核內(nèi)miR-199b-5p通過(guò)上調(diào)CDK9表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大*

易芷瑤， 趙安職， 張 銘， 曾 妮， 朱杰寧， 楊 瑩，嚴(yán)鈺敏， 郭惠明， 單志新，，，△

（1華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006；2南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510515；3廣東省臨床藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州510080；4華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006）

生理性和病理性心肌肥大時(shí)，心肌細(xì)胞體積增大，從而在不改變心肌細(xì)胞數(shù)量的情況下，提高心肌功能輸出，維持心臟功能［1］。心力衰竭（heart failure，HF）最初是因?yàn)樾募p傷引起心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，進(jìn)而導(dǎo)致心室泵血不足和（或）充盈功能低下?，F(xiàn)在已基本明確，導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制是心肌重構(gòu)（cardiac remodeling），阻斷心肌重構(gòu)是治療心衰的關(guān)鍵，而心肌肥大是心肌重構(gòu)過(guò)程中非常重要的方面，心力衰竭往往由心肌肥大演變而來(lái)［2］。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長(zhǎng)度約為20～22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，它在動(dòng)植物及病毒中廣泛分布，不僅對(duì)人體內(nèi)的細(xì)胞發(fā)育及分化、細(xì)胞周期和穩(wěn)態(tài)等進(jìn)行調(diào)節(jié)，還影響著生物體內(nèi)各種病理狀態(tài)的進(jìn)程，參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制［3-4］。miRNA 參與調(diào)控心肌重構(gòu)過(guò)程，有研究證實(shí)miR-21 通過(guò)激活ERK 信號(hào)通路從而促進(jìn)纖維化的進(jìn)展以及房顫的易感性［5］。我們發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p通過(guò)靶向視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)錄輔阻遏子1 促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大［6］；miR-199a-5p［7］和miR-23b-3p［8］分別通過(guò)靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 受體3（transforming growth factor β receptor 3，TGFBR3）發(fā)揮促進(jìn)心肌纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用；miR-34a-5p［9］可通過(guò)靶向抑制SIRT1表達(dá)發(fā)揮促阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 亦可存在于細(xì)胞核中，且胞核內(nèi)的miRNA 在調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用［10］，從而打破了經(jīng)典的在胞質(zhì)中miRNA 通過(guò)RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RAN-induced silencing com?plex，RISC）發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用的認(rèn)識(shí)［4］，給研究miRNA 參與廣泛的基因調(diào)控作用以及多種疾病的治療提供了新的思路。

miR-199b-5p 是miR-199 家族的一員［11］，miR-199 家族已被證明參與病理性心肌肥大過(guò)程［12］。我們前期的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，心衰患者心肌組織中的miR-199b-5p 水平顯著提高，但其在心肌細(xì)胞中的分布及對(duì)心肌肥大的調(diào)控作用尚未被闡明。本研究將初步探討心肌細(xì)胞核內(nèi)miR-199b-5p 對(duì)心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用及可能機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

出生1～3 d的SPF級(jí)C57BL/6乳小鼠，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（粵）2013-0034。

2 細(xì)胞株和主要試劑

人心肌細(xì)胞株AC16 和人胚胎腎293 細(xì)胞（hu?man embryonic kidney 293 cells，HEK293 細(xì)胞）購(gòu)自ATCC。Primocin（中生瑞泰）；特級(jí)澳洲胎牛血清、EDTA-胰蛋白酶（Gibco）；DMEM/F-12 培養(yǎng)基（Hy?Clone）；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物、4× SDS Loading Buffer 和Lipofectamine RNAiMAX Transfection Re?agent（Invitrogen）；細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核RNA 提取試劑盒（Norgen Biotek）；2× SYBR Green Mix（TaKaRa）；

BCA蛋白定量試劑盒（Thermo）；抗GAPDH抗體（Pro?tein Technology）；抗心房鈉尿肽（atrial natriuretic pep?tide，ANP）抗體（Bioworld）；抗RNA 聚合酶II（RNA polymerase II，Pol II）和p300 抗體（Abcam）；抗β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）抗體（Sigma）；ECL 發(fā)光液（Millipore）；CDK9siRNA 和miR-199b-5p mimic（廣州銳博）；Enzymatic Chroma?tin IP Kit（CST）；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)組織 本文共利用22 份健康捐獻(xiàn)者心肌組織和26 份心力衰竭患者心肌組織，獲取的人心肌組織樣品均已完成知情同意，并經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)No. GDREC2014066A），手術(shù)樣品來(lái)源于廣東省心血管病研究所。

