基于Nrf2-Keap1-ARE信號通路探討疏肝健脾方對腸易激綜合征大鼠內臟敏感性的影響

朱琳，馮燕，李佳

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種腸道功能紊亂性疾病，主要表現(xiàn)為腹痛、腹脹、不正常排便以及大便性狀改變等癥狀[1]。腹瀉型、便秘型和混合型是臨床上IBS的三種主要類型[2]。內臟高敏感性是IBS發(fā)病的主要原因[3]。IBS在中國總患病率高達6.5%，消化內科門診病患中有50%左右是IBS患者，且患病人數(shù)逐年增加，平均每年增長0.2%，目前，IBS已成為全球性的胃腸功能性疾病[4]。IBS是一種身心疾患，雖不威脅患者的生命，但卻給患者的生活造成嚴重的影響，且容易反復發(fā)作，給個人、家庭造成了巨大的經(jīng)濟和精神負擔。目前尚未闡明IBS的病因及發(fā)病機制，IBS的發(fā)生與遺傳、飲食健康、精神負擔、生活習慣、內分泌、免疫等多種因素有關，IBS的病理生理特征主要是內臟敏感性增高和結腸動力學紊亂[5]。IBS患者的腸道會發(fā)生不同程度的應激反應，對患者的康復和預后的影響最嚴重的是氧化應激反應[6]。氧化應激可以通過多種機制參與IBS的發(fā)病，但其具體機制仍不清楚。有關報道稱[7]，核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1(epoxy chloropropane Kelch sample related protein-1，Keap1)-抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)信號通路在抗氧化應激中發(fā)揮重要作用，其調控的下游抗氧化蛋白/酶和Ⅱ相代謝酶在細胞防御保護中發(fā)揮重要作用，也是近幾年抗氧化研究領域的熱點。疏肝健脾法對改善IBS的癥狀具有突出的臨床療效[8]，其治療作用是否與對內臟敏感性的調節(jié)有關，值得進一步探討其作用機制。本研究旨在從Nrf2-Keap1-ARE信號通路揭示疏肝健脾方對IBS大鼠內臟敏感性的干預作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(動物合格證：SYXK(京)2018-0042)，體質量為180～220 g，飼養(yǎng)于邯鄲市第一醫(yī)院動物實驗中心，飼養(yǎng)室保持良好通風，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25±2)℃，濕度(50±10)%，12 h 循環(huán)光照。正常飼養(yǎng)1周以適應環(huán)境，第2周開始進行實驗。40只大鼠隨機分為空白組、模型組、疏肝健脾方組和陽性對照組，每組10只。

1.2 藥品與主要試劑

疏肝健脾方：土炒白術50 g，茯苓50 g，白芍50 g，黃茂50 g，積殼50 g，陳皮50 g，炙甘草25 g，飲片購自康美藥業(yè)股份有限公司。將上述藥物浸泡于600 mL清水中20 min，煎藥后過濾，獲得200 mL藥液，原藥液濃度為1.625 g/mL，冷卻后4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

匹維溴銨(廠家：法國蘇威制藥廠，批號：H20120759，規(guī)格：50 mg/片)：將1片匹維溴銨研磨成細粉，加入50 mL 0.9%氯化鈉溶液，用潔凈玻璃棒攪拌直至完全溶解。

GAS、MTL、SP和SS ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物)，MDA、SOD、NO檢測試劑盒(美國Abcam)，兔抗小鼠p-Nrf2抗體(上海滬崢生物科技有限公司，產(chǎn)品貨號：HZK-11834)，兔抗大鼠p-Keap1抗體(北京義翹神州科技股份有限公司，產(chǎn)品貨號：101205-T10)，兔抗大鼠p-ARE抗體(Thermo Fisher公司，產(chǎn)品貨號：MA119728)，兔抗大鼠ZO-1抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，產(chǎn)品貨號：FNab09750)，兔抗大鼠Occludin抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，產(chǎn)品貨號：FNab05957)，兔抗山羊生物素抗體(北京百奧萊博科技有限公司，產(chǎn)品貨號：BL0945-WBX)，總蛋白提取試劑盒(上海恒遠生物)，BCA蛋白定量試劑盒(北京博凌科為生物)。

