基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別的川芎炮制前后對比研究

裴 科，寧 燕，蔡 皓，郭 帥，張秋月，曹麗瓏，趙婷婷，曹 崗，張朔生，王穎莉*

1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西省現(xiàn)代中藥工程實(shí)驗室，山西 晉中 030619

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023

3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥炮制研究中心，浙江 杭州 310053

川芎（Chuanxiong Rhizoma，CR）為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，性溫味辛[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效。現(xiàn)代研究表明，川芎具有保護(hù)心腦血管[2]、抗腫瘤[3]、抗炎[4]、抗氧化[5]、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[6]等藥理作用，主要含有苯酞類[7]、生物堿類、有機(jī)酚酸及其酯類、多糖類等成分[8]。現(xiàn)《中國藥典》收載的川芎飲片為生品川芎（rawChuanxiong Rhizoma，rCR），然而川芎的炮制歷史悠久，據(jù)本草考證，酒炙川芎（wine processedChuanxiong Rhizoma，wpCR）自宋代以來一直沿用至今，酒炙能引藥上行，增強(qiáng)川芎活血行氣、散瘀止痛的作用[9-10]。川芎炮制后化學(xué)成分的變化是藥效變化的重要因素[11-12]。有關(guān)川芎的炮制方法及炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，《中國藥典》還未進(jìn)行收載，而且在《全國中藥炮制規(guī)范》和各省、市、自治區(qū)的中藥飲片炮制規(guī)范中對于川芎酒炙品的制備也只是簡單表述，如黃酒拌勻，悶透，文火炒干。此外各地對于川芎酒炙過程中的監(jiān)測指標(biāo)及工藝的具體量化參數(shù)也沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究根據(jù)“文火”的溫度規(guī)定（80～120 ℃）以及前期條件的摸索，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗條件下，100 ℃下炒制酒川芎，不易出現(xiàn)外焦里濕現(xiàn)象，且能達(dá)到飲片炒干顏色加深的效果。因此本實(shí)驗的炮制不同程度均指100 ℃下的不同炒制程度。

中藥指紋圖譜技術(shù)是一種有效的中藥質(zhì)量評價方法，已被國內(nèi)外廣泛認(rèn)可[13-14]。模式識別技術(shù)（pattern recognition）是化學(xué)計量學(xué)的重要組成部分，也是篩選中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-markers）的重要多元統(tǒng)計方法[15]。指紋圖譜結(jié)合模式識別可有效對中藥炮制前后的生品及制品進(jìn)行判別分析和質(zhì)量評價，并篩選出質(zhì)量差異性成分[16-17]。

關(guān)于川芎藥材指紋圖譜的研究已有報道[18-20]，但通過指紋圖譜方法對川芎的炮制程度進(jìn)行質(zhì)量控制，并結(jié)合多元統(tǒng)計分析對生品和炮制品建模，且應(yīng)用于炮制程度的判斷還未見報道。本實(shí)驗利用HPLC 法建立了川芎生品及不同程度炮制品的指紋圖譜，對炮制前后的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行對比，從整體水平表征炮制前后化學(xué)成分發(fā)生的變化。同時利用聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等模式識別方法，對生品和炮制品進(jìn)行識別歸類，并篩選導(dǎo)致二者差異性的主要標(biāo)志物，為規(guī)范川芎炮制工藝提供新的視角，并為炮制品質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

e2695 高效液相色譜儀，包括2998 型PDA 檢測器，Empower 工作站，美國Waters 公司；Hypersil Gold C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），賽默飛世爾科技有限公司；HC-2518 高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；EX225D 十萬分之一電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司。

1.2 試劑

對照品阿魏酸（批號110773-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品丁烯基苯肽（批號D-057-180321）、藁本內(nèi)酯（批號G-010-171216）、洋川芎內(nèi)酯A（批號Y-083-181011）、洋川芎內(nèi)酯I（批號Y-085-181011）、阿魏酸松柏酯（批號A-001-171103），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98.0%，均購自成都瑞芬思生物科技有限公司。雕王黃酒（批號GBIT13662，酒精度12%），紹興吳越釀酒有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 試藥