3.2 乳小鼠心肌細(xì)胞（neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCs）原代分離與培養(yǎng) 取出生1～3 d 的SPF 級(jí)的C57BL/6 乳小鼠心臟（每次25 只C57BL/6 乳小鼠，可鋪1 板12 孔板細(xì)胞）置于潔凈的PBS溶液中，去除掉殘留血液后轉(zhuǎn)移入50 mL離心管中剪碎。采用0.125%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，反復(fù)消化多次后即得含有大量細(xì)胞的混懸液。離心后棄去上清，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清及0.2%Primocin 的DMEM/F-12 培養(yǎng)基）重懸。將重懸液置于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，以37℃、5%CO2條件培養(yǎng)1.5～2 h后，根據(jù)差速貼壁原理分離NMVCs。將分離得到的NMVCs 以每孔2×105個(gè)的量鋪入提前用1%明膠包被過(guò)的12 孔板中。穩(wěn)定培養(yǎng)24 h 后更換新的完全培養(yǎng)基，再次穩(wěn)定培養(yǎng)過(guò)夜后即可。

3.3 RT-qPCR 檢測(cè)miR-199b-5p、CDK9 mRNA 及心肌肥大標(biāo)志物mRNA 的表達(dá) 采用Trizol 法提取出NMVCs 中的總RNA。取1 μg 總RNA 加入4 μL 5×PrimeScript RT Master Mix（含有PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo-dT Primer 和dNTP Mixture）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA 后用于檢測(cè)CDK9 和心肌肥大標(biāo)志物的mRNA 表達(dá)水平（以GAPDH 作為檢測(cè)內(nèi)參照）。取1 μg 總RNA，加入5 μL 5× PrimeScript RT Buffer、1.25 μL RT Enzyme Mix 和0.2 μL 特異RT 引物進(jìn)行miRNA 成熟體逆轉(zhuǎn)錄，得到成熟體cDNA 后以U6 為檢測(cè)內(nèi)參照檢測(cè)miR-199b-5p 水 平。在ViiA 7 Quantitative PCR Sys?tem（Applied Biosystems）進(jìn)行PCR 和結(jié)果分析。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-199b-5p、CDK9 mRNA 和心肌肥大標(biāo)志物mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。所用引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers used in RT-qPCR

3.4 Western blot 檢測(cè)蛋白水平 處理后的NMVCs加入RIPA 裂解液進(jìn)行裂解，裂解后離心，取上清，即得蛋白提取液。取適量蛋白提取液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，之后進(jìn)行定量分裝，并加入4×loading buffer。渦旋混勻后置于金屬浴上99℃變性10 min，-80℃保存。分裝變性好的蛋白可進(jìn)行SDS-PAGE 并轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，采用5%的脫脂牛奶封閉1 h 。用所需檢測(cè)蛋白的相應(yīng)抗體［anti-CDK9（1∶2000），anti-β-MHC（1∶2 000），anti-ANP（1∶1 000），anti-GAPDH（1∶5 000）］對(duì)PVDF 膜于4℃孵育過(guò)夜。TBST 溶液清洗3 次后用相應(yīng)Ⅱ抗（1∶5 000）進(jìn)行孵育，室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH 為內(nèi)參照，F(xiàn)luorChem 8900進(jìn)行灰度分析。

3.5 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)CDK9的轉(zhuǎn)錄激活及miR-199b-5p與CDK9啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合 參照我們已報(bào)道過(guò)的方法［13］，分別構(gòu)建包含CDK9啟動(dòng)子區(qū)（2 kb 序列）、miR-199b-5p 與CDK9啟動(dòng)子潛在結(jié)合序列及其突變序列的重組pGL3-enhancer 質(zhì)粒。使用HEK293 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染0.5 ng pRL-TK、500 ng 重組質(zhì)粒及50 nmol/L miR-199b-5p mimic。24 h 后收板，分別測(cè)定螢火蟲螢光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)L）及海腎螢光素酶（Renillaluciferase，RL）的活性，其比值（FL/RL）變化則可反映miR-199b-5p 與CDK9啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的能力。類似的，利用人心肌AC16 細(xì)胞，檢測(cè)miR-199b-5p對(duì)CDK9基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。