1.3 動物模型建立

IBS內臟高敏感性大鼠模型的制備采用4%醋酸灌腸聯(lián)合慢性心理應激法[9]。4%醋酸灌腸：將禁食1 d的大鼠用乙醚麻醉，6 F嬰兒導尿管上涂抹有潤滑劑插入6 cm，空白組和模型組分別注入1 mL 0.9%氯化鈉溶液、4%醋酸溶液，30 s后注入0.9%氯化鈉溶液1 mL將存留液體沖洗掉。慢性心理應激法：氣味刺激、潮濕環(huán)境、晝夜顛倒、聲波刺激、電擊、束縛、強光及閃爍燈照射、禁水、禁食、擁擠、夾尾、噪聲和鼠籠傾斜。應激處理每天上午和下午各隨機安排1種，共處理14 d，同種方法不能連續(xù)出現(xiàn)。以糞便含水率評價模型，糞便含水率較空白組顯著增加為模型建立成功。

1.4 給藥方法

IBS內臟高敏感性大鼠模型制備完成后第4天開始灌胃給藥治療，連續(xù)10 d，每天2次?？瞻捉M和模型組按5 mL/kg的劑量灌0.9%氯化鈉溶液，疏肝健脾方組按5 mL/kg的劑量給疏肝健脾方，陽性對照組按2 mg/kg的劑量給匹維溴銨。

1.5 糞便含水率檢測

藥物治療結束當天檢測大鼠糞便含水率。提尾刺激大鼠排便，收集大鼠糞便。用微量電子天平稱重并記錄數(shù)據(jù)后，烘箱干燥直至糞便重量不再變化，記錄數(shù)據(jù)。糞便含水率=(糞便鮮重-糞便干重)/糞便鮮重×100%。

1.6 內臟敏感性檢測

參照文獻[10]的檢測方法，用乙醚麻醉，肛門處用絡合碘消毒，在2 F雙腔導尿管上涂抹石蠟潤滑，插入大鼠肛門，氣囊末端剩余1 cm后固定。將蘇醒后的大鼠放入 20 cm×5 cm×8 cm的透明塑料籠內，向安靜大鼠的氣囊內緩慢注水，觀察大鼠腹部抬起和背部拱起，持續(xù)20 s并分別記錄所需注水量，實驗重復3次，數(shù)據(jù)取3次的平均值。

1.7 大鼠結腸組織HE染色

結直腸組織在多聚甲醛中浸泡48 h后，經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋，切成4 μm的切片。然后依次脫蠟、水化，進行HE染色、脫水、二甲苯透明、干燥。中性樹膠封片，用光學顯微鏡觀察結腸組織形態(tài)并拍攝照片。

1.8 血清胃腸激素水平的檢測

采用腹腔注射350 mg/kg的10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹主動脈采血3 mL，加肝素鈉抗凝，離心(3 000 r/min，15 min)后取上清，-80 ℃凍存。采用ELISA法檢測血清胃泌素(gastrin，GAS)、胃動素(motilin，MTL)、P物質(substance P，SP)、生長抑素(somatostatin，SS)水平。

1.9 大鼠血清中氧化應激指標的含量測定

大鼠血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定用硫代巴比妥酸酸法，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)采用黃嘌呤氧化酶法測定，一氧化氮(nitric oxide，NO)測定采用硝酸還原酶法，以上三種氧化應激指標測定均按照美國Abcam試劑盒的說明書進行操作。

1.10 免疫熒光法檢測ZO-1、Occludin蛋白變化

制備結腸組織石蠟切片，60 ℃烤片2 h，恢復至常溫后脫水，二甲苯脫蠟，PBS洗滌，抗原修復，PBS洗滌，1% BSA封閉20 min，一抗體中孵育1.5 h，PBS洗滌，二抗中孵育30 min，PBS洗滌，熒光顯微鏡觀察蛋白形態(tài)變化。采用免疫熒光的方法觀察各組大鼠結腸黏膜上皮ZO-1、Occludin的表達，并運用圖像分析軟件進行平均光密度測定。

1.11 Western blotting檢測大鼠結直腸組織Nrf2-Keap1-ARE通路蛋白表達

從冰箱中取出大鼠結腸組織，裂解后離心留取上清，測定總蛋白濃度后，取50 μg樣品，進行電泳，轉模，封閉，加入一抗(均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗，顯色，成像，Image軟件分析各條帶的灰度值，以GAPDH作為內參，獲得蛋白的相對表達水平。

