2型糖尿病大鼠心室肌細(xì)胞離子通道功能和表達變化*

劉沛明， 鄭丹琳， 張 利， 周夢園， 練飛鴻， 鄺素娟，楊 慧， 饒 芳， 鄧春玉1，△

［華南理工大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院，2生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006；3廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）醫(yī)學(xué)研究部臨床藥理重點實驗室，廣東廣州510080］

近年來糖尿病的患病率不斷增加，影響全球超過4.4 億人，中國約有1.1 億糖尿病患者，是目前世界上糖尿病患者最多的國家，其中以2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2D）為主［1］。T2D 是一種由胰島素抵抗和由胰島素相對缺乏引起的以肥胖、高血糖和高血脂為特征的代謝紊亂綜合征，占所有類型糖尿病的90%以上，且其患病率在全球范圍內(nèi)迅速上升［2］。

糖尿病心血管疾病的并發(fā)癥與其死亡率密切相關(guān)。越來越多的研究表明，糖尿病可增加心律失常相關(guān)疾病的發(fā)生，包括房性和室性心律失常、QT 間期延長［3］和心源性猝死［4］等。糖尿病還可通過影響心臟的傳導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)心律失常，包括心房顫動、束支傳導(dǎo)阻滯［5］、緩慢性或快速心律失常和房室傳導(dǎo)阻滯［6-7］等。在糖尿病患者中，長QT 綜合征、頻發(fā)室性早搏和左室肥厚伴舒張功能障礙等異常情況顯著增加［8］。糖尿病和心律失常之間的關(guān)系是復(fù)雜的，受到多因素的影響。有研究表明1 型糖尿病可影響一系列離子通道電流，包括L 型鈣電流（L-type calcium channel current，ICa-L）［9］和瞬時外向鉀電流（transient outward potassium current，Ito）［10］。但目前2 型糖尿病在此方面的研究報道不多，本研究以2 型糖尿病大鼠為模型，探討其心肌細(xì)胞中Ito和ICa-L及相關(guān)蛋白表達水平的改變。

材料和方法

1 實驗動物

SPF 級7 周齡雄性Zucker diabetic fatty（ZDF）大鼠和Zucker lean（ZL）大鼠各8 只購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動物中心，恒溫（22±2）℃，恒濕（55±5）%，人工光照每天明暗各12 h，噪聲＜50 dB，24 h 自由取食和飲水。本研究所有動物實驗已通過廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）的動物實驗倫理審查（No.GDREC201208A）。

2 試劑與儀器

抗β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）抗體（Aviva Systems Biology）；抗心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體（Abcam）；抗GAPDH 抗體、抗Cav1.2 抗體和抗Kv4.3 抗體（Cell Signaling Technology）；4× SDS 上樣緩沖液、脫脂奶粉和Loading Buffer（Bio-Rad）；RIPA 細(xì)胞裂解液和PVDF膜（Millipore）；DMEM 培養(yǎng)液和胎牛血清（Gib?co）；磷酸 緩 沖鹽溶 液（phosphate-buffered saline，PBS；武漢博士德公司）。Langendorff 恒流灌流裝置、MultiClamp 700B 放大器、Digidata 1440A 數(shù)模轉(zhuǎn)換器和pCLAMP 10.2 數(shù)據(jù)采集分析軟件（Axon）；P-97 拉制儀（Sutter Insrument Company）。

3 實驗溶液

動作電位細(xì)胞外液包含（mmol/L）：145 NaCl，4 KCl，1 MgCl2，1.8 CaCl2，10 HEPES，使用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.4；電極內(nèi)液包含（mmol/L）：120 aspartic acid，25 KCl，1 MgCl2，10 EGTA，2 sodium phospho?creatine，4 Na2ATP，2 Na2GTP，5 HEPES，使用KOH調(diào)節(jié)pH至7.2。

記錄Ito時，細(xì)胞外液包含（mmol/L）：140 NaCl，4 KCl，1 MgCl2，10 HEPES，2 CaCl2，10 glucose，0.5 CdCl2，使用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.4；電極內(nèi)液包含（mmol/L）：90 mg/L potassium aspartate，20 KCl，10 HEPES，1 MgCl2，5 Na2ATP，5 EGTA，使用KOH 調(diào)節(jié)pH至7.2。

記錄ICa-L時，細(xì)胞外液成份為（mmol/L）：140 TEA-Cl，5 CaCl2，2 MgCl2，10 HEPES，10 glucose，使用CsOH 調(diào)節(jié)pH 至7.4；電極內(nèi)液使用高Cs+溶液（mmol/L）：100 CsCl，20 TEA-Cl，5 Na2ATP，0.4 Na2GTP，10 EGTA，10 HEPES，使用Tris 將pH 調(diào)至7.2。