13 批生品川芎產(chǎn)地均為四川，來源于安國市萬順達(dá)藥材行，批號分別為20190516、20190522、20190613、20190715、20190803、20190814、20190825、20190912、20190919、20191001、20191021、20191213、20191227，分別編號為rCR1～rCR13，其中10 批rCR1～rCR10 用來建立指紋圖譜，并進(jìn)行HCA、PCA 建模以及OPLS-DA 等，3批rCR11～rCR13 用來進(jìn)行PCA 模型的預(yù)測；制備上述生川芎對應(yīng)的最佳炮制時間下的酒川芎，分別編號為wpCR1～wpCR13，其中10 批wpCR1～wpCR10 用來建立指紋圖譜，并進(jìn)行HCA、PCA 建模以及OPLS-DA 等，3 批wpCR11～wpCR13 用來進(jìn)行PCA 模型的預(yù)測；將批號為 20191021、20191213、20191227 的生川芎飲片分別制備炮制程度不及（炮制時間為10 min）樣品，編號分別為wpCR11’～wpCR13’，以及炮制程度過度（炮制時間為 30 min）樣品，編號分別為 wpCR14’～wpCR16’，用來進(jìn)行炮制過程中炮制程度的建?？刂?。5 批市售酒川芎（marketed wine processedChuanxiong Rhizoma，mwpCR）產(chǎn)地也為四川，3批來源于亳州市譙城區(qū)康美中藥材交易中心，批號分別為20201111、20201120、20201016，1 批來源于安徽廣和中藥股份有限公司，批號為200618，1批來源于揭陽市普寧市康美市場，批號為20200806，分別編號為mwpCR1～mwpCR5。植物基原經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院山西省現(xiàn)代中藥工程實(shí)驗室張朔生教授鑒定，均為傘形科藁本屬植物川芎L.chuanxiongHort.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Hypersil Gold C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.3%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，5%～30%乙腈；10～16 min，30%～40%乙腈；16～19 min，40%乙腈；19～60 min，40%～55%乙腈；60～64 min，55%～60%乙腈；64～68 min，60%乙腈；68～72 min，60%～90%乙腈；72～73 min，90%～100%乙腈；73～78 min，100%～5%乙腈；78～83 min，5%乙腈；檢測波長254 nm；體積流量0.8 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL?；旌蠈φ掌芳按硇詷悠罚ㄅ?0190516）色譜圖見圖1。

2.2 酒炙川芎樣品的制備

圖1 混合對照品 (A) 及川芎酒炙品 (B) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances (A)and wine processed Chuanxiong Rhizoma (B)

稱取生川芎飲片約200 g，加入黃酒拌勻，悶潤至酒盡藥透并分為7 份，其中1 份不經(jīng)過加熱炒制，在室溫晾干（編號wpCR0min），其余6 份置于100 ℃炒制容器中分別炒制5、10、15、20、25、30 min，取出放涼備用（相對應(yīng)的酒炙川芎編號為wpCR5min、wpCR10min、wpCR15min、wpCR20min、wpCR25min、wpCR30min）。不同炒制程度樣品各制備10 批。

2.3 對照品及供試品溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 取丁烯基苯酞、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I、阿魏酸、阿魏酸松柏酯對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為14.15、10.44、13.10、17.95、13.35、16.05 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 精密稱取川芎生品及不同炮制品粗粉各約25 g，置于1000 mL 圓底燒瓶中，精密加入90%乙醇溶液500 mL，浸泡30 min，加熱回流提取2 次，每次1.5 h，搖勻，濾過，合并濾液，減壓濃縮，定容至50 mL 量瓶中，精密量取1 mL于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度。進(jìn)樣前13 000 r/min 離心20 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

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2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一份生川芎供試品（批號20190516）溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，以保留時間、峰面積均適中且分離度較好的藁本內(nèi)酯為參照峰，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均＜3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取同一批生川芎樣品（批號20190516），按“2.3.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，以藁本內(nèi)酯為參照峰，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均＜3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份生川芎供試品（批號20190516）溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、16、24 h 按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，以藁本內(nèi)酯為參照峰，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均＜3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 最佳炒制時間的確定 將“2.3.1”項下方法制備的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖；將10 批川芎生品及炒制不同時間的炮制品，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。將10 批生品和不同炮制時間炮制品各10批的指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723 版）”軟件，采用中位數(shù)矢量法進(jìn)行多點(diǎn)校正，生成川芎生品及不同炮制程度酒炙品的對照指紋圖譜，結(jié)果見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)9 個色譜峰響應(yīng)值較大（占共有指紋峰面積的80%），且分離度較好，將其作為共有色譜峰。隨著炮制程度的改變，其峰面積也發(fā)生改變。