1.12 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 疏肝健脾方對糞便含水量的影響

造模完成后，模型組、疏肝健脾方組、陽性對照組的大鼠糞便含水率較空白組均明顯上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明IBS大鼠模型制備成功；藥物治療后，與模型組相比，陽性對照組和疏肝健脾方組大鼠的糞便含水率顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠糞便含水率比較 A：造模完成后大鼠糞便含水率；B：治療后大鼠糞便含水率。與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

2.2 大鼠內臟敏感性比較

與空白組相比，模型組大鼠的腹部抬起和背部拱起程度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，疏肝健脾組和陽性對照組大鼠的腹部抬起和背部拱起程度明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 治療后各組大鼠內臟敏感性比較 A：腹部抬起比較；B：背部拱起比較。與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

2.3 疏肝健脾方對結腸組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠結腸組織結構正常，結腸黏膜完整，黏膜上皮完整、連續(xù)，呈單程柱狀，腺體排列規(guī)則，結構清晰，固有層可見黏膜肌層；模型組大部分腺體排列紊亂，邊界不清晰，固有層幾乎無可見黏膜肌層，有明顯的炎細胞浸潤，黏膜下層部分可見血管增生；疏肝健脾組和陽性對照組結腸組織病理形態(tài)有明顯的改善，腺體增生愈合，排列整齊，結構清晰完整，無明顯的炎性細胞浸潤等現(xiàn)象，見圖3。

圖3 大鼠結腸組織病理HE染色(×200) A：空白組；B：模型組；C：疏肝健脾方組；D：陽性對照組。

2.4 血清胃腸激素水平比較

模型組血清GAS和MTL水平均明顯低于空白組，SP和SS水平均明顯高于空白組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；疏肝健脾組和陽性對照組血清GAS、MTL水平均明顯高于模型組(P<0.05)，SP和SS水平均明顯低于模型組(P<0.05)，見圖4。

圖4 血清為腸激素水平比較 A：GAS水平；B：MTL水平；C：SP水平；D：SS水平。與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

2.5 大鼠血清中MDA、SOD、NO的含量測定

與空白組相比，模型組大鼠血清中SOD、NO的含量明顯降低，MDA的含量增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比，疏肝健脾方組和陽性對照組的SOD和NO的含量增加，MDA含量降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 大鼠血清中MDA、SOD、NO水平的比較 A：MDA含量；B：SOD含量；C：NO含量。與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05

2.6 大鼠結腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Occludin免疫熒光

通過對大鼠結腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1和Occludin進行免疫熒光標記，空白組結腸黏膜的ZO-1、Occludin為環(huán)狀結構且排列緊密、連續(xù)，而模型組的緊密連接蛋白形狀不規(guī)則，分散在細胞外圍，幾乎被完全破壞，熒光染色暗淡，蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比較，疏肝健脾方組和陽性對照組的ZO-1、 Occludin損傷程度明顯減輕，蛋白表達水平增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 免疫熒光法檢測大鼠結腸黏膜ZO-1、Occludin蛋白的損傷 A：ZO-1、Occludin蛋白免疫熒光結果(×400)；B：ZO-1、Occludin蛋白平均吸光度比較。與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05

2.6 p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白在大鼠結腸組織中的表達變化

Western blotting檢測小鼠結腸組織中空白組、模型組、疏肝健脾組及陽性對照組中p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白的表達水平變化。與空白組相比，模型組中p-Nrf2和p-Keap1、p-ARE蛋白表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，疏肝健脾組和陽性對照組p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白表達水平均下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白在大鼠結腸組織中的表達變化 A：Western blotting檢測p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白的表達；B：p-Nrf2、p-Keap1、p-ARE蛋白相對表達量。與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

