷為Y = 4.56×103X+3.34×104， r = 0.999 5，在10 ～200 μg/mL 范圍呈良好線性關(guān)系；新橙皮苷為Y = 5.78×103X + 4.63×104，r = 0.999 6，在10 ～ 200 μg/mL 范圍呈良好線性關(guān)系。

2.1.6 精密度考察 分別精密量取柚皮苷、新橙皮苷混合對(duì)照品溶液各10 μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各色譜峰面積，柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD 分別為0.51%和0.67%。結(jié)果表明，方法精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密量取“2.1.3”項(xiàng)下同一供試品溶液10 μL，分別于0、1、4、8、16、24 h按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD 分別為1.01%和0.87%。說明供試品溶液在制備24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批枳殼粗粉6 份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果柚皮苷、新橙皮苷的平均含量分別為7.38%、4.23%，RSD 分別為0.89%、1.11%。說明該方法的重復(fù)性良好。

(3)信息沒辦法保證真實(shí)。整個(gè)供應(yīng)鏈金融中的交易信息有可能被篡改，交易中的信息后期無法保證真實(shí)。即使是根據(jù)貿(mào)易結(jié)果產(chǎn)生的應(yīng)收、應(yīng)付數(shù)據(jù)，也有造假的可能。因?yàn)樾畔⒉粚?duì)稱帶來損失，銀行后期回款帶來壓力。

2.1.9 回收率考察 取已進(jìn)行含量測(cè)定的枳殼（含柚皮苷約為7.36%、新橙皮苷約為4.25%）粗粉6 份，每份約0.2 g，精密稱定。分別加入柚皮苷、新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品約14.72 mg、8.50 mg，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果見表1。柚皮苷、新橙皮苷的平均回收率分別為97.99%、97.73%，RSD 分別為2.15%、1.84%，說明該方法有較好的準(zhǔn)確性。

表1 加樣回收率試驗(yàn)（n = 6）Tab. 1 Result of recovery test（n = 6）

2.2 收膏率測(cè)定

參照《中國藥典》（2020 年版）“浸出物測(cè)定法”項(xiàng)下方法測(cè)定。精密量取“2.1.3”項(xiàng)下供試品儲(chǔ)備液20 mL，置于預(yù)先干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘箱干燥3 h 后取出，再置于干燥器中冷卻至常溫，立即稱重，計(jì)算收膏率。

計(jì)算公式：

其中，W1為浸膏質(zhì)量，g；W2為藥物總質(zhì)量，g。

2.3 枳殼提取工藝單因素考察

2.3.1 提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的建立 以柚皮苷、新橙皮苷含量和收膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算綜合得分（Y），通過綜合評(píng)分法優(yōu)選枳殼的提取工藝，其中柚皮苷、新橙皮苷含量為主要指標(biāo)，分別賦予50%、30%的權(quán)重；在實(shí)際生產(chǎn)中，收膏率常作為提取工藝控制指標(biāo)之一，賦予20%的權(quán)重，得到最終評(píng)價(jià)指標(biāo)[10]。公式如下：

2.3.2 提取方法考察 （1）煎煮法 取枳殼粗粉約2 g，精密稱定，加20 mL 水，煎煮2 h，提取3 次，提取液按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理后定容于1 000 mL容量瓶中。測(cè)定柚皮苷、新橙皮苷含量和收膏率，并計(jì)算綜合得分，平行3 份，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。結(jié)果見表2。

（2）乙醇回流提取法 取枳殼粗粉約2 g，精密稱定，加20 mL 95%乙醇回流提取2 h，提取3 次，其余同煎煮法。見表2。

（3）超聲提取法 取枳殼粗粉約2 g，精密稱定，加20 mL 95%乙醇超聲（400 W）提取2 h，提取3 次，其余同煎煮法。見表2。

表2 提取方法試驗(yàn)結(jié)果（±s，n = 3）Tab. 2 Result of extraction method test（±s，n = 3）

表2 提取方法試驗(yàn)結(jié)果（±s，n = 3）Tab. 2 Result of extraction method test（±s，n = 3）

注：與煎煮法比較，*P ＜0.05。

收膏率/%提取方法 柚皮苷含量/%新橙皮苷含量/%綜合得分/%煎煮法 7.37±0.15 4.36±0.08 29.02±0.46 98.14±1.47乙醇回流提取法 7.48±0.19 4.44±0.11 27.46±0.51* 98.33±1.54超聲提取法 7.57±0.24 4.42±0.13 27.41±0.48* 98.75±1.32 F 2.560 2.641 1.089 0.806 P 0.288 0.533 0.014 0.621

