多肽C16/Ang1聯(lián)合胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)視神經(jīng)脊髓炎大鼠的保護(hù)作用*

蔣進(jìn)展， 付笑笑， 韓 曙， 王文倩， 丁明星， 陳浩浩△

（1金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江金華321000；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與細(xì)胞生物系，浙江杭州310058）

視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是一種視神經(jīng)與脊髓同時(shí)受累的脫髓鞘病變，主要特征為導(dǎo)致失明的視神經(jīng)炎，伴發(fā)脊髓炎和腦內(nèi)炎癥病灶所引起的癱瘓，是神經(jīng)系統(tǒng)高致殘疾病之一［1-2］。NMO 的主要發(fā)病機(jī)理［3-4］是血清中的NMO-IgG 特異性地結(jié)合和攻擊位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突上的水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4），破壞了血腦屏障的完整性，使得淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞受到血管外趨化因子的影響逸出，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞依賴的細(xì)胞毒性反應(yīng)，進(jìn)一步惡化炎癥微環(huán)境，從而導(dǎo)致神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的大量死亡。

對(duì)于NMO 的治療，目前沒(méi)有特別有效的方法，急性期主要使用大劑量激素沖擊療法和血漿置換療法［5］。國(guó)內(nèi)外在治療NMO 的探索中，曾經(jīng)嘗試移植的干細(xì)胞治療目前包括人臍血干細(xì)胞和自體的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，并且顯示了一定的治療效果［6-7］。已有報(bào)道［8-9］證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞可以表達(dá)并分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，保護(hù)受損的神經(jīng)元和誘導(dǎo)神經(jīng)纖維再生。多肽C16（KAFDITYVRLKF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞所附著的基底膜上的重要基質(zhì)分子層粘蛋白r1 鏈上的多肽，具有識(shí)別并與整合素特異性結(jié)合的作用，可以競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間受體與配體的識(shí)別［10-11］。同時(shí)，在我們既往的研究［12］顯示，促血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低中樞神經(jīng)局部血管通透性，抑制T 淋巴細(xì)胞逸出等效應(yīng)，在與C16 聯(lián)合使用時(shí)可產(chǎn)生一定的協(xié)同作用，能進(jìn)一步促進(jìn)損傷后的功能恢復(fù)。本研究通過(guò)構(gòu)建NMO 大鼠模型，在側(cè)腦室及蛛網(wǎng)膜下隙移植胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（placental-derived mesenchymal stem cells，PDMSCs），同時(shí)以尾靜脈注射C16/Ang1，從神經(jīng)行為學(xué)、病理組織學(xué)和分子生物學(xué)等多方位評(píng)價(jià)治療效果，為NMO 治療提供參考資料。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Lewis 大鼠75 只，8～10 周齡，250～270 g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（浙）2012-0178。PDMSCs由孕18d大鼠的胎盤中分離提?。?3］，本實(shí)驗(yàn)室保存，已連續(xù)傳5代以上。

2 主要試劑

DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶EDTA 等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；本實(shí)驗(yàn)用到的抗體均購(gòu)自Abcam；多肽C16 及Ang1 由上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?；ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D Systems；SABC-HRP Kit 購(gòu)自上海碧云天公司；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 NMO 動(dòng)物模型的制備及分組干預(yù) 戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉，將APQ4 抗體（0.2 g/L）與人補(bǔ)體C5蛋白（5 g/L）各50 μL混合，參照本研究組以往的方法［14］，通過(guò)腦立體定位儀對(duì)大鼠進(jìn)行腦室（AP-0.7 mm；ML-1.7 mm；depth-5 mm）和脊髓蛛網(wǎng)膜下隙（L4～L5）滲透性微泵注射（Alzet 1003D，1 μL/h），持續(xù)3 d，NMO模型構(gòu)建完成。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組，每組15 只，分別為正常對(duì)照組（normal 組）、NMO模 型 組（NMO 組）、NMO 模 型+PDMSCs 移 植 組（PDMSCs 組）、NMO 模型組+C16/Ang1 干預(yù)組（C16/Ang1 組）及NMO 模型+PDMSCs 移植+C16/Ang1 干預(yù)組（C16/Ang1+PDMSCs 組）。在NMO 模型構(gòu)建完成后，PDMSCs組和C16/Ang1+PDMSCs組的動(dòng)物經(jīng)微泵注射移植PDMSCs，移植前2 h，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，終濃度為1×1012/L，側(cè)腦室內(nèi)注射2 μL，脊髓蛛網(wǎng)膜下隙注射4 μL。在NMO 模型構(gòu)建完成后1 d，C16/Ang1 組和C16/Ang1+PDMSCs 組的動(dòng)物每日進(jìn)行1 mL C16/Ang1混合物（含2 mg C16和400 μg Ang1）尾靜脈注射給藥，而其他組僅注射等體積生理鹽水，持續(xù)2周。

