CD44?配體相互作用的生物力學(xué)與功能調(diào)控1)

李林達 丁奇寒?, 陳深寶?, 呂守芹?,,2) 龍 勉?, 郭興明,3)

?(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院,生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室,重慶 400044)

?(中國科學(xué)院力學(xué)研究所生物力學(xué)與生物工程中心,中國科學(xué)院微重力重點實驗室,工程化構(gòu)建與力學(xué)生物學(xué)北京市重點實驗室,北京 100190)

??(中國科學(xué)院大學(xué)工程科學(xué)學(xué)院,北京 101408)

引言

CD44 (cluster of differentiation 44)是一種I 型跨膜糖蛋白,廣泛分布在心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺等組織器官中,表達細胞包括內(nèi)皮細胞、間充質(zhì)細胞、造血干細胞,以及單核、巨噬、嗜中性粒、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞等血細胞,同時還包括中胚層來源的細胞等[1].CD44 在多種生理和病理過程中發(fā)揮作用,如器官形成、造血、淋巴細胞活化、腫瘤轉(zhuǎn)移及免疫反應(yīng)[2]等,同時是淋巴癌、前列腺癌、宮頸癌、腫瘤干細胞及早期動脈粥樣硬化的標志物[3].其中通過CD44?配體相互作用介導(dǎo)的細胞?細胞之間或細胞?基質(zhì)之間的粘附及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是CD44在炎癥級聯(lián)反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移、淋巴細胞歸巢等生理、病理過程中發(fā)揮作用的重要途徑.因此,考察CD44與不同配體相互作用的反應(yīng)動力學(xué)及其介導(dǎo)的細胞粘附動力學(xué)與胞內(nèi)信號通路特征是闡釋其功能的基礎(chǔ).同時,炎癥級聯(lián)反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移或淋巴細胞歸巢等過程均發(fā)生在血流剪切的力學(xué)環(huán)境中,血流對細胞的剪切會轉(zhuǎn)化為CD44?配體相互作用的外力,從而調(diào)控其分子間相互作用.此外,免疫細胞的募集、歸巢或癌細胞的轉(zhuǎn)移還受到基底硬度等其他力學(xué)微環(huán)境的調(diào)控.因此,進一步考察外力作用如何通過調(diào)控CD44?配體相互作用反應(yīng)動力學(xué)進而調(diào)控細胞粘附動力學(xué)從而實現(xiàn)特定生物學(xué)功能是理解CD44 功能的另一重要內(nèi)容.基于此,本文將重點介紹CD44?配體相互作用在免疫反應(yīng)過程中的作用及機制研究進展.

1 CD44 概述

人源CD44 是由11 號染色體單拷貝編碼的跨膜糖蛋白[4],按照轉(zhuǎn)錄方式不同可將CD44 前體信使RNA(messenger RNA,mRNA)的20 個外顯子分為組成型和變異型拼接外顯子,進而分別轉(zhuǎn)錄成標準型CD44(CD44s)和變異型CD44(CD44v),而CD44v 又可以通過可變區(qū)域的選擇性拼接得到不同變異體亞型[4].目前發(fā)現(xiàn)人類至少有數(shù)十種CD44 的可變剪切體[1],其中最常見的亞型包括CD44v4-7,CD44v8-10,CD44v3-10 和CD44v1-10[5].不同亞型的CD44表達部位不同,CD44s 主要分布于間質(zhì)及造血源性細胞,而CD44v 主要分布于上皮源性細胞和腫瘤細胞.另外,CD44 可進行N 糖基化、O 糖基化翻譯后修飾.最常見的人源CD44s 由361 個氨基酸組成(～37.2 kD),經(jīng)過糖基化修飾加工[6],蛋白質(zhì)分子量可達80～100 kD[7];而變異型CD44v 分子量變化范圍約為80～250 kD.采用原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)技術(shù)掃描CD44 蛋白的大小,結(jié)果顯示CD44 高度為2.3±1.4 nm,三維尺寸約為25 nm×30 nm×2.5 nm,與免疫球蛋白大小相類似[8-9].

CD44 結(jié)構(gòu)從胞外N 末端至胞內(nèi)C 末端包含胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域3 部分.胞外域又可分為氨基末端和近膜域.氨基末端是含有6 個保守半胱氨酸殘基的球狀結(jié)構(gòu)域,其中保守半胱氨酸形成的二硫鍵是N 末端球狀結(jié)構(gòu)域正確折疊及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)[10].標準型CD44s 的氨基末端球狀結(jié)構(gòu)域與跨膜段之間是一段由46 個氨基酸形成的莖狀區(qū)[11],保守性較低,可被高度糖基化并包含蛋白水解切割位點[12].而不同剪接體CD44v 的可變區(qū)可插入在N 末端球狀結(jié)構(gòu)域與莖狀區(qū)之間[13].CD44 跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)序列高度保守,其跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)支持其在細胞膜上的寡聚化(oligomerisation),并有助于其定位在富含糖脂的膜微區(qū)(glycolipid enriched membrane microdomains)[14],以及其與脂筏的作用[15].CD44 的胞內(nèi)區(qū)含有與細胞骨架錨定蛋白(ankyrin)和ERM(ezrin,radixin,moesin)蛋白的結(jié)合位點.Merlin 蛋白(moesin-ezrin-radixin-like protein)也可與CD44 胞內(nèi)端發(fā)生相互作用[16].對于CD44s,ERM 蛋白與細胞骨架錨定蛋白分別與其胞內(nèi)段的292～300,304～318位氨基酸結(jié)合[17].由蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)觸發(fā),CD44 胞內(nèi)尾端絲氨酸(Ser)殘基的有序磷酸化和/或去磷酸化,將增強ERM 蛋白與CD44 的結(jié)合[18].激活的ERM 蛋白N 末端與CD44 胞內(nèi)域結(jié)合,而其C 末端與F 肌動蛋白結(jié)合,因此,ERM 蛋白是將CD44 連接至肌動蛋白細胞骨架的橋梁蛋白[19],可啟動CD44 下游的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑,行使特定的生物學(xué)功能.CD44 潛在的N 糖基化位點(天冬酰胺(Asn)殘基)多數(shù)位于胞外域的N 末端結(jié)構(gòu)域或可變區(qū),而O 糖基化位點(絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)殘基)和GAG 附著物(GAG attachments)(Ser-Gly 多肽)則主要分布在胞外的細胞膜近端區(qū)域和可變區(qū)[20-21].

