川芎嗪通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕小腸缺血再灌注損傷的研究

孔維，尹清臣

小腸缺血再灌注損傷是腸道手術(shù)、創(chuàng)傷、休克、心功能不全等常見并發(fā)癥，導(dǎo)致腸黏膜屏障受損使腸道內(nèi)細(xì)菌、毒素進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)并誘發(fā)細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致患者死亡的重要因素[1-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路[5-6]。因此，以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為切入點(diǎn)，研究能夠防治小腸缺血再灌注損傷的新型藥物具有重要的臨床意義。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)是從我國傳統(tǒng)中藥川芎中提取的一種活性生物堿，化學(xué)名 2,3,5,6-四甲基吡嗪，具有良好的抗炎、抗凋亡活性[7-8]。本研究在小腸缺血再灌注損傷大鼠模型造模前給予TMP預(yù)處理，研究TMP對(duì)小腸缺血再灌注損傷及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

無病原微生物級(jí)雄性Wistar大鼠120只，體質(zhì)量(220～240)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(冀)2018-004，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食禁水。將120只大鼠數(shù)字編碼后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和TMP低、中、高(15、30、60 mg/kg)劑量組[8]，每組24只。

1.2 藥物與試劑

磷酸川芎嗪注射液(TMP，規(guī)格2 mL∶50 mg)購自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司(批號(hào)20191219)；CRP(貨號(hào)：H126，批號(hào)：191228)、TNF-α(貨號(hào)：H052，批號(hào)：191017)、IL-1β(貨號(hào)：H002，批號(hào)：200114)；酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)試劑盒和TUNEL試劑盒(貨號(hào)：G001-2-2，批號(hào)：191125)購自南京建成生物工程研究所；糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)抗體(貨號(hào)：bs-1219R，批號(hào)：20191208)、增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)抗體(貨號(hào)：bs-1630R，批號(hào)：20200107)、激活型半胱氨酸蛋白酶-12(Cleved Caspase-12)抗體(貨號(hào)：bs-1105R，批號(hào)：20200311)、Cleved Caspase-3抗體(貨號(hào)：bs-0081R，批號(hào)：20191108)、核因子-κB(NF-κB)抗體(貨號(hào)：bs-0465R，批號(hào)：20191216)和山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)：bs-0294P，批號(hào)：20191125)購自北京博奧森生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒(貨號(hào)：ZLI-9017，批號(hào)：190426)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

VARIOSKANLUX型多功能酶標(biāo)儀(美國 Thermo Scientific 公司)；HM340E石蠟切片機(jī)(德國Thermo Scientific公司)；SE300型蛋白質(zhì)電泳儀(美國 Hoefer 公司)；5427R型低溫高速離心機(jī)(德國Eppendrof公司)；DYCZ-40D型電泳槽(北京六一儀器廠)；CFX型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 給藥與模型制備 造模前30 min，TMP低、中、高劑量組分別腹腔注射15、30、60 mg/kg劑量的TMP，假手術(shù)組和模型組腹腔注射給予生理鹽水。模型組和TMP低、中、高劑量組采用夾閉腸系膜上動(dòng)脈60 min的方法復(fù)制小腸缺血再灌注大鼠模型；假手術(shù)組不夾閉腸系膜上動(dòng)脈外，其余操作同模型組。再灌注2 h后，麻醉后脊椎脫臼處死，開腹剪取回盲部10 cm以上部分腸管，行各指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.2 腸組織含水量的測(cè)定 隨機(jī)取各組8只大鼠的腸管，用生理鹽水沖洗內(nèi)容物與血液后濾紙拭干，稱重為濕重(W1)；置95 ℃烤箱至恒重后稱重為干重(W2)，含水量(%)= [(W1-W2)/W1]×100%。