3.6 ChIP-PCR 實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染miR-199b-5p 24 h 的NMVCs 在1%甲醛（Sigma）中37℃孵育15 min，用125 mmol/L 甘氨酸終止反應(yīng)，超聲處理使染色質(zhì)破碎至100～500 bp的片段。與Pol II和p300結(jié)合的內(nèi)源性DNA 免疫沉淀如下：將30 μL 免疫磁珠與5 μg Pol II/p300 抗體（Abcam，ab32381/ab5408）或5 μg 非特異性山羊IgG（CST，2729）在25℃孵育30 min，IgG作為陰性對(duì)照。將超聲破碎的4 μg DNA 作為in?put DNA，將40 μg 超聲破碎的DNA 與抗體珠復(fù)合物在25℃孵育40 min，然后進(jìn)行洗滌步驟，用洗脫緩沖液（1% SDS 和0.1 mol/L NaHCO3）洗脫/Pol II 或p300結(jié)合的DNA。用2 mg/L RNA 酶37℃消化1 h，42℃蛋白酶K 消化過(guò)夜。純化洗脫DNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)純化DNA。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

3.7 鬼筆環(huán)肽（FITC-phallodin）染色 將NMVCs 提前鋪于confocal 皿中，待其穩(wěn)定生長(zhǎng)并處理完畢后，棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 次。吸干PBS 后加入500μL 4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，室溫靜置20～30 min。棄去多聚甲醛溶液，加入PBS，置于水平搖床上以50～60 r/min 的轉(zhuǎn)速清洗2～3 次，每次10 min。吸干PBS，加入0.1%TritonX-100透化液500 μL進(jìn)行透化處理，室溫靜置3～5 min。棄去Triton X-100 透化液后加入PBS 在水平搖床上漂洗2～3 次，每次10 min。吸干PBS，加入500 μL 用1% BSA 溶液配制的鬼筆環(huán)肽工作液，室溫避光靜置染色60～90 min。染色完畢后棄去鬼筆環(huán)肽工作液，加入PBS 清洗3 次，每次5 min。吸干殘留PBS 后，每皿滴入3 滴含有DAPI 的封片劑用以封片，并避光收于4℃冰箱，待拍攝。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并用Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-199b-5p在心衰患者心肌組織中的表達(dá)和心肌細(xì)胞內(nèi)的定位

麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色結(jié)果顯示，心衰患者的心肌細(xì)胞面積明顯增大，呈現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大現(xiàn)象（P＜0.01），見圖1A。miRNA表達(dá)譜芯片與RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，miR-199b-5p 在心衰患者的心肌組織中表達(dá)顯著增強(qiáng)，見圖1B。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，我們對(duì)多名健康人與心衰患者的心肌組織標(biāo)本進(jìn)行RNA 提取，并隨后進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)，也得到了一致的結(jié)果，見圖1C。分離人心肌AC16 細(xì)胞的核、質(zhì)RNA 組分并行miR-199b-5p 水平檢測(cè)，RT-qPCR 結(jié)果顯示，GAPDH mRNA 主要分布于AC16 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而U6 和miR-199b-5p 主要分布于AC16 細(xì)胞核內(nèi)，見圖1D。

2 miR-199b-5p 促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因和CDK9基因的表達(dá)

我們用血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）處理原代NMVCs，RT-qPCR 結(jié)果顯示MYH7 mRNA、ANP mRNA和miR-199b-5p表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P＜0.01），見圖2A。miR-199b-5p mimic 可被有效轉(zhuǎn)染入NMVCs 中（圖2B），且轉(zhuǎn)染入NMVCs 中的miR-199b-5p mimic 主要積累于細(xì)胞核內(nèi)（圖2C）。序列分析結(jié)果（http：//asia. ensembl. org/）顯示，在小鼠miR-199b 前體基因座位與CDK9基因臨近，見圖2D。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-199b-5p mimic 后的NMVCs 中，ANP、MYH7（mRNA）/β-MHC（蛋白）和CDK9 的表達(dá)水平均顯著增加，見圖2E、F。