2 CD44 ?配體相互作用在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中的作用

炎癥反應(yīng)(inflammation)是一種由損害或損傷刺激所誘發(fā)的適應(yīng)性反應(yīng)(adaptive response),分為急性(acute)和慢性(chronic)炎癥反應(yīng)[22].多數(shù)急性炎癥反應(yīng)由病毒感染或者機體組織損傷引起,首先由組織中駐留的巨噬細胞和肥大細胞通過Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)和NOD 樣受體(nucleotide-binding oligomerization-domain protein-like receptors,NLRs)等啟動感染識別[23],隨后產(chǎn)生趨化因子、細胞因子、血管活性胺(vasoactive amines)等多種炎性介質(zhì),引發(fā)局部炎癥,進而通過炎癥級聯(lián)反應(yīng)募集血流中的白細胞遷移穿過毛細血管后微靜脈(postcapillary venules)到達炎癥部位,吞噬病原體[24].白細胞從血流向炎癥部位募集主要包括被血管內(nèi)皮細胞捕獲,在內(nèi)皮細胞表面滾動、粘附、爬行,最后跨內(nèi)皮遷移等級聯(lián)過程.該級聯(lián)反應(yīng)由系列受體?配體相互作用介導(dǎo),同時受到基質(zhì)硬度、血流剪切等力學(xué)微環(huán)境調(diào)控.已有研究表明,表達在白細胞上的糖蛋白PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand 1)與表達在內(nèi)皮細胞上的選擇素(selectin)的相互作用主要介導(dǎo)初期的捕獲與快速滾動過程,CD44 ?配體相互作用則主要介導(dǎo)白細胞的慢速滾動,而整合素?配體相互作用則主要介導(dǎo)后期的穩(wěn)定粘附、爬行等過程[25].下文將重點介紹CD44?配體相互作用在炎癥級聯(lián)反應(yīng)過程中的作用.

2.1 CD44 配體——選擇素

I 型跨膜蛋白選擇素是CD44 介導(dǎo)細胞?細胞粘附的主要配體之一,包括P,E 與L 選擇素3 個家族成員,其結(jié)構(gòu)從胞外N 末端至胞內(nèi)C 末端依次包括鈣型凝集素結(jié)構(gòu)域(calcium-type lectin domain,Lectin)、類上皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(epidermal growth factor-like module,EGF),起粘附補體蛋白作用的多個重復(fù)序列(consensus repeats,CR)、跨膜區(qū)域(transmembrane,TM)和胞內(nèi)區(qū)(cytoplasmic,Cyto).三者之間的區(qū)別是P,E 與L 選擇素分別含有9,6,2 個CR結(jié)構(gòu)域,從而具有不同長度[26-27].盡管具有相似結(jié)構(gòu),但是3 種選擇素具有不同生物學(xué)功能.L 選擇素在造血干細胞和成熟白細胞上高表達,并且L 選擇素容易水解,即使在沒有化學(xué)因子的刺激下,力學(xué)因素如流體剪切即可以使得中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)上L 選擇素發(fā)生水解[28];P 選擇素主要表達在血小板和內(nèi)皮細胞,并分別儲存在α 顆粒和Weibel-Palade 小體中,而促炎刺激可促使P 選擇素通過細胞內(nèi)儲藏小體與質(zhì)膜的融合,從而迅速從α顆粒轉(zhuǎn)移至細胞表面;E 選擇素主要表達在血管內(nèi)皮細胞上,其表達水平受到炎癥介質(zhì)的調(diào)控.在人源血管內(nèi)皮細胞中,由腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)誘導(dǎo)上調(diào)表達的主要是E 選擇素[29].

簡言之,CD44?選擇素相互作用,尤其是E 選擇素,是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中免疫細胞募集的重要分子體系.與E 選擇素與E 選擇素配體-1(ESL-1)、E 選擇素與PSGL-1 相互作用體系相比,三者在炎癥反應(yīng)中具有比較明確的功能分工.PSGL-1 主要在初期白細胞捕獲過程中起作用;ESL-1 在初期捕獲到穩(wěn)定慢速滾動過程中起作用;而CD44 則主要介導(dǎo)慢速滾動[35].

2.2 CD44 配體——透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)是脊椎動物中細胞外基質(zhì)的重要組成部分.HA 是葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖通過交替β-1,4 和β-1,3 糖苷鍵結(jié)合的具有重復(fù)二糖單元的線性聚合物,典型分子量約為1 MDa,長度可達微米量級,在多種病理、生理過程(如炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、胚胎發(fā)生、腫瘤發(fā)展、骨關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化)中起重要作用[37-39].目前觀點認為,低分子量HAHA(LMW-HA)起到促進炎癥的作用,而高分子量HAHA(LMW-HA)具有抑制炎癥的作用[40].低分子量HA 與CD44 相互作用可促進細胞釋放IL-10 和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1),加劇炎癥反應(yīng)[41].低分子量HA還可以上調(diào)CD44 表達,同時增加蛋白激酶δ(PKCδ)和蛋白激酶ε(PKCε)表達,并對軟骨細胞產(chǎn)生損傷,增強炎癥反應(yīng).而中、高分子量HA 對軟骨細胞無作用,并且高分子量HA 可抑制PKCδ,PKCε,核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的活化和炎癥反應(yīng)[42].另外,HA 片段上調(diào)CD44 和TLR-4 表達,激活NF-κB易位并增加有害細胞因子TNF-α,IL-6 和IL-1β 分泌.特異性CD44 阻斷抗體可降低CD44 和細胞因子表達水平[43].