圖2 川芎生品及不同程度炮制品HPLC 對照指紋圖譜Fig.2 HPLC control fingerprints of Chuanxiong Rhizoma of raw and processed products at different degrees

將川芎生品及炮制品進(jìn)行對比，分別比較這9個共有色譜峰在生品及不同炮制品中的峰面積，結(jié)果見表1。隨著炒制時間的延長，除17 號峰逐漸降低外，其余峰多在15～20 min 達(dá)到最大峰面積，說明多數(shù)成分在炒制15～20 min 時含量最大，因此，15～20 min 為最佳的炮制時間。以下生品川芎、酒炙品川芎指紋圖譜比較分析、HCA、PCA 中的酒炙川芎均指炒制20 min 下的川芎。

經(jīng)與對照品比對，指認(rèn)出6 個成分，其中7 號峰為阿魏酸，8 號峰為洋川芎內(nèi)酯I，15 號峰為阿魏酸松柏酯，17 號峰為洋川芎內(nèi)酯A，19 號峰為藁本內(nèi)酯，20 號峰為丁烯基苯酞。

表1 9 個指紋峰在川芎生品及不同炮制程度下酒炙品中的峰面積 (±s,n=10)Table 1 Peak area of nine fingerprint peaks of Chuanxiong Rhizoma between raw and processed products at different processing degrees (±s,n=10)

表1 9 個指紋峰在川芎生品及不同炮制程度下酒炙品中的峰面積 (±s,n=10)Table 1 Peak area of nine fingerprint peaks of Chuanxiong Rhizoma between raw and processed products at different processing degrees (±s,n=10)

與rCR 比較：*P＜0.05 **P＜0.01*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs rCR

峰號 峰面積rCR wpCR0min wpCR5min wpCR10min 4 897 746.2±162 199.8 995 468.3±135 420.9 1 181 545.4±229 167.7** 1 036 835.4±246 356.7 7 1 710 179.8±196 756.4 1 916 062.8±122 240.0* 1 768 630.7±213 696.9 1 807 539.4±144 483.0 8 1 341 837.1±97 962.2 1 518 012.6±152 002.2** 1 211 124.5±35 288.5** 1 527 409.2±92 622.9**13 400 304.0±11 359.1 359 417.6±50 496.6* 317 109.8±93 587.9* 323 881.2±55 303.6**15 209 184.6±62 542.2 222 238.0±6 356.9 216 305.2±33 740.4 247 006.4±24 402.0 17 941 800.1±124 061.2 985 487.4±132 843.2 925 339.6±73 253.5 876 019.1±156 326.7 19 6 912 455.7±927 359.9 6 719 164.7±391 452.1 7 068 139.7±1 221 254.0 6 344 215.5±242 050.6 20 1 817 607.9±265 369.0 1 802 105.9±226 549.3 1 558 787.2±115 934.8* 1 874 489.7±208 827.5 22 628 727.4±120 241.9 580 840.1±43 149.5 581 759.4±106 553.6 575 239.8±39 413.4峰號 峰面積wpCR15min wpCR20min wpCR25min wpCR30min 4 1 289 916.4±253 443.9** 1 578 546.1±410 255.3** 908 832.8±188 411.9 1 480 660.7±314 192.4**7 2 042 056.3±113 106.3** 1 781 396.4±264 463.1 1 397 926.2±118 631.4 1 834 371.1±203 602.1 8 1 861 399.2±240 334.6 1 356 227.2±107 028.6 1 289 924.5±358 803.8 1 317 435.5±449 963.8 13 301 671.2±51 769.2** 445 865.0±24 597.1** 352 077.1±32 956.8** 409 316.8±13 885.6 15 216 800.6±29 909.0 259 885.1±17 321.7* 216 200.3±61 591.0 234 090.3±62 420.3 17 811 084.5±104 353.8* 913 711.2±109 187.6 800 171.8±193 880.6 783 937.8±171 472.3*19 7 302 510.7±516 312.0 6 861 068.1±291 437.1 5 959 126.0±804 666.5* 5 374 766.4±1 084 836.2**20 1 960 608.2±217 992.2 1 759 509.4±109 521.4 1 833 330.1±433 787.7 1 433 020.4±395 260.1*22 647 255.3±61 526.5 808 402.2±102 451.9** 658 737.0±48 194.0 732 714.3±92 909.5*