1.4.3 腸組織病理學(xué)檢查及Chiu′s氏評(píng)分 隨機(jī)取各組8只大鼠的腸管，用生理鹽水沖洗內(nèi)容物與血液，置4%多聚甲醛溶液固定3 d，石蠟包埋、切片(4 μm)、展片、二甲苯透明和梯度乙醇脫水后，行常規(guī)HE染色、中性樹脂封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察腸組織病理學(xué)改變。Chiu′s氏評(píng)分[9]：未見異常計(jì)0分，腸黏膜絨毛頂端上皮下間隙增寬計(jì)1分，絨毛尖端上皮抬高與固有層剝離計(jì)2分，絨毛兩側(cè)上皮成塊脫落計(jì)3分，上皮完全脫落計(jì)4分，黏膜固有層崩解并出血計(jì)5分。

1.4.4 細(xì)胞凋亡觀察及凋亡指數(shù)(AI)的計(jì)算 取經(jīng)二甲苯透明和梯度乙醇脫水后的腸組織石蠟切片，參照TUNEL試劑盒操作說明進(jìn)行處理，50%甘油封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡狀況；分別計(jì)數(shù)視野中總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核黃褐色為凋亡細(xì)胞)，AI(%)=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.5 腸組織炎癥因子水平檢測(cè) 取各組剩余的8只大鼠的腸管，用4 ℃預(yù)冷生理鹽水將腸內(nèi)容物和血液沖洗干凈后，加入9倍量4 ℃預(yù)冷裂解液行研磨勻漿，3 000 rpm離心取上清(轉(zhuǎn)速3 000 rpm，時(shí)間10 min)，按照ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行處理后，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)腸組織CRP、TNF-α、IL-1β含量。

1.4.6 腸組織蛋白表達(dá)檢測(cè) 取已制備的腸組織勻漿液，4 ℃離心取上清液(轉(zhuǎn)速12 000 rpm，時(shí)間20 min)，BCA法檢測(cè)總蛋白含量、95 ℃水浴使蛋白變性后，以30 μg蛋白量上樣、SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉溶液37 ℃封閉1 h，洗膜后滴加GRP78、CHOP、Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB、β-actin抗體4 ℃孵育過夜，洗膜后滴加二抗37 ℃孵育1 h，洗膜后滴加DAB溶液顯色，以β-actin為內(nèi)參半定量GRP78、CHOP、Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腸組織含水量比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腸組織含水量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，TMP中、高劑量組腸組織含水量顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.2 各組大鼠腸組織病變及Chiu′s氏評(píng)分比較

假手術(shù)組大鼠腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常；模型組呈現(xiàn)腸系膜結(jié)構(gòu)紊亂、上皮細(xì)胞脫落、固有層分離、大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等病變；與模型組比較，TMP低、中、高劑量組大鼠腸組織上述病變明顯減輕，其中TMP高劑量組腸系膜結(jié)構(gòu)清晰、未見固有層分離、中性粒細(xì)胞明顯減少。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Chiu′s氏評(píng)分顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TMP中、高劑量組Chiu′s氏評(píng)分顯著降低(P<0.01)。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠腸組織病變比較(HE，×200) A：假手術(shù)組；B：模型組；C：TMP低劑量組；D：TMP中劑量組；E：TMP高劑量組

2.3 各組大鼠腸細(xì)胞凋亡狀況及AI比較

假手術(shù)組大鼠可見極少量散在的腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡；模型組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，AI較假手術(shù)組顯著升高[(41.50±6.02)%vs(3.42±0.58)%，P<0.01]；TMP低、中、高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)量不同程度減少，其中TMP中、高劑量組AI較模型組顯著降低[(22.65±4.37)%、(14.28±2.65)%vs(41.50±6.02)%，P<0.01]。見圖2、表1。

表1 各組大鼠腸組織含水量、Chiu′s氏評(píng)分和AI 比較

圖2 各組大鼠腸細(xì)胞凋亡狀況比較(TUNEL，×200) A：假手術(shù)組；B：模型組；C：TMP低劑量組；D：TMP中劑量組；E：TMP高劑量組

2.4 各組大鼠腸組織炎癥因子水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腸組織炎癥因子CRP、TNF-α、IL-1β含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TMP中、高劑量組CRP、TNF-α、IL-1β含量顯著降低(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠腸組織炎癥因子水平比較

2.5 各組大鼠腸組織GRP78、CHOP蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腸組織GRP78、CHOP表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，TMP低、中、高劑量組GRP78、CHOP表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),見圖3、表3。