CD44 可通過兩種方式與HA 相互作用,一是細胞膜定位的CD44 通過特異性相互作用將可溶性HA 錨定在細胞膜上;二是免疫細胞或癌細胞表達的CD44 與其他細胞膜表達或錨定的HA 相互作用直接介導(dǎo)細胞粘附.細胞表面高表達的CD44 與富含HA的胞外基質(zhì)相互作用是介導(dǎo)腦癌細胞侵襲的主要分子體系,并且癌細胞在遷移過程中呈現(xiàn)獨特的微觸角結(jié)構(gòu)[44].與CD44?選擇素相互作用類似,CD44-HA相互作用介導(dǎo)的細胞粘附同樣在炎癥反應(yīng)中起重要作用,其中報道最多的是其介導(dǎo)的T 淋巴細胞歸巢過程.在化學(xué)因子PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)誘導(dǎo)條件下,T 淋巴細胞上CD44 與內(nèi)皮細胞上HA相互作用介導(dǎo)其滾動粘附[45].而且,T 細胞的活化增加其表面CD44 與內(nèi)皮細胞上HA 的結(jié)合能力.在體研究表明,注射超抗原葡萄球菌腸毒素B 后,T 細胞募集到發(fā)炎腹膜部位依賴于CD44 和HA 之間的相互作用[46];TNF-α 誘導(dǎo)的炎癥小鼠模型中Th1 和Th2 細胞在體內(nèi)的滾動粘附同樣依賴于CD44-HA相互作用[47].另外,CD44 也是整合素VLA-4(integrin α4β1)-VCAM-1(vascular cellular adhesion molecule 1)相互作用介導(dǎo)T 細胞在內(nèi)皮細胞上穩(wěn)定粘附的必要條件[48].此外,CD44-HA 相互作用同樣可以介導(dǎo)中性粒細胞向炎癥部位的募集[49-50].另一方面,CD44-HA 相互作用受到多種因素的調(diào)控.細胞表面HA 延伸形成的纜狀結(jié)構(gòu)可促進巨噬細胞在特定炎癥組織的定位[51].CD44 胞外域糖基化程度以及CD44 胞質(zhì)端特定絲氨酸殘基磷酸化均會調(diào)控其與HA 的結(jié)合能力[52].抗原受體、細胞因子(如IL-2)、腫瘤壞死因子(TNF)以及趨化因子(包括MIP-1β(macrophage inflammatory protein 1 β),IL-8 和RANTES 等)均可激活CD44、從而進一步增強其與HA 的結(jié)合促進T 細胞粘附[53].而IL-1α,IL-1β,IL-3,粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素γ (IFN-γ)和LPS 等均可通過TNF 誘導(dǎo)外周血單核細胞上CD44 與HA的結(jié)合[54-55].綜上所述,CD44-HA 相互作用是介導(dǎo)生命體免疫反應(yīng)的重要分子體系.

CD44-HA 相互作用在肝臟免疫中的作用更為凸顯.HA 在肝臟中的表達相對于其他器官更高,而且主要分布在肝血竇內(nèi)[56].肝血竇作為肝臟內(nèi)特化的毛細血管網(wǎng)絡(luò),是肝臟免疫發(fā)生的主要場所.與經(jīng)典炎癥級聯(lián)反應(yīng)中白細胞的募集動力學(xué)不同,白細胞在肝臟免疫過程中的募集主要發(fā)生于肝血竇內(nèi),僅有20%～30%的白細胞在肝血竇后微靜脈粘附.由于肝血竇內(nèi)皮細胞上極少量表達選擇素,白細胞在肝血竇內(nèi)的募集不會發(fā)生滾動粘附[57].根據(jù)誘發(fā)因素不同,肝血竇內(nèi)的中性粒細胞主要通過兩種途徑發(fā)生募集.在肝臟無菌炎性損傷中,凋亡細胞釋放的DAMPs(damage associated molecular patterns)直接或間接激活中性粒細胞,并刺激內(nèi)皮細胞上調(diào)表達ICAM-1(intercellular cell adhesion molecule-1),進而與中性粒細胞上的粘附分子整合素αMβ2發(fā)生相互作用,介導(dǎo)中性粒細胞粘附,隨后中性粒細胞在肝內(nèi)駐留的巨噬細胞— 枯否氏細胞(kupffer cell)等— 分泌的趨化因子梯度引導(dǎo)下進行定向爬行,到達特定位點進行跨膜遷移進入損傷組織.而在有菌炎癥(如內(nèi)毒素血癥和革蘭氏陰性菌敗血癥等)過程中,高水平LPS 的刺激促炎因子IL-10 表達上調(diào)、進而抑制αMβ2的表達,此時CD44 取代行使功能,通過與HA相互作用介導(dǎo)中性粒細胞募集[58].CD44 敲除可有效降低LPS 刺激條件下中性粒細胞的粘附[59].更進一步,阻斷CD44-HA 相互作用有效降低了LPS 小鼠肝血竇內(nèi)中性粒細胞的粘附,而對其在竇后微小靜脈內(nèi)的滾動粘附過程則沒有影響,而且在此過程中起作用的CD44 是中性粒細胞上而不是內(nèi)皮細胞上表達的CD44[56].另外,一種血清來源的HA 相關(guān)蛋白SHAP 通過與HA 共價結(jié)合形成HA/SHAP 復(fù)合物,可顯著增強HA 與CD44 的相互作用[60].