3 討論

近年來IBS的患病率逐年上升，流行病學調查結果顯示，我國IBS患病率高達6.5%。IBS降低患者的生活質量，增加經(jīng)濟負擔和精神壓力。目前西醫(yī)針對IBS的治療措施主要是對癥治療，不能從根本上達到治療的目的[11]。研究表明[12]，中醫(yī)藥治療可以有效改善患者的腸道功能紊亂癥狀，提高患者的生活質量，降低復發(fā)率，具有獨特的優(yōu)勢。許多研究顯示[13]，中醫(yī)藥疏肝健脾方應用于臨床上對于治療IBS具有良好的療效。本研究首先成功構建大鼠IBS模型，并于一段時間后給予疏肝健脾方治療，發(fā)現(xiàn)與未獲得治療的大鼠相比，疏肝健脾方治療后的大鼠精神狀態(tài)、活動、飲食等情況均明顯好轉。觀察期內糞便含水量在治療后也逐步減少，大鼠內臟敏感性降低，血清胃腸激素水平趨于正常，氧化應激水平降低，證明疏肝健脾方對IBS大鼠具有較好的治療作用。徐浩東等[14]研究通過將疏肝健脾理腸方與雙歧桿菌四聯(lián)活菌片治療進行比較，發(fā)現(xiàn)疏肝健脾理腸方治療IBS的臨床療效更顯著(P<0.05)，且治療后IBS癥狀和軀體化癥狀均有明顯好轉，但尚未闡明其作用機制。因此本研究進一步探究疏肝健脾方對IBS的療效及其相關的分子機制。

內源性抗氧化信號通路中最重要的是Nrf2-Keap1-ARE信號通路，是近幾年抗氧化領域的研究熱點，可抵抗內外界各種因素刺激引起的氧化應激反應，防御外來損傷[15]。Nrf2廣泛存在于機體的各個器官中，是CNC調節(jié)蛋白家族的成員，主要調節(jié)細胞的氧化還原反應[16]。Keap1是Nrf2的抑制劑，正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1結合，以非活性狀態(tài)存在于胞漿中[17]。當細胞受到刺激后，例如活性氧(ROS)刺激，Keap1與Nrf2解離，Nrf2以活性狀態(tài)存在于細胞中并進入細胞核，依次與Maf、ARE結合，啟動下游抗氧化蛋白/酶和Ⅱ相代謝酶表達，調控其轉錄活性，調節(jié)機體內氧化還原水平使其達到平衡狀態(tài)，從而發(fā)揮抗氧化損傷的作用[18]。SOD是體內酶抗氧化系統(tǒng)中的重要成員，能清除體內自由基從而保護細胞免于損害；MDA是體內過氧化脂質代謝產(chǎn)物，其含量間接反映機體氧自由基含量和細胞損傷程度；NO起到對血管內皮細胞的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組較空白組的MDA含量增加，SOD、NO的含量降低，Nrf2-Keap1-ARE通路蛋白的表達水平上升，表明IBS的發(fā)生與氧化應激及Nrf2-Keap1-ARE信號通路有關，用疏肝健脾方治療后，MDA的含量較模型組明顯降低，SOD、NO含量明顯增加，通路蛋白的表達水平下降，表明疏肝健脾方能夠作用于Nrf2-Keap1-ARE信號通路，調節(jié)大鼠體內氧化應激水平并起到治療的作用。

大鼠結腸黏膜上皮細胞間的緊密連接(Tight junction，TJ)是結腸黏膜屏障的重要組成部分，它位于相鄰細胞間隙的頂端側面，主要由Occludin、ZOs等蛋白組成，其主要功能是調節(jié)滲透性和維持細胞極性[19]。研究表明[20]，緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的減少會導致PI-IBS小鼠糞便含水率升高和內臟敏感性增加。研究發(fā)現(xiàn)[21]，氧化應激導致豬小腸上皮細胞生長抑制及TJ 蛋白 Occludin、ZO- 1的基因表達水平下調，造成豬小腸上皮細胞通透性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，疏肝健脾方治療前大鼠結腸黏膜ZO-1、Occuldin 蛋白幾乎完全被破壞，表達水平降低，治療后與模型組比較，ZO-1、Occludin蛋白的損傷程度明顯減輕，僅局部被破壞，蛋白表達水平上升。表明疏肝健脾方可通過修復ZO-1、Occludin蛋白損傷，增加小腸上皮細胞通透性，降低內臟敏感性，發(fā)揮對結腸黏膜的保護作用。

綜上所述，疏肝健脾方能夠有效改善大鼠IBS情況，降低氧化應激水平及結腸黏膜緊密連接蛋白的損傷程度，其機制可能與Nrf2-Keap1-ARE信號通路的調控有關。