KB 液成份為（mmol/L）：50 potassium glutamate，20 KOH，40 KCl，20 KH2PO4，20 taurine，10 glucose·H2O，3 MgCl2·6H2O，0.5 EGTA，10 HEPES，20 KOH，使用NaOH 將pH調(diào)至7.4。分裝至50 mL離心管，-80℃冰箱保存。

4 主要方法

4.1 T2D 動物模型的建立 將實驗動物分為對照組（ZL組）和模型組（ZDF組），ZL組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，ZDF 組大鼠給予Purina 5008 飼料（蛋白質(zhì)23.75%、總脂肪7.55%、粗纖維4.00% 和消化能14.6 kJ/kg）喂養(yǎng)。飼養(yǎng)1周后，使用羅氏血糖檢測試紙和血糖儀，通過尾靜脈采血法定期對兩組大鼠進行血糖的測量，并利用電子天平測量大鼠的體重。之后分別在第8、10、13 和17 周進行血糖和體重的測量。

4.2 Western blot 實驗檢測相關(guān)蛋白的表達 采用頸椎脫臼法處死大鼠，剪開胸腔并用PBS 溶液清洗心臟后，留取心室肌組織，儲存于-80℃冰箱中。提取蛋白時從冰箱取出心室肌組織，剪取綠豆大小的心肌組織放進冰上已加入300 μL 4℃的RIPA Lysis Buffer（含1%Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅲ）的EP管中，使用剪刀在EP 管中剪碎組織，用UP200S 超聲粉碎儀在冰上對組織進行超聲粉碎30 s，后把EP 管置于離心機中，4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液置于另一EP 管中。用BCA 法于多功能酶標(biāo)儀中測定蛋白濃度。用RIPA 調(diào)至蛋白濃度相等，加入Loading Buffer 后變性10 min。SDS-PAGE 分離蛋白、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST 洗膜3 次，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜；TBST洗膜3次后根據(jù)Ⅰ抗來源選擇合適Ⅱ抗，以1∶1 000 的比例稀釋于5%脫脂奶粉中常溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次。用ECL 試劑盒顯影蛋白條帶，用ImageJ 圖像分析軟件分析目的蛋白及內(nèi)參照蛋白的吸光度，并算出比值進行比較。

4.3 心肌細(xì)胞麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色和細(xì)胞表面積的計算 采用頸椎脫臼法處死大鼠，取心室組織后用PBS 沖洗，4%甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋切片。室溫下用PBS 孵育水化后滴加胰酶工作液50 μL，在37℃濕盒孵育15 min，PBS 漂洗終止消化，滴加WGA-AF488 工作液（1∶100稀釋），避光孵育2 h，PBS 漂洗，并用封固劑封片，光學(xué)顯微鏡下拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件以400 倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，選取合適的視野，測量視野內(nèi)組織的面積及細(xì)胞核的總數(shù)，得出單個細(xì)胞面積，單個細(xì)胞面積（μm2）=組織面積（μm2）/細(xì)胞核總數(shù)。

4.4 大鼠心室肌細(xì)胞的全細(xì)胞膜片鉗實驗 約200～250 g 大鼠用頸椎脫臼法處死，迅速開胸取出心臟，行主動脈逆行插管，Langendorff恒流灌流裝置對離體心臟進行灌流，采用酶解法分離大鼠單個心室肌細(xì)胞。37℃預(yù)溫灌流液（2.75 g MEM 培養(yǎng)基溶于250 mL 蒸餾水中，加NaOH 使pH 調(diào)至7.35）和含酶消化液（40 mL 灌流液+0.04 g 牛血清白蛋白+0.02 g膠原酶）。先用灌流液灌流心臟約5 min，然后改用消化液灌流約40～50 min，直到組織結(jié)構(gòu)疏松，滴出的液體成拉絲狀，剪取左心室部分組織，置于KB 液中剪碎，毛細(xì)吸管輕柔吹打至細(xì)胞分散，室溫靜置10 min，去上清，用KB 液洗2 遍，再用KB 液重懸，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用MultiClamp 700B 放大器的全細(xì)胞膜片鉗（Axon Instruments）記錄單個心室肌細(xì)胞的相關(guān)指標(biāo)。顯微鏡下選取橫紋清晰、貼壁良好的單個心肌細(xì)胞，使用三維操縱器使電極進入細(xì)胞外液，測試電極電阻為2～5 MΩ 為合格，可繼續(xù)用于實驗。電極接觸細(xì)胞后，輕吸細(xì)胞膜形成GΩ封接破膜。電流幅度穩(wěn)定后進行補償，按照參數(shù)設(shè)置分別記錄各電流。使用Digidata 1440A 數(shù)模轉(zhuǎn)換器和pCLAMP 10.2 數(shù)據(jù)采集分析軟件，用MultiClamp 700B 放大器記錄電流信號并存儲在計算機的硬盤上。GraphPad Prism 8用于分析離子通道電流密度及復(fù)活曲線、失活曲線和動作電位時程（action potential duration，APD）曲線擬 合，計算復(fù) 極50% 和90% 電 位時 程（APD50和APD90）。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS Statistic 25 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，用GraphPad Prism 8 將統(tǒng)計結(jié)果繪制成圖。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 糖尿病大鼠模型的建立