簡言之,CD44-HA 相互作用是介導(dǎo)免疫過程中白細胞募集的另一重要分子體系.但是相對于在經(jīng)典炎癥反應(yīng)中起重要作用的選擇素?PSGL-1、選擇素?CD44 等分子體系而言,CD44-HA 相互作用更具有其器官特異性,尤其是在肝臟免疫中起重要作用,但是其分子機制尚不明確,其主要原因在于HA 分子量的多樣性及不同組裝形式.比如,不同分子量的可溶性HA 對炎癥反應(yīng)效果不同,而不同分子量膜定位的HA 對介導(dǎo)細胞粘附有什么樣的差異？其不同組裝形式對細胞粘附的調(diào)控？膜定位條件下CD44-HA相互作用反應(yīng)動力學(xué)特性與其他細胞粘附分子配體相互作用反應(yīng)動力學(xué)之間的區(qū)別等問題,目前均不明確.

3 CD44 ?配體相互作用的反應(yīng)動力學(xué)及力學(xué)調(diào)控

受體?配體相互作用反應(yīng)動力學(xué)是調(diào)控細胞粘附動力學(xué)的基礎(chǔ).分子間相互作用分為三維、二維反應(yīng)兩種形式.三維反應(yīng)是指特異性相互作用的分子雙方至少有一種在溶液中處于游離態(tài)(如血液中血漿蛋白和抗體),具有空間三維運動自由度,因而易于與另一種分子發(fā)生相互作用;三維反應(yīng)表征的是大量分子的統(tǒng)計平均性質(zhì),通常可用確定性化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)理論來描述,常用的實驗測量方法包括表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)等.二維反應(yīng)是指特異性相互作用的分子雙方分別被錨定在兩個表面上,僅具有沿表面面內(nèi)擴散的二維運動自由度,但缺乏沿垂直于表面法向運動的自由度(如白細胞或內(nèi)皮細胞表面的選擇素配體相互作用等);因為接觸面受限,二維反應(yīng)中參與作用的分子數(shù)目少,表征的是有限數(shù)目受體?配體間結(jié)合和解離的隨機動力學(xué)行為;而且,二維反應(yīng)形成的分子復(fù)合物為兩個相對表面之間提供了直接的物理連接,因此其反應(yīng)動力學(xué)還受到外力及其他物理因素的調(diào)控,具有力學(xué)?化學(xué)耦合特征.常用的實驗測量方法包括原子力顯微鏡、生物膜力探針(biomembrane force probe,BFP)等典型的分子生物力學(xué)測量手段[61-62].

為進一步理解CD44 ?選擇素、CD44-HA 相互作用介導(dǎo)的細胞粘附動力學(xué)差異,以下著重介紹該分子體系的反應(yīng)動力學(xué)特征及其力學(xué)調(diào)控規(guī)律.目前已報道的分子層次三維反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)匯總于表1 中.在無外力作用下,E 選擇素與PSGL-1 相互作用的負反應(yīng)率koff與E 選擇素與CD44 相互作用基本相當,而正反應(yīng)率kon略低,進而導(dǎo)致其解離常數(shù)KD(KD=koff/kon)略高,也就是說E 選擇素與CD44相互作用結(jié)合更快.雖然不同文獻報道的具體數(shù)值有差異,但是二者間的相對趨勢保持不變.如果是E選擇素?PSGL-1,E 選擇素?CD44 兩對分子體系與CD44-HA 相互作用去比較,后者的正反應(yīng)率顯著升高,而負反應(yīng)率沒有太大差異,最終導(dǎo)致其解離常數(shù)KD遠低于E 選擇素配體相互作用,表明CD44-HA相互作用的結(jié)合更快、更穩(wěn)定.一個例外是當HA 分子量為6.4 kD 時,其與CD44 相互作用的負反應(yīng)率koff明顯高于其他分子量HA,提示特別低分子量的HA 與CD44 相互作用較弱.另外,從已有數(shù)據(jù)可以看出,當HA 分子量>100 kD 時,其與CD44 相互作用的正反應(yīng)率從6.4,31 kD 時的～104M?1s?1顯著升高至106～107M?1s?1,表明CD44-HA 相互作用能力與HA 的分子量密切相關(guān).而只有HA 寡糖大于20 個殘基才能有效與CD44 結(jié)合[63].

力學(xué)調(diào)控下不同分子間相互作用反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)匯總于表2 中,主要是基于AFM 技術(shù)對不同CD44亞型配體相互作用的測量.結(jié)果顯示:在大致可比的加載率條件下(0.46～4.58 或0.45～5.22 nN/s),不管是單鍵還是多鍵相互作用,CD44-HA 相互作用斷裂力強度約在20～50 pN,相應(yīng)的零力下負反應(yīng)率分別約為0.3±0.5,0.57±0.11 s?1.不管是變異體CD44v或標準型CD44s,其與HA 相互作用的負反應(yīng)率顯著低于其與P 選擇素、纖維蛋白或纖維蛋白原的相互作用,說明CD44-HA 相互作用更穩(wěn)定.對于同樣表達CD44 的細胞,AFM 探針上直接包被HA 與探針上固定包被HA 的微珠的測量則表現(xiàn)出明顯差異.前者獲得的CD44-HA 相互作用的斷裂力范圍與底板直接包被CD44 或含CD44 的磷脂雙分子層的實驗體系基本可比,約為幾十皮牛.而探針上固定包被有HA 的微珠時,斷裂力則增加至nN 量級;這可能與細胞較軟,與微珠接觸面大,從而導(dǎo)致是多鍵相互作用有關(guān).另外,比較不同分子量HA 與CD44 相互作用發(fā)現(xiàn),高分子量HA 的斷裂力更低[67].從表2 統(tǒng)計也可以看出,二維條件下獲得的CD44?配體相互作用負反應(yīng)率明顯高于三維條件下(表1)的結(jié)果,表明二維約束及外力作用對其反應(yīng)動力學(xué)的調(diào)控作用.另外,針對CD44?選擇素、CD44-HA 相互作用體系而言,雖然已有研究報道了二維條件下的相互作用強度及零力下負反應(yīng)率,但是負反應(yīng)率隨外力的變化規(guī)律則鮮有報道.需要說明的是,考慮到不同實驗條件、實驗手段之間的差異,導(dǎo)致無法對測量結(jié)果進行直接比較,所以這里沒有將選擇素與PSGL-1 相互作用的結(jié)果統(tǒng)計在內(nèi).