3.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 NMO模型構(gòu)建完成后，每天評(píng)估治療大鼠的疾病嚴(yán)重程度，采用癥狀與評(píng)分量表［15］，即：0 分，正常；1 分，尾巴張力降低；2 分，跛尾，扶正受損；3 分，扶正消失；4 分，步態(tài)共濟(jì)失調(diào)；5 分，后肢輕度癱瘓；6 分，后肢中度癱瘓；7 分，嚴(yán)重的癱瘓；8分，四肢癱瘓；9分，垂死；10分，死亡。

3.3 免疫組化 建模后第3和8周，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，每組3 只，并用冷生理鹽水心內(nèi)灌注，然后4%多聚甲醛灌注，取脊髓L4～L5 節(jié)段組織，外固定24 h，置于含30%蔗糖的PBS中直至組織沉到容器的底部，行20 μm 冰凍切片，抗體封閉液37℃封閉30 min，加兔抗CD45 抗體（1∶200）于4℃過(guò)夜，之后參照SABC-HRP Kit with Anti-Rabbit IgG進(jìn)行后續(xù)步驟。

3.4 Nissl 染色 冰凍切片烘烤30 min，100%乙醇3 min，95%乙醇3 min，70%乙醇3 min，超純水清洗3 次，0.1%焦油紫（pH 3.0）于37℃染色5 min，超純水洗滌3 次，70%乙醇60 s，95%乙醇60 s，100%乙醇60 s，分色液（同比例的乙醇+乙醚+氯仿）中分色20 s，100%乙醇5 min×3 次，二甲苯5 min×3 次，中性樹(shù)脂封片，隨機(jī)選擇5 張切片（每張切片3 個(gè)視野，200倍）用于計(jì)數(shù)。

3.5 免疫熒光雙標(biāo) 抗體封閉液37℃封閉30 min，分別加兔抗神經(jīng)絲蛋白200（neurofilament 200，NF200）抗體（1∶500）和小鼠抗髓磷脂堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗體（1∶200），在4℃過(guò)夜，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 和TRITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 于37℃孵育1 h，抗淬滅封片劑封片，隨機(jī)選擇每個(gè)樣本5 個(gè)橫切面（每個(gè)切片的3 個(gè)視野，200倍），進(jìn)行脫髓鞘及軸索缺失評(píng)分，切片中紅色顯示髓鞘較為完整，綠色顯示軸索較為完好。脫髓鞘評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［16］如下：1 分，極少量的脫髓鞘；2 分，部分區(qū)域脫髓鞘；3 分，血管周圍融合成片狀或軟脊膜下脫髓鞘；4 分，大量血管周圍或軟脊膜下脫髓鞘；5分，廣泛性血管周圍或軟脊膜下脫髓鞘。軸索缺失評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［17］如下：1 分，少量表面軸索缺失，少于25%組織；2 分，大量軸索缺失，超過(guò)25%的組織；3分，擴(kuò)散和廣泛軸索缺失。

3.6 Evans blue 染色 在建模后第3 周，麻醉大鼠，每組3 只，并在37℃用Evans blue（2%溶于0.9%生理鹽水中，4 mL/kg）經(jīng)右股靜脈輸注5 min，2 h 后，用300 mL 生理鹽水灌注血管以洗掉剩余的染料，取脊髓L4～L5節(jié)段組織，進(jìn)行冰凍切片，20 μm厚；熒光顯微鏡觀察，在540 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下含滲出物的組織被染成紅色。

3.7 血清ELISA 檢測(cè) 在建模后第3 周及第8 周，麻醉大鼠，每組6 只，眼眶采血1 mL，通過(guò)ELISA 檢測(cè)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-8、IL-10 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

3.8 脊髓組織Western blot 檢測(cè) 采血后的大鼠，每組3只，迅速斷頭，取脊髓L4～L5節(jié)段組織，蛋白裂解液，冰上研磨，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取等量蛋白，加5×上樣緩沖液沸水浴變性5 min；12%SDSPAGE 分離，80 V 30 min，120 V 100 min；冰盒轉(zhuǎn)膜，200 mA 60 min；5% BSA 室溫封閉60 min；兔抗cas?pase-3（1∶500）、兔抗GFAP（1∶200）、兔抗AQP4（1∶500）和兔抗tubulin（1∶1 000）于4℃孵育過(guò)夜；TBST洗3 次，每次10 min；HRP 標(biāo)記山羊抗兔（1∶5 000）37℃孵育1 h；TBST 洗3 次，每次10 min；ECL A 液B液5 min，顯影液3 min，定影液3 min，拍照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，對(duì)數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布和方差齊性的兩組間數(shù)據(jù)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組間數(shù)據(jù)分析采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 C16/Ang1+PDMSCs 干預(yù)降低NMO 大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