將7周齡ZL和ZDF大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，ZDF大鼠改為Purina 5008 飼料喂養(yǎng)。10 周齡后，ZDF 組大鼠血糖和體重均顯著高于ZL 組（P＜0.01），見圖1A、B。與ZL 組相比，ZDF 組大鼠左心室收縮末期容積［（171.08±23.41）μL vs（92.25±5.43）μL］、舒張 末 期 容 積［（383.30±39.87）μL vs（281.42±13.79）μL］、收縮末期內(nèi)徑［（5.78±0.34）mm vs（4.78±0.12）mm］和舒張末期內(nèi)徑［（8.32±0.38）mm vs（7.29±0.16）mm］均顯著減?。≒＜0.05），提示糖尿病大鼠心臟功能受損。

2 糖尿病大鼠心肌細(xì)胞肥大相關(guān)蛋白的檢測

利用Western blot 技術(shù)檢測ZL 組及ZDF 組大鼠心室肌細(xì)胞肥大相關(guān)蛋白β-MHC 和ANP 的變化，結(jié)果顯示，與ZL 組相比，ZDF 組大鼠心肌細(xì)胞中β-MHC 和ANP 表達均顯著升高（P＜0.05），見圖1C。WGA 染色顯示，心室肌細(xì)胞表面積顯著增加（P＜0.01），見圖1D。

3 糖尿病大鼠心室肌細(xì)胞APD的變化

Figure 1. Changes of blood glucose（A），body weight（B），and β-MHC and ANP protein expression in the ventricular myocytes（C），and the WGA staining results of the myocardial cells（D，×400）in ZDF rats. Mean±SEM. n=8. *P＜0.05，**P＜0.01 vs ZL group.圖1 ZDF大鼠血糖、體重、心室肌細(xì)胞β-MHC和ANP蛋白的表達變化及心肌細(xì)胞的WGA染色結(jié)果

與ZL組相比，ZDF組大鼠心室肌細(xì)胞APD顯著延長，APD50和APD90均顯著增加［（9.91±1.60）ms vs（67.74±10.58）ms，（39.95±3.19）ms vs（133.53±17.37）ms，P＜0.01］，見圖2。

4 糖尿病大鼠心室肌細(xì)胞Ito及心室組織Kv4.3 蛋白表達的變化

糖尿病大鼠心室肌細(xì)胞Ito密度顯著低于對照組。10 mV 時，ZL 組和ZDF 組大鼠Ito分別為（4.18±0.36）pA/pF 和（2.25±0.20）pA/pF（P＜0.01）；50 mV 時 分別 為（11.02±0.74）pA/pF 和（6.71±0.52）pA/pF（P＜0.01）；60 mV 時分別為（12.43±0.86）pA/pF和（7.48±0.58）pA/pF（P＜0.01），見圖3A。

Ito的激活、失活及復(fù)活動力學(xué)均無顯著差異。如圖3B、C 激活/失活及復(fù)活曲線所示，ZL 組和ZDF組大鼠心室肌細(xì)胞激活曲線的V50分別為（24.13±1.71）mV 和（25.47±1.67）mV（P＞0.05），失活曲線的V50分別為（-30.40±1.97）mV 和（-29.18±1.21）mV（P＞0.05）；ZL 組和ZDF 組大鼠心室肌細(xì)胞激活曲線的斜率分別為17.23±0.68 vs 15.42±0.70（P＞0.05），失活曲線的斜率分別為-3.27±0.13 vs -2.68±0.27（P＞0.05）；ZL 組和ZDF 組大鼠心室肌細(xì)胞復(fù)活曲線τ 值分別為29.59±1.78 和24.39±1.22（P＞0.05）。