Figure 1. The expression of miR-199b-5p in the myocardium of heart failure（HF）patients（n=26）and healthy controls（n=22）. A：the cross-sectional area of cardiomyocytes in human myocardium determined by wheat germ agglutinin（WGA）staining；B：the heat map showed the representative dysregulated miRNAs in the myocardium of HF patients；C：the expression of miR-199b-5p in the myocardium of HF patients detected by RT-qPCR；D：the distribution of miR-199b-5p in cytoplasm and nu?cleus of human cardiac AC16 cells（n=5）. Mean±SEM. **P＜0.01 vs healthy controls.圖1 miR-199b-5p在心衰病人和健康對(duì)照者心肌中表達(dá)水平的比較

3 CDK9 介導(dǎo)核miR-199b-5p 促心肌細(xì)胞肥大的作用

對(duì)NMVCs 分 別 轉(zhuǎn) 染miR-199b-5p mimic 和CDK9 siRNA，鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，miR-199b-5p可顯著增加NMVCs 的表面積，而轉(zhuǎn)染CDK9 siRNA后可逆轉(zhuǎn)miR-199b-5p促心肌細(xì)胞肥大的作用，見圖3A。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-199b-5p mimic 都能促進(jìn)NMVCs 中心肌肥大相關(guān)蛋白及CDK9 表達(dá)增加，而轉(zhuǎn)染CDK9 siRNA 能有效抑制由miR-199b-5p 引起的心肌肥大相關(guān)蛋白的表達(dá)，見圖3B。

4 核 內(nèi)miR-199b-5p 對(duì)NMVCs 中CDK9 基因的轉(zhuǎn)錄激活作用

利用構(gòu)建的含CDK9 基因啟動(dòng)子序列的螢光素酶報(bào)告基因載體進(jìn)行雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果顯示，miR-199b-5p 可特異增強(qiáng)CDK9 基因的轉(zhuǎn)錄活性，見圖4A。序列分析提示，miR-199b-5p 與小鼠CDK9 基因啟動(dòng)子區(qū)的-1164～-1146 位點(diǎn)（TGTCTCCCAAATGCTGGGA）有結(jié)合作用。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，miR-199b-5p 可與CDK9 基因啟動(dòng)子區(qū)-1164～-1146 位點(diǎn)結(jié)合，而將序列突變（TGTCTCCCAAATCGACCGA）后，miR-199b-5p的結(jié)合作用消失，見圖4B。ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-199b-5p 促 進(jìn)NMVCs 中Pol II 和p300 與CDK9基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合作用，見圖4C。

Figure 2. miR-199b-5p enhanced the expression of hypertrophy markers and CDK9 in the neonatal mouse ventricular cardiomyocytes（NMVCs）. A：the expression of ANP mRNA，MYH7 mRNA and miR-199b-5p in angiotensin II（Ang II）-treated NMVCs detected by RT-qPCR；B：the level of miR-199b-5p in miR-199b-5p-modified NMVCs；C：the distribution of miR-199b-5p in cytoplasm and nucleus of miR-199b-5p-modified NMVCs；D：gene loci of miR-199b and CDK9 in mouse genome；E：the mRNA expression of ANP，MYH7 and CDK9 in miR-199b-5p-treated NMVCs detected by RT-qPCR；F：the protein ex?pression of ANP，β-MHC and CDK9 in miR-199b-5p-treated NMVCs detected by Western blot. Mean±SEM. n=3. ##P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs scrambled group.圖2 miR-199b-5p可增強(qiáng)NMVCs中心肌肥大標(biāo)志物和CDK9的表達(dá)

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，利用心肌特異表達(dá)的“分子海綿”結(jié)合并阻斷miR-199a/199b-5p 的作用，可增加小鼠心臟重量，但心臟形態(tài)和功能正常，機(jī)制研究提示PGC1α 介導(dǎo)了miR-199a/199b-5p 降低引起的生理性心肌肥大過(guò)程［14］。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-199b-5p在心衰的人和小鼠心肌及心梗后的小鼠心肌中表達(dá)升高，miR-199b-5p 靶向抑制Dyrk1a、Notch1 受體及其Jagged1 配體表達(dá)，從而加劇心肌肥大和心肌纖維化［15-16］。與以往研究一致，在本研究中，我們證實(shí)miR-199b-5p 在心衰患者心肌組織中表達(dá)增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染miR-199b-5p mimic 可增加ANP 和β-MHC 等心肌肥大標(biāo)志物的表達(dá)，具有促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的作用。