各組大鼠NMO 癥狀在第3 天開(kāi)始出現(xiàn)，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯示NMO組在第2周左右達(dá)到高峰（7.33±0.65），而PDMSCs 組（評(píng)分為6.75±0.45）、C16/Ang組（評(píng)分為6.67±0.49）及C16/Ang1+PDMSCs 組（評(píng)分為5.50±0.67）在第3 周左右達(dá)到高峰，隨后各組均逐漸下降。C16/Ang1+PDMSCs 組評(píng)分自第5 周始顯著低于NMO 組（P＜0.05），并且在第5、7 和8 周時(shí)，顯著低于PDMSCs 組（P＜0.05），在第5 和7 周時(shí)，評(píng)分顯著低于C16/Ang1組（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2 C16/Ang1+PDMSCs 干預(yù)減少炎癥細(xì)胞的實(shí)質(zhì)浸潤(rùn)和脊髓神經(jīng)元丟失

在NMO 組中，建模后3周，脊髓組織都出現(xiàn)大量的CD45+炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)“血管周袖套”現(xiàn)象，PDMSCs 組和C16/Ang1 組中也出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，而C16/Ang1+PDMSCs 組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，小血管完整性較好（圖2）。

Nissl 染色顯示，建模后8 周，在NMO 組中，脊髓神經(jīng)元出現(xiàn)了大量的丟失，經(jīng)過(guò)神經(jīng)元計(jì)數(shù)顯示，PDMSCs 組及C16/Ang1+PDMSCs 組神經(jīng)元數(shù)量顯著高于NMO組和C16/Ang1組（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 1. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected the neurobehavioral score of NMO rats. Mean±SD. n=15. *P＜0.05 vs NMO group；#P＜0.05 vs PDMSCs group；△P＜0.05 vs C16/Ang1 group.圖1 C16/Ang1+PDMSCs干預(yù)對(duì)NMO大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響

Figure 2. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected CD45+inflammatory cell infiltration in spinal cord tissue of NMO rats. A：nor?mal group；B：NMO group；C：PDMSCs group；D：C16/Ang1 group；E：C16/Ang1+PDMSCs group. The red arrows indi?cated inflammatory cell infiltration. The scale bar=100 μm.圖2 C16/Ang1+PDMSCs干預(yù)對(duì)NMO大鼠脊髓組織CD45+炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

Figure 3. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected the neuron numbers in rat spinal cord 8 weeks after modeling. A：normal group；B：NMO group；C：PDMSCs group；D：C16/Ang1group；E：C16/Ang1+PDMSCs group. The white arrows indi?cated Nissl staining-positive neurons. Scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs NMO group；△P＜0.05 vs PDMSCs group；▲P＜0.05 vs C16/Ang1 group.圖3 C16/Ang1+PDMSCs干預(yù)對(duì)建模后8周大鼠脊髓神經(jīng)元數(shù)量的影響

3 C16/Ang1+PDMSCs 干預(yù)改善脊髓脫髓鞘、軸索缺失及血管通透性

NMO 組中脊髓出現(xiàn)大量的MBP（紅色）脫失現(xiàn)象，NF-200（綠色）在疾病后期也出現(xiàn)減少（圖4）。軸索缺失評(píng)分顯示，建模后8 周，C16/Ang1+PDMSCs組顯著低于好于NMO 組及C16/Ang1 組（P＜0.05）；脫髓鞘評(píng)分顯示，C16/Ang1+PDMSCs 組的顯著低于NMO 組、C16/Ang1 組及PDMSCs 組（P＜0.05），見(jiàn)圖4。Evans blue 染色顯示，NMO 組中出現(xiàn)大量紅色標(biāo)記，而C16/Ang1+PDMSCs組紅色標(biāo)記減少（圖5）。