2.3.3 液料比的考察 取枳殼粗粉約2 g，精密稱定，水煎煮2 h，提取3 次，考察液料比分別為4 ∶1、8 ∶1、12 ∶1、16 ∶1、20 ∶1 時(shí)綜合得分，平行3 份。結(jié)果見圖2。當(dāng)液料比增加時(shí)，綜合得分先增大后減小，在液料比16 ∶1 時(shí)，綜合得分最高，故選擇液料比因素的中心點(diǎn)為16 ∶1。

圖2 液料比對(duì)綜合得分的影響Fig. 2 Effects of liquid-solid ratio on comprehensive score

2.3.4 提取時(shí)間的考察 取枳殼粗粉約2 g，精密稱定，加20 mL 水，提取3 次，考察提取時(shí)間分別為0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 h 時(shí)綜合得分，平行3 份。結(jié)果見圖3。當(dāng)提取時(shí)間增加時(shí)，綜合得分先增大后減少，當(dāng)提取時(shí)間為2 h 時(shí)，綜合得分最高，故選擇提取時(shí)間因素的中心點(diǎn)為2 h。

2.3.5 提取次數(shù)的考察 取枳殼粗粉約2 g，精密稱定，加20 mL 水，煎煮2 h，考察提取次數(shù)分別為1、2、3、4 次時(shí)綜合得分，平行3 份。結(jié)果見圖4。當(dāng)提取次數(shù)為4 次時(shí)，綜合得分最高，提取次數(shù)為3 次時(shí)綜合得分略低于4 次，考慮提取效率和生產(chǎn)成本，選擇提取次數(shù)因素的中心點(diǎn)為3 次。

圖3 提取時(shí)間對(duì)綜合得分的影響Fig. 3 Effects of extraction time on comprehensive score

圖4 提取次數(shù)對(duì)綜合得分的影響Fig. 4 Effects of extraction times on comprehensive score

2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化枳殼提取工藝

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析模型，在單因素考察的基礎(chǔ)上，以液料比（A）、提取時(shí)間（B）及提取次數(shù)（C）為3 個(gè)因素。因素水平見表3。枳殼提取評(píng)價(jià)綜合得分（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)Box-Behnken 分析模型試驗(yàn)組，優(yōu)選提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Tab. 3 Box-Behnken response surface test factor level

2.4.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn) 將表4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行回歸分析。液料比（A）、提取時(shí)間（B）以及提取次數(shù)（C）對(duì)枳殼提取評(píng)價(jià)綜合得分（Y）的二次多項(xiàng)回歸模型為Y = 86.26 + 14.98 A + 0.95 B - 2.40 C + 0.53 AB-3.68 AC + 0.53 BC - 19.83 A2- 4.52 B2- 2.79 C2，對(duì)所得模型進(jìn)行方差分析，考察其顯著性。見表5。結(jié)果可知，模型P ＜0.001，表明所得模型具有極顯著性；失擬項(xiàng)P = 0.104＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著；模型R2= 0.987 8，表明擬合程度好，試驗(yàn)方法可靠，該模型可用于枳殼提取工藝條件的預(yù)測(cè)和分析。由回歸模型各項(xiàng)P 值可知，一次項(xiàng)A 因素對(duì)綜合得分有極顯著性影響，C因素對(duì)綜合得分有顯著性影響，B 因素影響不顯著；交互項(xiàng)AC 因素對(duì)綜合得分有顯著性影響，AB、BC因素影響不顯著；二次項(xiàng)A2、B2因素對(duì)綜合得分有極顯著性影響，C2因素影響不顯著。由回歸模型單因素F 值可看出，A 因素對(duì)綜合得分影響最大，C 因素次之，B 因素最小。結(jié)合回歸模型各因素P 值和F值可知，以綜合得分為響應(yīng)值時(shí)，各因素影響順序?yàn)锳 ＞C ＞B。