Western blot 結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心室組織中Kv4.3 蛋 白的 表 達水 平 明顯 下 調(diào)（P＜0.05），見圖3D。

5 糖尿病大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L及心室組織Cav1.2蛋白表達的變化

糖尿病大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L密度顯著低于對照組。10 mV時，ZL組和ZDF組大鼠心室肌細(xì)胞的ICa-L分別為（-5.35±0.32）pA/pF 和（-4.23±0.26）pA/pF（P＜0.01）；30 mV 時分別為（-3.10±0.24）pA/pF 和（-2.14±0.18）pA/pF（P＜0.01）；40 mV 時分別為（-2.04±0.20）pA/pF 和（-1.32±0.16）pA/pF（P＜0.01），見圖4A。

Figure 2. Action potential duration（APD）of ventricular myocytes isolated from ZL and ZDF rats. A：the representative action po?tential recorded in representative isolated ventricular myocytes from ZL and ZDF rats with a perforated patch configuration at 2 Hz；B，C and D：action potential amplitude（APA），APD at 50% of the amplitude（APD50）and APD at 50% of the amplitude（APD90）of the ventricular myocytes were calculated. Mean±SEM. n=12～14. **P＜0.01 vs ZL group.圖2 ZL和ZDF大鼠心室肌細(xì)胞動作電位

ICa-L的激活、失活及復(fù)活動力學(xué)均無顯著差異。如圖4B、C 激活/失活及復(fù)活曲線所示，ZL 組和ZDF組大鼠心室肌細(xì)胞激活曲線的V50分別為（-25.79±1.63）mV 和（-25.63±2.06）mV（P＞0.05）；失活曲線 的V50分別 為（-39.04± 2.39）mV 和（-29.11±3.14）mV（P＞0.05）；ZL 組和ZDF 組大鼠心室肌細(xì)胞激活曲線的斜率分別為6.01±0.34 和4.92±0.12（P＞0.05）；失活曲線的斜率分別為-4.20±0.47 和-5.01±0.78（P＞0.05）；ZL 組和ZDF 組大鼠心室肌細(xì)胞復(fù)活曲線的τ 值分別為74.42±5.43 和76.78±5.01（P＞0.05）。

Western blot 結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心室組織中Cav1.2 蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖4D。

討 論

要深入研究T2D 必須建立合適的動物模型。在各種動物模型中，ZDF 大鼠在研究肥胖相關(guān)的T2D中應(yīng)用最為廣泛。本實驗選取了ZDF 大鼠，參考王祥等［11］和Guo 等［12］的方法成功構(gòu)建了T2D 大鼠模型，研究糖尿病疾病狀態(tài)時心室肌細(xì)胞電重構(gòu)相關(guān)蛋白及通道電流的變化。根據(jù)練飛鴻等［13］的研究，糖尿病大鼠可出現(xiàn)心肌細(xì)胞體積增加、ANP 水平增高、體重及總心臟重量增加等變化；Loganathan 等［14］也發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心臟舒張末期容積減小，且平均射血體積降低。用Purina 5008 飼料飼養(yǎng)后，ZDF 大鼠在10 周齡左右出現(xiàn)了隨機血糖和體重顯著升高，左心室收縮末期容積、左心室舒張末期容積、左心室收縮末期內(nèi)徑和左心室舒張末期內(nèi)徑均顯著降低，提示ZDF 組大鼠出現(xiàn)了心功能異常。檢測ZL 及ZDF 大鼠心肌組織中肥大相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)ANP 及β-MHC 明顯上調(diào)，WGA 染色結(jié)果提示糖尿病大鼠心室肌細(xì)胞面積顯著增加。上述結(jié)果說明，在長期高血糖刺激下，ZDF大鼠心臟發(fā)生了肥大變化，與臨床上糖尿病患者的心臟病理變化及練飛鴻等［13］對糖尿病大鼠模型的研究結(jié)果一致，提示T2D 大鼠模型成功建立。