圖3 各組大鼠腸組織GRP78、CHOP蛋白表達(dá)比較 A：假手術(shù)組；B：模型組；C：TMP低劑量組；D：TMP中劑量組；E：TMP高劑量組

表3 各組大鼠腸組織GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平比較

2.6 各組大鼠腸組織Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腸組織Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，TMP中、高劑量組Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),見圖4、表4。

圖4 各組大鼠腸組織Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá) A：假手術(shù)組；B：模型組；C：TMP低劑量組；D：TMP中劑量組；E：TMP高劑量組

表4 各組大鼠腸組織Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

小腸是機(jī)體消化吸收的主要場(chǎng)所，擁有豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，對(duì)缺血缺氧極為敏感。小腸缺血再灌注損傷是臨床常見并發(fā)癥，在腸道術(shù)后及創(chuàng)傷、休克、心功能不全等重癥疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。因此，防治小腸缺血再灌注損傷對(duì)改善危重病患者轉(zhuǎn)歸具有積極意義。

隨著國家振興中醫(yī)藥戰(zhàn)略的實(shí)施以及中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的深入，中藥治療消化系統(tǒng)疾病逐漸得到人們的關(guān)注與認(rèn)可。川芎為傘形科蒿本屬植物，主產(chǎn)于四川，為我國傳統(tǒng)中藥品種，《本經(jīng)》、《吳普本草》、《唐本草》等醫(yī)學(xué)典籍中均有記載，性溫、味辛，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效。TMP是提取于川芎的一種活性生物堿，目前臨床主要用于缺血性腦血管病的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TMP能夠通過抑制炎癥和細(xì)胞凋亡而對(duì)心肌、腎臟缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用[10-11]。而腸黏膜屏障受損致使腸道內(nèi)毒素、細(xì)菌進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合癥和細(xì)胞凋亡是小腸缺血再灌注損傷重要病理通路[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TMP干預(yù)能夠明顯降低小腸缺血再灌注大鼠腸組織含水量，抑制腸系膜上皮細(xì)胞脫落、固有層分離、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等病變，降低Chiu′s氏評(píng)分，抑制腸細(xì)胞凋亡并明顯降低AI，提示TMP對(duì)大鼠小腸缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

組織缺血缺氧及實(shí)現(xiàn)再灌注后將病理性刺激炎癥因子(CRP、TNF-α、IL-1β等)大量釋放而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，其中TNF-α、IL-1β做為炎性趨化因子能夠刺激粒細(xì)胞進(jìn)一步合成與釋放炎癥因子，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TMP干預(yù)能夠顯著降低小腸缺血再灌注損傷大鼠腸組織炎癥因子CRP、TNF-α、IL-1β水平，提示TMP對(duì)小腸缺血再灌注后炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是普遍存在于真核細(xì)胞中一種膜性細(xì)胞器，是機(jī)體調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的重要通路。龐志路等[15]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在小腸缺血再灌注損傷進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。GRP78是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子伴侶蛋白，對(duì)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Yang等[16]和余琴華等[17]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)病理性刺激細(xì)胞導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激時(shí)，導(dǎo)致大量錯(cuò)誤折疊和未折疊的蛋白蓄積，進(jìn)而誘導(dǎo)GRP78大量合成，因此GRP7升高可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志檢測(cè)物質(zhì)。CHOP是重要的促凋亡信號(hào)分子，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將誘導(dǎo)CHOP上調(diào)表達(dá)，激活Caspase-12(Cleved Caspase-12)，并且Cleved Caspase-12能夠剪切并活化Caspase-3(Cleved Caspase-3)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18-19]。NF-κB能夠刺激炎癥因子釋放，任國強(qiáng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB表達(dá)能夠顯著降低心肌缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TMP干預(yù)能夠明顯下調(diào)小腸缺血再灌注大鼠腸組織GRP78、CHOP、Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)，這可能是TMP抑制小腸缺血再灌注后炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制。

綜上所述，TMP能夠通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)炎癥和細(xì)胞凋亡通路，對(duì)小腸缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。