表4 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 4 Design and results of Box-Behnken test

表5 響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果Tab. 5 ANOVA for response surface quadratic model

2.4.3 響應(yīng)面分析 通過 Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸模型進(jìn)行分析，可得到反映各因素交互作用水平的二維等高線平面圖及3D 曲面圖。見圖5 ～7。各因素交互作用水平可通過二維等高線平面圖中等高線形狀和3D 曲面圖中曲面坡度進(jìn)行分析，當(dāng)?shù)雀呔€密集且呈橢圓形，表明交互作用強(qiáng)；當(dāng)3D曲面圖坡度大，陡峭時(shí)，說明影響顯著[11]。由圖6直觀分析可知，等高線密集且呈橢圓形，3D 響應(yīng)曲面陡峭，坡度較大，說明A 因素C 因素交互作用強(qiáng)，且影響顯著。由圖7 直觀分析可知，等高線基本呈圓形而非橢圓形，且3D 響應(yīng)曲面坡度平緩，說明B 因素和C 因素交互作用弱，且影響不顯著。結(jié)果與方差分析一致。

圖5 液料比與提取時(shí)間對(duì)綜合得分影響的響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface diagram of the effect of liquid-to-material ratio and extraction time on comprehensive score

圖6 液料比與提取次數(shù)對(duì)綜合得分影響的響應(yīng)面圖Fig. 6 Response surface diagram of the effect of liquid-to-material ratio and extraction times on comprehensive score

圖7 提取時(shí)間與提取次數(shù)對(duì)綜合得分影響的響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surface diagram of the effect of extraction time and number of extractions on comprehensive score

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過 Design Expert 8.0.6 軟件分析結(jié)果可知，當(dāng)綜合得分為最大值時(shí)，枳殼提取的工藝參數(shù)：液料比為18.05 ∶1，提取時(shí)間為1.79 h，提取次數(shù)為2.17 次，在此條件下，綜合得分的預(yù)測(cè)值為88.00%。為便于實(shí)際生產(chǎn)操作，調(diào)整枳殼提取工藝參數(shù)為液料比18 ∶1，提取時(shí)間為105 min，提取次數(shù)為2 次。稱取枳殼2 g，上述條件進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，驗(yàn)證模型的合理性和工藝的可靠性。結(jié)果RSD 為0.65%，表明模型合理且工藝可靠。見表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab. 6 Results of verification test

2.5 體外抗氧化活性研究

2.5.1 清除DPPH 自由基 取最優(yōu)提取條件下不同質(zhì)量濃度（柚皮苷與新橙皮苷總濃度）樣品溶液各2 mL，分別加入到具塞試管中，加0.15 mmol/L DPPH溶液2 mL，振搖混勻。避光靜置反應(yīng)30 min，空白對(duì)照為95%乙醇，在波長517 nm 處測(cè)定其吸光度為A樣品；95%乙醇與不同質(zhì)量濃度柚皮苷、新橙皮苷溶液各2 mL 的混合液，測(cè)定其吸光度為A空白；95%乙醇與DPPH 溶液各2 mL 的混合液，測(cè)定其吸光度為A對(duì)照

[12]。平行三次，陽性對(duì)照為維生素C，計(jì)算清除率。

清除率（%）=［1-（A樣品-A空白）/A對(duì)照］×100%

以清除率為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，計(jì)算對(duì)DPPH 清除率達(dá)到50%時(shí)的效應(yīng)濃度IC50值。隨著樣品溶液質(zhì)量濃度升高，清除率逐漸增大，但整體低于維生素C 清除率。枳殼提取液IC50值為29.54 mg/mL，表明枳殼提取液對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力。結(jié)果見圖8。