將10 批川芎生品及酒炙品指紋圖譜分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版）”軟件，計算各批次樣品指紋圖譜與各自生成的對照圖譜的相似度，其相似度結(jié)果見表2。由表可知，10 批川芎生品指紋圖譜以及10 批川芎酒炙品指紋圖譜的相似度均較好，均在0.98 以上。

2.6 化學(xué)模式識別研究

2.6.1 HCA 以生川芎和酒川芎共有峰的相對峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行聚類分析。Z 標(biāo)準(zhǔn)化后采用瓦爾德法，以平方歐式距離作為樣品相似度的距離公式，結(jié)果見圖4。聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)平方歐式距離為10 時，川芎樣品可分為2 類，rCR1～rCR10 號川芎生品聚為一類，wpCR1～wpCR10 號酒炙品聚為一類。說明川芎生品與酒炙品的化學(xué)指紋峰差異，可以采用聚類方式進(jìn)行識別，并進(jìn)行分類。

2.6.2 PCA 將10 批生川芎和酒川芎作為研究對象，把共有峰的相對峰面積作為變量導(dǎo)入SIMCA 14.1 統(tǒng)計軟件進(jìn)行無監(jiān)督模式的PCA 建模，分析結(jié)果見圖5。由圖5可知，生川芎和酒川芎沿著t1 軸方向各自聚為一類，生川芎位于得分圖的左邊，酒川芎位于得分圖的右邊，與聚類分析結(jié)果相互佐證，說明炮制處理對川芎化學(xué)成分的總體特征構(gòu)成了明顯影響。前5 個主成分的累積貢獻(xiàn)率R2X達(dá)到93.842%，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.754，說明該模型的擬合程度和預(yù)測程度都較好，通過PCA 降維處理后所提取的主成分能反映川芎指紋圖譜中22 個共有峰的主要信息。成分載荷矩陣可說明各個變量對主成分的貢獻(xiàn)率，載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻(xiàn)越大，主成分載荷矩陣見表3。第1 主成分（PC1）信息量最大，獨(dú)立貢獻(xiàn)率為50.771%，峰12（0.296）、峰1（0.295）、峰13（?0.293）、峰2（0.289）和峰3（0.289）載荷值較大。第2 主成分（PC2）獨(dú)立貢獻(xiàn)率為20.253%，峰15（0.376）、峰18（?0.356）、峰11（0.298）、峰4（?0.295）和峰22（?0.293）載荷值較大。第3 主成分（PC3）獨(dú)立貢獻(xiàn)率為9.851%，峰21（0.429）、峰8（0.394）、峰9（0.394）、峰19（?0.390）和峰16（0.311）載荷較大。第4 主成分（PC4）獨(dú)立貢獻(xiàn)率為8.811%，峰17（0.526）、峰7（0.340）和峰15（?0.333）有較大載荷。第5 主成分（PC5）獨(dú)立貢獻(xiàn)率為4.156%，峰9（0.681）、峰7（0.362）和峰15（?0.312）的載荷較大。結(jié)果表明，多種化學(xué)成分共同引起川芎的質(zhì)量差異。

圖3 10 批生川芎HPLC 指紋圖譜 (A) 及其對照指紋圖譜(RrCR) 和10 批酒炙川芎HPLC 指紋圖譜 (B) 及其對照指紋圖譜 (RwpCR)Fig.3 HPLC fingerprints (A) and control fingerprints(RrCR) of 10 batches of raw Chuanxiong Rhizoma,and HPLC fingerprints (B) and control fingerprints (RwpCR) of 10 batches of wine processed Chuanxiong Rhizoma

表2 10 批川芎生品和酒炙品指紋圖譜相似度結(jié)果Table 2 Fingerprint similarity results of 10 batches raw and wine processed Chuanxiong Rhizoma

圖4 川芎生品和酒炙品聚類分析Fig.4 HCA of raw and wine processed Chuanxiong Rhizoma

圖5 川芎生品和酒炙品PCA 得分圖Fig.5 PCA score plot of raw and wine processed Chuanxiong Rhizoma