表1 基于表面等離子共振技術(shù)的不同分子體系三維反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)比較Table 1 Comparison of three-dimensional interaction kinetic parameters for different molecular systems based on SPR technology

表2 基于原子力顯微鏡技術(shù)的不同分子體系的二維反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)比較Table 2 Comparison of two-dimensional interaction kinetic parameters for different molecular systems based on AFM technology

除了上述二維、三維條件下分子層次定量反應(yīng)動力學(xué)測量,外力作用下CD44?配體相互作用介導(dǎo)的離體細胞層次粘附動力學(xué)也有系列報道,最典型的是模擬血流剪切的平板流動腔技術(shù).已有研究表明,雖然生理條件下CD44 同為三種選擇素的配體[73-74],但是其結(jié)合強度不盡相同.流體剪切條件下,結(jié)腸癌細胞LS17T,T84 等來源的CD44v 與選擇素相互作用介導(dǎo)的微珠滾動速度表現(xiàn)為E 選擇素最慢,次之是P選擇素,而L 選擇素最快[75-76].另一方面,流體剪切條件下,表達有CD44 的白血病細胞株KG-1a 在HA包被的底板上呈現(xiàn)多相粘附特征:在約0.2 dyn/cm2下發(fā)生滾動粘附,而且滾動細胞數(shù)目隨著流體剪切的增加而增加,在0.7～1.0 dyn/cm2時滾動細胞數(shù)量達到最高,然后隨著流體剪切的進一步增加滾動細胞數(shù)量逐漸減少,抗剪切能力甚至可達100 dyn/cm2[77].造血祖細胞在包被HA 的底板上也存在類似現(xiàn)象,最優(yōu)剪切力在1.0 dyn/cm2左右[78].此外,CD44 介導(dǎo)的人源膠質(zhì)母細胞瘤的粘附和遷移速度取決于HA 水凝膠的硬度[79],表明CD44-HA 相互作用除受流體剪切外,同時受到硬度等力學(xué)微環(huán)境的調(diào)控.值得注意的是,CD44-HA 相互作用介導(dǎo)的細胞粘附動力學(xué)隨流體剪切呈現(xiàn)的多相特征與選擇素?PSGL-1 相互作用介導(dǎo)的細胞粘附動力學(xué)類似,而該特征是由外力作用下選擇素與PSGL-1 相互作用的逆鎖鍵特征決定的[80].不同流體剪切條件下白細胞滾動動力學(xué)改變的研究結(jié)果表明,外力可以將HA-CD44 相互作用從低親和力狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)[81].而CD44?選擇素相互作用介導(dǎo)的細胞粘附動力學(xué)具有什么樣的特征？外力如何調(diào)控等問題,則鮮有報道.

2.3 高等數(shù)學(xué)的內(nèi)容主要是微積分學(xué)，對學(xué)生來說，數(shù)學(xué)概念很抽象，比如數(shù)列極限的“ε-N”定義，函數(shù)極限的“ε-δ”定義等，數(shù)學(xué)定理的證明邏輯推理很嚴密，翻轉(zhuǎn)課堂的課前學(xué)習(xí)環(huán)節(jié)如果沒有教師的及時有效地引導(dǎo)，僅憑觀看視頻，不易準確把握視頻中的重難點，甚至不能聽懂授課內(nèi)容，使學(xué)習(xí)效果不佳。

綜上所述,CD44 ?選擇素/HA 相互作用不論是在分子層次的反應(yīng)動力學(xué)還是在細胞層次的粘附動力學(xué),以及力學(xué)調(diào)控規(guī)律的研究還不完善.而CD44不同剪接體或糖基化修飾等的多樣性、HA 不同分子量大小或組裝方式,以及不同實驗條件、手段的差異等,導(dǎo)致現(xiàn)有數(shù)據(jù)之間難以進行直接比較,從而無法更好地闡釋其生物學(xué)功能.

4 CD44?配體相互作用的微觀結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

結(jié)構(gòu)決定功能,分子微觀結(jié)構(gòu)特征決定了分子間相互作用反應(yīng)動力學(xué),進而決定細胞層次粘附動力學(xué)及其生物學(xué)功能.因此,明確CD44?配體相互作用的微觀結(jié)構(gòu)特征有利于更好闡釋CD44?配體相互作用的差異以及在炎癥級聯(lián)反應(yīng)過程中的作用.已有研究通過系列氨基酸位點突變實驗表明CD44 胞外氨基末端的球狀結(jié)構(gòu)域(32～132 位氨基酸)是CD44 的配體—膠原蛋白,層粘連蛋白,纖連蛋白以及細胞表面受體(如E/L 選擇素)—的主要結(jié)合位點[82-83],且該結(jié)構(gòu)域內(nèi)的二硫鍵對于CD44 與HA 的結(jié)合也至關(guān)重要[84].此外,CD44 的胞外區(qū)有兩段高度保守的BX7B 多肽片段,其中一段為38～46 位氨基酸片段,參與其與HA 的結(jié)合(其中B 代表精氨酸Arg 或賴氨酸Lys,X7 代表任何7 個非酸性氨基酸).另一個BX7B 片段位于第一個片段“下游”約100 個氨基酸的位置,同樣可以與HA 作用[85].但是其微觀結(jié)構(gòu)特征尚不清楚.