圖8 DPPH 自由基清除率Fig. 8 DPPH free radical clearance rate

2.5.2 清除ABTS+自由基 參考文獻(xiàn)[13]報(bào)道，取7 mmol/L 的ABTS 溶液和2.45 mmol/L 的K2S2O8溶液各5 mL 制備ABTS+使用液。取最優(yōu)提取條件下不同質(zhì)量濃度（柚皮苷與新橙皮苷總濃度）樣品溶液各0.4 mL，分別加入到具塞試管中，加ABTS+使用液3 mL，振搖混勻。室溫（25 ℃）避光靜置反應(yīng)30 min，空白對(duì)照為95%乙醇，在波長732 nm 處測(cè)定其吸光度為A樣品；以95%乙醇代替ABTS+使用液扣除樣品溶液的本底吸收，測(cè)定的吸光度為A空白；用相同體積的95%乙醇代替樣品溶液作為對(duì)照，測(cè)定其吸光度為A對(duì)照。平行三次，陽性對(duì)照為維生素C，計(jì)算清除率。

清除率（%）=［1-（A樣品-A空白）/A對(duì)照］×100%

以清除率為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，計(jì)算IC50值。在樣品濃度低于20 μg/mL時(shí)，枳殼提取液DPPH 清除率高于維生素C 清除率，枳殼提取液IC50值為22.54 μg/mL，表明枳殼提取液對(duì)ABTS+自由基的清除能力較強(qiáng)。結(jié)果見圖9。

3 討論

在中藥新劑型研制過程中，提取工藝可直接影響中藥提取效果，進(jìn)而影響藥物的療效。為了使藥效組分提取更充分，故選用多指標(biāo)對(duì)枳殼提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。枳殼藥效成分主要為黃酮類物質(zhì)，其中新橙皮苷和柚皮苷為含量比較高的兩種成分，是枳殼的主要活性物質(zhì)，也是《中國藥典》（2020 年版）藥材枳殼質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)下的指標(biāo)成分；另外收膏率為評(píng)價(jià)中藥提取工藝的重要指標(biāo)之一[14]，故本研究以柚皮苷、新橙皮苷含量和收膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)枳殼提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

圖9 ABTS+自由基清除率Fig. 9 ABTS+ free radical clearance rate

優(yōu)化中藥提取工藝多因素參數(shù)時(shí)，響應(yīng)值與各影響因素之間往往不具備線性關(guān)系。響應(yīng)曲面法能通過考察各影響因素的交互作用，建立非線性回歸模型，擬合最佳提取工藝，是一種應(yīng)用廣泛且預(yù)測(cè)性好、精度高的統(tǒng)計(jì)方法，近年來在優(yōu)化中藥提取工藝中得到廣泛應(yīng)用[15-17]。單因素的取值范圍對(duì)響應(yīng)曲面法擬合結(jié)果有較大影響，本研究首先通過單因素考察試驗(yàn)確定枳殼提取方法為煎煮法，后通過單因素對(duì)綜合得分影響的考察試驗(yàn)，確定各因素的取值范圍和中心點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化枳殼提取工藝。得到極顯著的二次多項(xiàng)回歸模型，擬合度好，可用于預(yù)測(cè)枳殼提取柚皮苷和新橙皮苷含量。目前用于測(cè)定抗氧化活性的方法較多，本研究前期設(shè)計(jì)了鐵離子還原力及鄰苯三酚法抗氧化試驗(yàn)，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鐵離子還原法程序繁雜、操作不便；鄰苯三酚法重現(xiàn)性差，故最終選擇清除DPPH 自由基和清除ABTS+自由基法測(cè)定抗氧化活性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過響應(yīng)曲面法優(yōu)選的最佳提取工藝條件：液料比為18 ∶1，提取時(shí)間為105 min，提取次數(shù)為2 次，在該條件下，綜合得分為87.73%，與預(yù)測(cè)值接近。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選工藝重復(fù)性好，可行性強(qiáng)。體外抗氧化活性研究結(jié)果表明，枳殼柚皮苷、新橙皮苷提取液對(duì)DPPH 自由基和ABTS+自由基均有一定的清除能力。