表3 主成分載荷Table 3 Principal component load

為分析炮制過程中成分變化的整體規(guī)律，將10批川芎生品和不同炮制程度酒炙品作為研究對象，把共有峰的相對峰面積作為變量導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行無監(jiān)督模式的PCA 建模分析，結(jié)果見圖6。由圖可知，隨著炮制程度的加深，從生品到不同炮制程度酒炙品的PCA 得分圖基本呈順時針方向遷移，炮制過程中雖然各個化學(xué)成分的變化趨勢不盡相同，整體體現(xiàn)一定的復(fù)雜性，但PCA 可將這種復(fù)雜性變得較為簡單和可視化，可以體現(xiàn)化學(xué)成分的整體變化特征。

2.6.3 采用PCA 模型進(jìn)行酒炙工藝預(yù)測 在以上PCA 的基礎(chǔ)上，另外制備生品3 批，分別為rCR11～rCR13；制備上述最優(yōu)炮制程度下酒炙品3 批，分別為wpCR11～wpCR13；制備市售酒川芎5 批，分別為mwpCR1～mwpCR5，此11 批樣品作為預(yù)測集。采用“2.6.2”項下建立的PCA 模型對3 批生品、3 批酒炙品以及5 批市售酒炙品進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測得分圖見圖7-A。由圖可知，3 批生品和3 批自制酒炙品分別落在了PCA 模型的生品和酒炙品的范圍內(nèi)，說明建模良好，可以用于炮制品工藝預(yù)測。市售5 批酒炙品，有3 批落在酒炙品范圍內(nèi)，2 批落在了生品和酒炙品之間，說明3 批工藝與本實(shí)驗的工藝相符合，2 批與本實(shí)驗的工藝存在一定的差異，此2 批川芎的來源以及炮制工藝均有可能是造成差異的原因。

圖6 川芎生品及不同炮制程度酒炙品的PCA 得分圖Fig.6 PCA score plot of raw and processed Chuanxiong Rhizoma at different processing degrees

為了對炮制過程中的炮制程度進(jìn)行控制，及時發(fā)現(xiàn)不合格炮制品，用最佳炮制程度下的10 批樣品指紋圖譜共有峰進(jìn)行建模，對3 批炮制時間為10 min（炮制程度不及，wpCR11’～wpCR13’）、3 批炮制時間為30 min（炮制程度過度，wpCR14’～wpCR16’）的酒炙品進(jìn)行預(yù)測，其DModX 圖見圖7-B，由圖可以發(fā)現(xiàn)此6 批樣品均偏離了最佳炮制程度下的10 批樣品，說明炮制不及和過度均不得當(dāng)。

圖7 川芎生品、酒炙品和市售酒炙品PCA 預(yù)測得分 (A)及酒炙工藝預(yù)測DModX (B) 圖Fig.7 Predicted PCA of raw,wine processed and market Chuanxiong Rhizoma (A) and DModX of wine processing prediction (B)

2.6.4 OPLS-DA 分析 將川芎生品和酒炙品作為研究對象，以共有峰的相對峰面積作為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1 進(jìn)行有監(jiān)督模式的OPLS-DA 分析，獲得相應(yīng)的模型，見圖8-A。結(jié)果表明累積解釋能力參數(shù)（R2X）為0.738，累積解釋能力參數(shù)（R2Y）為0.994，預(yù)測能力參數(shù)（Q2）為0.988，均大于0.5，表明該模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測能力強(qiáng)，可用于區(qū)別生川芎與酒川芎。由OPLS-DA 得分圖可知，生川芎和酒川芎明顯分為2 類，說明川芎酒炙前后化學(xué)成分的含量存在差異。

對建立的OPLS-DA 模型進(jìn)行200 次置換檢驗，結(jié)果見圖8-B。由圖可知，位于最右邊的R2和Q2值均大于0.9，高于左邊的R2和Q2值，且Q2回歸線的截距為負(fù)值，表明所構(gòu)建的OPLS-DA 模型沒有出現(xiàn)過擬合，具有較好的預(yù)測能力，能夠用于川芎生品和酒炙品的判別分析。

S-Plot 圖（圖8-C）體現(xiàn)了各變量的貢獻(xiàn)度與樣品間的相關(guān)性，圖中每個點(diǎn)代表1種化合物，對角線兩端的變量是影響2 樣本差異性的潛在標(biāo)志物。由圖8-C 可知，峰1～4、12、13、19（藁本內(nèi)酯）、20（丁烯基苯酞）可能是引起川芎生品和酒炙品質(zhì)量差異的標(biāo)志化合物。其中，1～3 號峰為酒炙后新增加的峰。