目前報道的原子層次精細結(jié)構(gòu)主要包括CD44 N-末端的HABD(HA binding domain)結(jié)構(gòu)域[86],以及HABD-HA 相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)[87-88].通過比較HA 結(jié)合前后的構(gòu)象變化,提出了CD44-HABD結(jié)構(gòu)域存在兩種不同程度的變構(gòu)效應(yīng):一是HA 結(jié)合導(dǎo)致HABD 結(jié)構(gòu)域的Link domain C-末端擴展區(qū)的有序β9-sheet 變成高度無序的loop 區(qū),并從Link domain 脫離,而且HABD 的C-末端片段在HA 結(jié)合狀態(tài)下柔性增加.根據(jù)該構(gòu)象差異,將未結(jié)合狀態(tài)和HA 結(jié)合狀態(tài)下的HABD 構(gòu)象分別稱為“有序(O)”和“部分無序(PD)”構(gòu)象.超過90%的HABD 被認為在HA 結(jié)合狀態(tài)下采用PD 狀態(tài),也就是說PD 構(gòu)象具有更高的親和性[89].二是HA 的結(jié)合導(dǎo)致HABD上R45 位(人源蛋白對應(yīng)于R41 位)精氨酸位點附近的loop 區(qū)發(fā)生取向變化,進而導(dǎo)致其與HA 結(jié)合能力的調(diào)整[88](圖1(a)和圖1(b)).CD44-HA 相互作用主要是靜電與范德華相互作用,雖然通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段獲得的復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示HA 與HABD 的結(jié)合僅存在一種結(jié)合模式,而后續(xù)的分子模擬則預(yù)測HA與HABD 的結(jié)合可以存在3 種不同取向,分別是晶體結(jié)合模式,平行結(jié)合模式和直立結(jié)合模式,其中晶體結(jié)合模式結(jié)合能力最強,后兩個是亞穩(wěn)狀態(tài)[90],體現(xiàn)出CD44-HA 相互作用的復(fù)雜性.

HA 的結(jié)合可誘導(dǎo)CD44 構(gòu)象改變、進而調(diào)控其結(jié)合能力的觀點得到一系列研究的支持,并驗證了外力調(diào)控其相互作用的重要性.在此基礎(chǔ)上考察外力在CD44 介導(dǎo)的細胞(微珠)滾動中的作用,發(fā)現(xiàn)當HABD 通過C 末端標簽連接到微珠時,滾動行為僅在高剪切應(yīng)力時才穩(wěn)定發(fā)生,表明高剪切應(yīng)力下HABD 從O 構(gòu)象轉(zhuǎn)變到PD 構(gòu)象,增強了其與HA 的相互作用,從而更好地抵抗流體剪切的作用.而采用O 構(gòu)象或PD 構(gòu)象的HABD 突變體包被的微珠則沒有上述隨流體剪切增高而粘附增強的現(xiàn)象.分子動力學(xué)模擬表明,作用于C 末端的外力可破壞C 末端區(qū)域和該結(jié)構(gòu)域主體結(jié)構(gòu)之間的相互作用,從而實現(xiàn)了從HABD 結(jié)構(gòu)域從O 構(gòu)象態(tài)到PD 構(gòu)象態(tài)的變構(gòu);同時在C 末端施加的外力可更快地誘導(dǎo)高親和力PD 的構(gòu)象、增強HABD-HA 相互作用,從而更有效介導(dǎo)白細胞的炎癥反應(yīng)和造血祖細胞歸巢[81].此外,CD44-HA 相互作用介導(dǎo)的細胞粘附和遷移速度取決于HA 水凝膠的硬度,提示基于CD44 的信號傳導(dǎo)具有機械敏感性[79],進一步支持了力學(xué)因素調(diào)控CD44 不同親和態(tài)構(gòu)象進而調(diào)控其與HA 的結(jié)合能力的觀點.

圖1 CD44?配體相互作用的微觀結(jié)構(gòu)特征:(a)細胞粘附分子PSGL-1、CD44、E 選擇素與HA 的分布及相互作用網(wǎng)絡(luò);(b)PSGL-1 的N 末端糖基sLeX 作用在E 選擇素Lectin 結(jié)構(gòu)域的鈣離子附近;(c)HA 作用導(dǎo)致CD44 HABD 結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象改變Fig.1 Microstructural features of CD44?ligands interactions:(a)Schematic interaction network among PSGL-1,CD44,E-selectin and HA;(b)conformational allostery of CD44 HABD domain induced by HA binding;(c)crystalized E-selectin-sLeX interaction complex

雖然關(guān)于CD44 HABD 結(jié)構(gòu)域及HABD-HA 相互作用的微觀結(jié)構(gòu)特征有系列報道,但是CD44 其他結(jié)構(gòu)域或不同糖基化的微觀結(jié)構(gòu)特征及其對HA 結(jié)合的貢獻還不清楚.另外,盡管選擇素的微觀結(jié)構(gòu)研究相對完善,包括構(gòu)象動力學(xué)及其與配體PSGL-1 相互作用的特征[91-94](圖1(a)和圖1(b)),但是CD44 ?選擇素相互作用的微觀結(jié)構(gòu)特征還尚無報道.因此,進一步從微觀結(jié)構(gòu)層次考察CD44?選擇素相互作用特征及其力學(xué)調(diào)控規(guī)律,是深入理解其結(jié)構(gòu)功能?關(guān)系的基礎(chǔ).