4 C16/Ang1+PDMSCs 干 預(yù) 促 進(jìn) 脊 髓GFAP 和APQ4的表達(dá)，并下調(diào)caspase-3

Figure 4. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected axonal loss and demyelination in rat spinal cord. Double immunofluorescence staining images of the transverse sections through the anterior horn of the lumbar spinal cord showing the distribution of myelin basic protein（MBP，red）and neurofilament 200（NF200，green）. A：normal group；B：NMO group；C：PDMSCs group；D：C16/Ang1group；E：C16/Ang1+PDMSCs group. Scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs NMO group；△P＜0.05 vs PDMSCs group；#P＜0.05 vs C16/Ang1 group.圖4 C16/Ang1+PDMSCs干預(yù)對(duì)大鼠脊髓組織軸索缺失和脫髓鞘的影響

Figure 5. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected the vascular permeability in rat spinal cord tissue. A：normal group；B：NMO group；C：PDMSCs group；D：C16/Ang1 group；E：C16/Ang1+PDMSCs group. The blue arrows indicated Evans blue staining of the spinal cord（red）. The scale bar=100 μm.圖5 C16/Ang1+PDMSCs干預(yù)對(duì)大鼠脊髓組織血管通透性的影響

Western blot 結(jié)果顯示，在建模后第3 周及第8周，與normal 組相比，NMO 組脊髓組織caspase-3 表達(dá)顯著增加，GFAP 和APQ4 表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與NMO 組相比，C16/Ang1+PDMSCs 組在第3周及第8周APQ4表達(dá)顯著升高（P＜0.05），caspase-3表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與PDMSCs 組及C16/Ang1組相比，C16/Ang1+PDMSCs 組在第3 周APQ4 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），caspase-3 表達(dá)顯著下降（P＜0.05），在第8 周GFAP 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

5 C16/Ang1+PDMSCs 干 預(yù) 下 調(diào)IL-1β、IL-8 和TNF-α，并上調(diào)IL-10

血清ELISA 檢測(cè)顯示，與NMO 組相比，C16/Ang1組及C16/Ang1+PDMSCs組促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.05），抗炎細(xì)胞因子IL-10 則顯著升高（P＜0.05）；與PDMSCs 組相比，C16/Ang1+PDMSCs 組IL-1β、IL-8 和TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），IL-10 水平在第3 周顯著升高（P＜0.05）；與C16/Ang1組比較，C16/Ang1+PDMSCs組在第8周出現(xiàn)IL-1β及IL-10顯著降低（圖7）。

討 論

NMO 患者主要表現(xiàn)為視力急劇下降甚至失明，雙側(cè)下肢癱瘓及感覺(jué)障礙［2］。病理檢測(cè)鏡下可見(jiàn)脊髓腫脹軟化部位病變累及脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)，軸索和神經(jīng)細(xì)胞丟失，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管增生，血管周圍淋巴細(xì)胞袖套樣浸潤(rùn)，另可見(jiàn)散在或融合成片的脫髓鞘改變，上行及下行神經(jīng)纖維束Wallerian變性［18］。在本研究中，我們通過(guò)腦室及蛛網(wǎng)膜下腔注射APQ4 抗體與人補(bǔ)體C5 蛋白誘導(dǎo)了NMO 動(dòng)物模型，該模型再現(xiàn)了NMO 病理學(xué)的特征和癥狀，這與其他研究結(jié)果基本一致［1，3］。

Figure 6. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected GFAP，APQ4 and caspase-3 expression levels in rat spinal cord（detected by Western blot）. A：3 weeks；B：8 weeks. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs NMO group；△P＜0.05 vs PDMSCs group；▲P＜0.05 vs C16/Ang1 group.圖6 C16/Ang1+PDMSCs干預(yù)對(duì)大鼠脊髓中GFAP、APQ4和caspase-3表達(dá)水平的影響

Figure 7. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected the levels of IL-1β，IL-8，TNF-α and IL-10 in rat serum（detected by ELI?SA）. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs NMO group；△P＜0.05 vs PDMSCs group；▲P＜0.05 vs C16/Ang1 group.圖7 C16/Ang1+PDMSCs干預(yù)對(duì)大鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α及IL-10水平的影響