圖8 川芎生品與酒炙品的OPLS-DA 得分 (A)、模型的置換檢驗 (B)、S-plot (C) 及VIP 值圖 (D)Fig.8 OPLS-DA score plot (A),permutation test (B),S-plot(C) and VIP (D) of raw and wine processed Chuanxiong Rhizoma

提取OPLS-DA 模型中變量重要性投影（VIP）圖，見圖8-D。對22 個共有峰峰面積VIP 值大小進(jìn)行排列，以VIP 值＞1.0 為標(biāo)準(zhǔn)篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物，共得到6 個VIP 值大于1 的共有峰，分別為19號峰（藁本內(nèi)酯，VIP 值為2.237）、4 號峰（VIP值為1.693）、12 號峰（VIP 值為1.479）、13 號峰（VIP值為1.309）、1 號峰（VIP 值為1.208）、20 號峰（丁烯基苯酞，VIP 值為1.147）。說明這些化學(xué)成分對川芎生品和酒炙品分類具有顯著影響，是引起川芎酒炙前后質(zhì)量差異的主要潛在標(biāo)志性成分。因此，在建立川芎酒炙品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，此差異標(biāo)志性成分可以考慮作為指標(biāo)成分，來控制酒炙品的質(zhì)量。

3 討論

本實(shí)驗對川芎生品以及酒炙品進(jìn)行全波長掃描，提取各個波長下的指紋圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在254 nm 波長下各色譜峰響應(yīng)較高，峰數(shù)目較多，峰形對稱，各色譜峰分離度較好，基線較平穩(wěn)。因此，確定254 nm 作為建立川芎生品及酒炙品指紋圖譜的檢測波長。在建立提取方法時，前期實(shí)驗比較了水提法以及醇提法，發(fā)現(xiàn)在200～400 nm 全波長掃描下，水提樣品指紋峰的數(shù)目較醇提少，為了獲得更多的指紋峰，選擇乙醇提取，并比較了不同濃度乙醇提取的效果，最終確定提取濃度為90%的乙醇。

《中國藥典》沒有收載川芎炮制品，各地方標(biāo)準(zhǔn)對川芎炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有具體規(guī)定，因此不能有效控制川芎炮制品的質(zhì)量。本研究采用HPLC 法，建立了川芎生品及其炮制品隨炒制時間的動態(tài)變化指紋圖譜，選擇峰面積較大的9 個共有峰，通過9個峰的動態(tài)變化，最終確定在本實(shí)驗條件下，最佳炮制時間為15～20 min。其原因為，可以觀察到大多數(shù)色譜峰在炒制15～20 min 時，含量達(dá)到最大，在超過20 min 時，可觀察到峰面積的降低。雖然指紋圖譜具有其自身的缺陷，不同產(chǎn)地川芎建立的指紋圖譜也會有一定的差異，甚至可能會超過炮制造成的差異，但實(shí)驗中進(jìn)行炮制程度控制時，是在生品指紋圖譜的基礎(chǔ)上進(jìn)行同批炮制，建立炮制過程中的動態(tài)指紋圖譜，指紋圖譜動態(tài)變化的影響因素只來自炮制過程，因此，各個時間點(diǎn)間的指紋圖譜具有一定的可比性。

通過對川芎生品及最佳炮制時間酒炙品的指紋圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)川芎經(jīng)酒炙以后，有新產(chǎn)生的色譜峰，可能為黃酒中帶入的新成分，也可能由部分消失成分轉(zhuǎn)化而來。通過OPLS-DA 進(jìn)行差異性標(biāo)志物的篩選，這些新產(chǎn)生的成分也在其差異性質(zhì)量標(biāo)志物中，所有的差異性質(zhì)量標(biāo)志物都可能與酒炙川芎增加活血化瘀作用有關(guān)，但未知成分及新生成成分的定性尚待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗通過HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別方法揭示了川芎炮制前后化學(xué)成分的變化規(guī)律，為酒炙川芎可能發(fā)生的藥效變化提供化學(xué)基礎(chǔ)，也為川芎及其炮制品的質(zhì)量評價及炮制過程的在線控制提供思路和方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突