5 CD44?配體相互作用介導(dǎo)的胞內(nèi)信號通路

HA 是與CD44 結(jié)合進而通過胞內(nèi)信號通路調(diào)控細胞遷移、生長與增殖等功能的主要配體之一.在調(diào)控細胞遷移方面:CD44 通過其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與細胞骨架相關(guān)蛋白相互作用進而調(diào)控細胞遷移[95-96].ERM 是橋接CD44 與胞質(zhì)肌動蛋白的主要蛋白之一[5],其結(jié)合位點位于CD44 胞質(zhì)段的堿性氨基酸序列[97].HA 結(jié)合CD44 導(dǎo)致蛋白激酶C(PKC)激活,使得CD44 胞內(nèi)端磷酸化,增強其與ERM 蛋白的結(jié)合,進而加強CD44 與細胞骨架的相互作用,促進細胞遷移[18,98-99].另外,HA 與CD44 的結(jié)合可以促進c-Src激酶募集至CD44 部位并激活c-Src,繼而增加細胞骨架蛋白cortactin 的酪氨酸磷酸化.Cortactin 的酪氨酸磷酸化減弱了其交聯(lián)絲狀肌動蛋白的能力,從而調(diào)節(jié)細胞的遷移能力,促進細胞的募集[100].HA 與CD44相互作用還可以激活Rho GTPase(如Cdc42,Rac1 等)信號,該信號通過不同的效應(yīng)分子來調(diào)控細胞骨架的重組,進而調(diào)控細胞遷移.HA-CD44 相互作用可以通過Cdc42 調(diào)節(jié)F 肌動蛋白進而調(diào)節(jié)細胞骨架,促進細胞的募集[101];HA 與某些表達CD44 的細胞結(jié)合也可激活Rac1 信號傳導(dǎo),進而調(diào)控細胞膜皺褶結(jié)構(gòu)或細胞運動.CD44v3 與Tiam1 之間的相互作用促進了Rac1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞骨架介導(dǎo)的乳腺腫瘤遷移[102].HA 的結(jié)合促進CD44 與癌蛋白Vav 家族成員Vav2 蛋白的相互作用,維持Rac1 和Ras 活化,促進卵巢腫瘤細胞生長和遷移增加[103](圖2(a)).另外,HA與CD44 相互作用還可通過不同信號通路調(diào)控細胞的生長、增殖、存活等.CD44-HA 相互作用可通過Rho 激活誘導(dǎo)PI3K,再由PI3K 激活絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt),進而促進細胞增殖和存活[104].同時,CD44還通過HA 合成酶HAS2,HA 及Akt 信號通路之間的正反饋回路誘導(dǎo)乳腺癌細胞中Akt 信號的持續(xù)激活,最終克服凋亡并維持細胞存活[105].外源性HA 通過骨髓巨噬細胞樣細胞上兩種不同的HA 受體增強造血功能.其中一種是HA?CD44 與激活p38 絲裂原活化蛋白(MAP)激酶的途徑相關(guān),CD44-HA 增強了細胞的增殖[106].HA?CD44 相互作用還可通過細胞外信號相關(guān)激酶1 和2(ERK1/2)介導(dǎo)內(nèi)皮細胞的活化和增殖[107];或通過激活ERK2,進一步磷酸化Elk-1,促進細胞遷移以及增殖[101].CD44 也可以作為共同受體而行使生物學(xué)功能,通過與肝細胞生長因子HGF 結(jié)合,CD44v6 與Met 以及HGF 形成三體復(fù)合物并促進Met 激活,去除CD44 胞質(zhì)尾部依舊可以激活Met,但需有CD44 胞質(zhì)尾部與ERM 蛋白相互作用、才能激活Ras-MAPK 途徑[108].CD44v6-ECM 結(jié)合還促進PI3K/Akt 途徑激活和Met 轉(zhuǎn)錄[109-110].

圖2 介導(dǎo)細胞粘附與遷移的CD44 胞內(nèi)信號通路:(a)HA 與CD44 相互作用啟動的CD44 胞內(nèi)信號通路;(b)E 選擇素與CD44 相互作用啟動的CD44 胞內(nèi)信號通路Fig.2 CD44?mediated intracellular signaling pathways for cell adhesion and migration:(a)CD44-HA interaction mediated intracellular signaling pathways;(b)CD44?E-selectin interaction mediated intracellular signaling pathways

另一蛋白Merlin 在CD44 胞內(nèi)端的結(jié)合位點與ERM 存在競爭性作用,Merlin 的激活發(fā)生在ERM 蛋白失活之后.Merlin 的激活引起皮質(zhì)肌動蛋白細胞骨架的重組,同時阻止Ras 激活以及Ras 依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo),并抑制了多種受體酪氨酸激酶的信號傳遞[5].絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK2 可使Merlin 磷酸化[111],但同時導(dǎo)致Merlin 失活并抑制其與CD44 的結(jié)合[99].高細胞密度或高分子量HA 的加入會觸發(fā)Merlin 的去磷酸化,從而導(dǎo)致生長抑制復(fù)合物的形成,使得細胞增殖受限[5].因此,ERM 蛋白和Merlin 蛋白具有控制細胞增殖的“開關(guān)”作用.

除上述HA 結(jié)合啟動CD44 胞內(nèi)信號通路在細胞生長、增殖、細胞骨架重組等過程中的作用外,CD44 作為細胞粘附分子則呈現(xiàn)出不同的信號通路.從現(xiàn)象上來講,CD44-HA 相互作用介導(dǎo)的T 細胞外滲同時依賴于整合素VLA-4 與配體VACM-1 相互作用[112],而CD44 胞內(nèi)端缺失則破壞了VLA-4 整合素介導(dǎo)的T 細胞穩(wěn)定粘附和外滲[113],提示CD44 可能通過胞內(nèi)某種信號通路與VLA-4 整合素協(xié)同作用.CD44-HA 相互作用也可增加整合素信號傳導(dǎo),從而導(dǎo)致細胞鋪展[114].高表達CD44 的結(jié)腸癌細胞通過CD44 交聯(lián)或低分子量HA 刺激可誘導(dǎo)β2整合素αLβ2的表達,并進一步通過αLβ2-ICAM-1 相互作用促進癌細胞在內(nèi)皮細胞上的粘附和跨內(nèi)皮遷移,通過加入PKC 酶抑制劑,可阻斷該過程的發(fā)生[115].類似地,CD44 交聯(lián)導(dǎo)致MDA-MB-435S 或Hs578T 乳腺癌細胞系上整合素αLβ2與VLA-4 表達上調(diào),并進一步通過整合素?配體相互作用促進乳腺癌細胞跨內(nèi)皮遷移[116](圖2(a)).E 選擇素結(jié)合也可觸發(fā)CD44 胞內(nèi)信號、從而激活整合素.E 選擇素與CD44 相互作用可以介導(dǎo)中性粒細胞的慢速滾動過程,其原因在于E 選擇素的結(jié)合可通過脂筏上CD44 胞內(nèi)端SFK →Syk →Btk →p38 的信號通路激活整合素αLβ2,進而通過αLβ2-ICAM-1 相互作用促進細胞的慢速滾動[31](圖2(b)).