Figure 3. Knock-down of CDK9 inhibited the pro-hypertrophy effect of miR-199b-5p on NMVCs. A：morphological changes of NMVCs observed by FITC-phalloidin staining（scale bar=50 μm）；B：the protein expression of ANP，β-MHC and CDK9 in NMVCs detected by Western blot. Mean±SEM. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs scrambled group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs miR-199b-5p+si-NC group.圖3 敲減CDK9可抑制miR-199b-5p促心肌細(xì)胞肥大的作用

既往RNA 深度測(cè)序的研究顯示，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中有多種miRNA 的特征性定位分布［17］。miRNA的不同細(xì)胞定位可能會(huì)導(dǎo)致截然不同的生物學(xué)功能，但具體機(jī)制尚不完全清楚［18］。隨著miRNA 相關(guān)研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)顯示在某些特定情況下miRNA 能夠促進(jìn)基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄［19-23］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p 在心肌細(xì)胞核內(nèi)富集，miR-199b-5p mimic 可 以 特 異 增 加 與miR-199b-5p 前體基因臨近的CDK9基因的轉(zhuǎn)錄激活和表達(dá)，而敲減CDK9表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-199b-5p促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的作用，提示CDK9 介導(dǎo)了miR-199b-5p 促心肌細(xì)胞肥大作用。

CDK9 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起著重要的作用［24］。心肌肥大通常伴隨著cyclin T/CDK9 的激活，心臟特異性的細(xì)胞周期蛋白T1 激活CDK9 則可引起心肌肥大；通過(guò)敲減7SK RNA 表達(dá)或過(guò)表達(dá)cyclin T1 從而激活CDK9 均能產(chǎn)生體內(nèi)外的致心肌細(xì)胞肥大作用［25-26］。研究證實(shí)，CDK9轉(zhuǎn)基因小鼠會(huì)發(fā)生心肌肥大，CDK9與Gq依賴性的心肌肥大通路相互作用，損害多種線粒體蛋白基因表達(dá)，特別是抑制線粒體生物發(fā)生和功能的主調(diào)節(jié)因子PGC-1 和NRF-1，進(jìn)而參與心肌肥大和線粒體功能障礙過(guò)程［27］。

本研究證實(shí)，miR-199b-5p可通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活的方式增強(qiáng)CDK9基因表達(dá)，我們還鑒定了miR-199b-5p與CDK9基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，并進(jìn)一步通過(guò)ChIP-PCR 證實(shí)Pol II 和p300 可以募集到miR-199b-5p 與CDK9基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)上，并參與CDK9基因的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而引發(fā)NMVCs 出現(xiàn)肥大表型。因此，本研究結(jié)果表明，與心肌細(xì)胞胞質(zhì)中miR-199b-5p 的作用方式不同，核內(nèi)miR-199b-5p 是通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活CDK9基因的方式引起心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)的。同時(shí)，這些結(jié)果也表明心肌細(xì)胞胞質(zhì)/胞核中miR-199b-5p 通過(guò)不同的分子機(jī)制來(lái)協(xié)同促進(jìn)心肌肥大的作用。

Figure 4. miR-199b-5p enhanced the transcription of CDK9 gene. A：miR-199b-5p enhanced CDK9 transcription activity（detected by dual-luciferase reporter assay）；B：identification of the interaction between miR-199b-5p and CDK9 gene promoter by dual-luciferase reporter assay；C：ChIP-PCR for detecting RNA polymerase II（Pol II）and p300 on CDK9 gene promoter in miR-199b-5p-modified NMVCs. Mean±SEM. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs scrambled group；△△P＜0.01 vs group a；##P＜0.01 vs group c.圖4 miR-199b-5p增強(qiáng)CDK9基因的轉(zhuǎn)錄激活

本研究明確NMVCs 核內(nèi)miR-199b-5p 可特異性增強(qiáng)CDK9基因的表達(dá)，證實(shí)CDK9 可介導(dǎo)核內(nèi)miR-199b-5p 促心肌細(xì)胞肥大的作用。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步在整體動(dòng)物水平明確miR-199b-5p 通過(guò)調(diào)控CDK9基因表達(dá)發(fā)揮促心肌肥大的作用機(jī)制。