Figure 3. Ito density，activation/inactivation and reactiration curves，and Kv4.3 protein expression in ventrcular myocytes of ZL and ZDF rats. A：Ito traces were recorded in a representative ventricular myocyte of ZL nad ZDF rats using voltage steps of 400 ms steps to between -40 mV and 60 mV from 50 mV at 0.2 Hz；B：representative current recordings were used to deter?mine voltage dependence of Ito inactivation using 1 000 ms prepulses from holding potential of -80 mV to 30 mV，to 50 mV for 300 ms，and then back to -80 mV；C：recovery of Ito from inactivation in ZL and ZDF rat ventricular myocytes using paired 300 ms pulses to 50 mV from a holding potential of -80 mV with variable intervals；D：the protein expression of Kv4.3 in the ZL and ZDF rats. Mean±SEM. n=8. *P＜0.05，**P＜0.01 vs ZL group.圖3 ZL和ZDF大鼠心室肌細(xì)胞Ito密度、激活/失活和復(fù)活曲線及Kv4.3蛋白的表達

根據(jù)以往研究［15］，糖尿病可導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)生缺陷。我們研究發(fā)現(xiàn)T2D 大鼠心室肌細(xì)胞動作電位時程延長，這與Nobe 等［16］在在利用鏈脲霉素誘導(dǎo)的Wistar 大鼠糖尿病模型上檢測到的結(jié)果相一致。糖尿病大鼠單個心室肌細(xì)胞的動作電位輪廓與對照組相似，在部分心肌細(xì)胞中，動作電位延長，靜息膜電位或動作電位振幅并沒有改變［14］。長期糖尿病患者心電圖校正的QT 間期延長，可能與高糖可導(dǎo)致心室肌細(xì)胞動作電位時程延長有關(guān)。有研究報道在糖尿病動物模型中，心肌Ito在動作電位復(fù)極和重構(gòu)中起著關(guān)鍵作用，Ito-f調(diào)節(jié)切跡電位和平臺電位，并調(diào)節(jié)ICa-L的時程和幅度，減慢Ito-f失活會導(dǎo)致動作電位顯著縮短［17］。Ito幅值降低、Kv4.3 和Kv4.2 通道蛋白表達減少可能與糖尿病大鼠復(fù)極延長有關(guān)［18］。本研究結(jié)果提示，T2D大鼠心室肌細(xì)胞Ito密度明顯低于對照組，但其激活和失活動力學(xué)沒有明顯的改變；Kv4.3 蛋白的表達下降，這一結(jié)果與Ito密度變化一致。

L 型Ca2+通道是細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流的主要途徑，其功能在心臟中有十分重要的地位，它可以觸發(fā)興奮-收縮偶聯(lián)，調(diào)節(jié)動作電位的形狀，并參與心律失常［19］。在本研究中，T2D 模型大鼠心室肌細(xì)胞的ICa-L顯著降低，同時L 型鈣通道Cav1.2 的蛋白表達與對照組相比明顯下降。但L 型Ca2+通道激活和失活的電壓依賴性沒有明顯改變。這一結(jié)果與Pandit 等［20］的研究結(jié)果一致。

Figure 4. ICa-L density，activation/inactivation and reactivation curves，and Cav1.2 protein expression in ventricular myocytes of ZL and ZDF rats. A：representative ICa-L traces were recorded using voltage steps of 300 ms steps to between -60 and 60 mV from the holding potential -80 mV at 0.2 Hz in ZL and ZDF rat ventricular myocytes；B：representative current recordings were used to determine voltage dependence of ICa-L inactivation using 1 000 ms prepulses from holding potential of -80 mV to between -100 and 80 mV and back to 0 mV for 300 ms，then subjected to -80 mV；C：recovery of ICa-L from inactiva?tion using paired 300 ms pulses to 10 mV from a holding potential of -80 mV with 50 ms intervals in ZL and ZDF ventricu?lar myocyte；D：the protein expression of Cav1.2 in the ZL and ZDF rats. Mean±SEM. n=8. *P＜0.05，**P＜0.01 vs ZL group.圖4 ZL和ZDF大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L密度、激活/失活和復(fù)活曲線及Cav1.2蛋白的表達

綜上所述，本研究通過建立ZDF 大鼠糖尿病動物模型，證實了2 型糖尿病可導(dǎo)致心室肌細(xì)胞ICa-L和Ito等離子通道電流的下降，相關(guān)離子通道蛋白Cav1.2 和Kv4.3 表達降低。與1 型糖尿?。?8］及2 型糖尿病嚙齒動物［21-22］等研究結(jié)果相互補充，更完整、有力地闡述了糖尿病病理狀態(tài)下對心室肌細(xì)胞電生理重構(gòu)的影響，為闡明糖尿病心律失常提供了理論依據(jù)。但高血糖是通過何種機制影響通道蛋白及其電流的變化目前尚無定論。闡明這些機制的發(fā)生與發(fā)展，理清其上下游關(guān)系將對預(yù)防與治療糖尿病心律失常有著重要的意義。