NMO-IgG 通過(guò)血腦屏障，遇到星形膠質(zhì)細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞依賴的細(xì)胞毒性反應(yīng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞足突被NMO-IgG和補(bǔ)體降解，繼而活化巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，一起產(chǎn)生細(xì)胞因子、氧自由基等造成血管和腦實(shí)質(zhì)損傷，最終導(dǎo)致包括軸索和少突膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的白質(zhì)和灰質(zhì)的損傷［19］?？寡庄煼梢员Ｗo(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，緩解神經(jīng)癥狀［20］，另外修復(fù)血管完整性和促進(jìn)血管生成可以潛在地減少NMO-IgG介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷和AQP4 損失［21］。間充質(zhì)干細(xì)胞在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能［22-23］，可抑制機(jī)體亢進(jìn)的免疫反應(yīng)，使機(jī)體免疫功能恢復(fù)平衡。以往研究顯示，C16/Ang-1具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制T 淋巴細(xì)胞血管外逸出和組織內(nèi)浸潤(rùn)的效應(yīng)，其中C16 與整合素結(jié)合后激活A(yù)ng1/Tie2-PI3K/Akt 的上游通路，使得內(nèi)皮細(xì)胞得以存活，促進(jìn)了血管生成［12，24］。在本研究中，我們將C16/Ang1與PDMSCs聯(lián)合對(duì)NMO模型動(dòng)物進(jìn)行了干預(yù)治療，結(jié)果顯示，動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分峰值延后，8周時(shí)的評(píng)分高于其他幾組，提示其對(duì)改善NMO 疾病進(jìn)程有一定的效果。在C16/Ang1+PDMSCs 干預(yù)后3周及8 周，我們進(jìn)行了組織學(xué)的檢測(cè)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)較少，而NMO 組能見(jiàn)到明顯的“血管周袖套”現(xiàn)象，此外，C16/Ang1+PDMSCs組動(dòng)物脊髓組織脫髓鞘、軸索缺失及血管通透性增加等現(xiàn)象得到改善。

血腦屏障的破壞是NMO 進(jìn)展的標(biāo)志［25］。有回顧性研究表明NMO 患者入院時(shí)血腦屏障通透性越高，其肢體殘疾發(fā)生的程度越高［26］，循環(huán)炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1 和IL-8 與血腦屏障分解有關(guān)，血管通透性的增加促進(jìn)了NMO-IgG抗體進(jìn)入中樞神經(jīng)組織中［3，18］。有學(xué)者通過(guò)給NMO 患者靜脈注射自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取得了一定的療效，其可能通過(guò)調(diào)低Thf細(xì)胞及其因子IL-6 和IL-21 從而起到神經(jīng)保護(hù)作用［27］。在本研究中，建模后3 周，與PDMSCs 組相比，C16/Ang1 組及C16/Ang1+PDMSCs 組血清中促炎因子IL-1β、IL-8 和TNF-α 相對(duì)于都顯著降低，IL-10則顯著升高，這提示炎癥細(xì)胞因子的變化可能與C16/Ang1 的作用有更密切的關(guān)聯(lián)，另外還可能是本研究是將細(xì)胞注射移植進(jìn)入動(dòng)物的腦室和蛛網(wǎng)膜下隙內(nèi)。

由于NMO?IgG 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的破壞作用，其特異性標(biāo)記物GFAP會(huì)在病變部位大量脫失，本研究中，通過(guò)Western blot對(duì)脊髓組織的GFAP 和APQ4的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，建模后3 周時(shí)，3 組干預(yù)組GFAP 和APQ4 的水平未見(jiàn)明顯變化，8 周C16/Ang1+PDMSCs組顯著高于其他2 組。同時(shí)，caspase-3 的表達(dá)水平在建模后3 周時(shí)，C16/Ang1+PDMSCs 組顯著低于其他2組，這提示，PDMSCs與C16/Ang1聯(lián)合治療，可以一定程度促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的恢復(fù)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，我們還對(duì)建模后8 周脊髓組織進(jìn)行了Nissl 染色觀察并計(jì)數(shù)神經(jīng)元的數(shù)量，結(jié)果顯示，NMO 模型大鼠的脊髓神經(jīng)元出現(xiàn)了大量的丟失，而PDMSCs 組及C16/Ang1+PDMSCs 組中這一現(xiàn)象皆出現(xiàn)改善，并且這兩組神經(jīng)元數(shù)量都顯著高于C16/Ang1 組，提示神經(jīng)元數(shù)量的差異跟PDMSCs 移植有密切的關(guān)系。我們推測(cè)，PDMSCs 通過(guò)分泌營(yíng)養(yǎng)因子，可減少內(nèi)源性細(xì)胞凋亡［28］，另外C16/Ang1 能促進(jìn)血管生成，兩者之間可能存在一定的協(xié)同效應(yīng)，從而促進(jìn)了NMO動(dòng)物的恢復(fù)。

綜上所述，C16/Ang1 與PDMSCs 移植進(jìn)行聯(lián)合治療NMO 時(shí)，能夠有效改善NMO 的疾病進(jìn)程，其主要通過(guò)抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及內(nèi)源性細(xì)胞凋亡，從而改善局部微環(huán)境，加速神經(jīng)功能的恢復(fù)，此外兩者之間還可能有一定的協(xié)同作用，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入探索，為今后的藥物轉(zhuǎn)化和治療提供參考。