正常生理條件下CD44 成簇定位于細胞膜脂筏上,因此脂筏的破壞與否對其與配體相互作用的能力、胞內(nèi)信號的傳遞及相應(yīng)生物學(xué)功能有明顯調(diào)控作用.通過甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)消耗膜膽固醇、降低CD44 在脂筏中的聚集,可增強T 細胞上CD44與HA 的結(jié)合,進而增加了生理流動條件下T 細胞發(fā)生滾動粘附的細胞數(shù)量[117].而高水平的膽固醇促進CD44 進入脂筏,CD44-Ezrin 結(jié)合力減弱,抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲[118].另外,多數(shù)Src 家族激酶可被特定的脂質(zhì)修飾,而這些脂質(zhì)可以將Src 激酶引導(dǎo)至具有高膽固醇和糖磷脂含量的脂筏區(qū)域.因此,CD44與脂筏中的c-Src 激酶直接結(jié)合可促進HA 介導(dǎo)的c-Src 激酶活性并介導(dǎo)細胞骨架調(diào)節(jié)的細胞遷移[119].高分子量HA 可以加強CD44 成簇,而HA 片段似乎沒有作用[120-121].有趣的是,寡糖HA 孵育細胞后,能夠減少先前由高分子量HA 誘導(dǎo)形成的CD44 簇[122].

簡言之,CD44 通過復(fù)雜的胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)細胞的生長、增殖、遷移等多種生物學(xué)過程,而且受到力學(xué)、CD44 糖修飾、CD44 簇集及不同配體作用等多種因素調(diào)控.作為細胞粘附分子,HA 或E 選擇素的結(jié)合均可通過CD44 胞內(nèi)信號通路激活整合素,進而通過整合素?配體相互作用實現(xiàn)免疫細胞募集、癌細胞遷移等過程的級聯(lián)反應(yīng).需要說明的是,就目前的報道可以發(fā)現(xiàn),HA 與CD44 相互作用主要是激活T 淋巴細胞或癌細胞上整合素的表達上調(diào),進而通過增強整合素?配體相互作用的親和力(avidity),促進細胞間粘附或跨膜遷移;而E 選擇素與CD44 相互作用則主要是激活中性粒細胞上整合素構(gòu)象的改變,進而通過增強整合素配體相互作用的親和性(affinity),促進細胞間的粘附或跨膜遷移,從而表明不同配體與CD44 相互作用介導(dǎo)不同的生物學(xué)功能.作為在肝臟免疫中起重要作用的分子體系,HA 與CD44 相互作用如何調(diào)控中性粒細胞在肝血竇內(nèi)的募集,其與整合素之間存在怎樣的協(xié)同作用等問題尚不清楚.

6 結(jié)論與展望

作為干細胞鑒定或疾病檢測、病程發(fā)生發(fā)展的標志物,胞內(nèi)多種復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)的觸發(fā)分子,以及介導(dǎo)細胞粘附的重要受體,CD44 分子的生物學(xué)重要性毋庸置疑,其相應(yīng)內(nèi)在機制的研究也日趨深入.隨著人們對生命活動規(guī)律及內(nèi)在機制認知的加深,研究者們逐漸認識到力學(xué)、物理因素對生命活動的不可或缺性,重要研究進展包括力學(xué)因素對發(fā)育[123-127]、遺傳[128]、免疫[129]等重要生命活動的調(diào)控,并催生了力學(xué)醫(yī)學(xué)、力學(xué)免疫學(xué)、力學(xué)組學(xué)新概念,發(fā)展了生物力學(xué)與力學(xué)生物學(xué)等交叉研究領(lǐng)域,但是其內(nèi)在機制還遠不清楚.如上所述,CD44 作為細胞膜表達分子,其與配體HA 或選擇素相互作用介導(dǎo)的細胞粘附受到生理力學(xué)、物理微環(huán)境的調(diào)控,包括流體剪切、基質(zhì)硬度等.

雖然目前關(guān)于CD44 與配體相互作用微觀結(jié)構(gòu)特征、分子反應(yīng)動力學(xué)、細胞粘附動力學(xué)及胞內(nèi)信號通路均有報道,但是力學(xué)因素調(diào)控CD44 與配體相互作用的規(guī)律及內(nèi)在機制還遠不清楚,均需深入研究.在不同力學(xué)因素對細胞粘附動力學(xué)的調(diào)控規(guī)律及內(nèi)在機制方面:主要包括外力作用下CD44 與選擇素相互作用介導(dǎo)的細胞粘附動力學(xué)具有什么樣的特征;外力作用下不同分子量膜定位的HA 與CD44相互作用介導(dǎo)的細胞粘附動力學(xué)差異;其不同組裝形式對細胞粘附的調(diào)控等.在分子相互作用反應(yīng)動力學(xué)的調(diào)控規(guī)律及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)方面:主要包括分子層次CD44 與選擇素/HA 相互作用的力學(xué)調(diào)控規(guī)律,及相互間的差異;不同分子量HA-CD44 相互作用的力學(xué)調(diào)控規(guī)律,及其組裝方式的影響;原子層次CD44與選擇素相互作用特征及其力學(xué)調(diào)控特征等.特別地,作為肝臟免疫過程中起重要作用的分子體系,尚待考察的問題包括其獨特力學(xué)、物理微環(huán)境如何調(diào)控CD44 與HA 相互作用介導(dǎo)的細胞粘附動力學(xué)？其生物學(xué)功能如何體現(xiàn)其組織特異性等.