廣藿香油中1個(gè)新的愈創(chuàng)木烷型倍半萜

黃 露，馬 川，熊 亮，彭 成，郭 力*，周勤梅,

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都 611137

3.成都中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，四川 成都 611137

神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率與年齡密切相關(guān)，隨著世界人口老齡化的加速，其發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)[1]。在《世界老年癡呆癥報(bào)告》中指出，未來15年阿爾茲海默病患者人數(shù)會(huì)增長50%～110%[2]?；颊甙l(fā)病后病情呈現(xiàn)進(jìn)行性加重，逐漸喪失獨(dú)立生活能力，最終因并發(fā)癥而死亡[3]。中藥揮發(fā)油類物質(zhì)具有上行于竅，開竅的作用，中醫(yī)上也認(rèn)為“芳香藥行散走竄、芳香上達(dá)”[4-5]，現(xiàn)代研究證實(shí)芳香類藥物針對(duì)神經(jīng)性疾病具有較好的療效[6-11]。

廣藿香是芳香中藥的代表，為唇形科（Lamiaceae）刺蕊草屬PogostemonDesf.植物廣藿香Pogostemon cablin(Blanco) Benth.的干燥地上部分[12]。國內(nèi)外研究者已從廣藿香中分離得到90 余個(gè)單體化合物，其主要的結(jié)構(gòu)類型包括黃酮類、苯丙素類、萜類、甾體類、生物堿類以及脂肪酸類等[13-17]。而廣藿香油作為廣藿香的主要活性組分，具有抗菌[18]、抗病毒[19]、神經(jīng)保護(hù)[20]等多種藥理活性。Perry 等[21]在芳香療法中發(fā)現(xiàn)廣藿香精油具有安神、保護(hù)神經(jīng)的作用，對(duì)于防治神經(jīng)性疾病有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。前期研究發(fā)現(xiàn)，廣藿香油中分離得到的愈創(chuàng)木烷型倍半萜對(duì)具有較好的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)深入分離廣藿香中倍半萜化合物，得到2個(gè)愈創(chuàng)木烷型倍半萜，分別鑒定為 (＋)-(1S,4S,5S,7R,10R)-愈創(chuàng)木烷-5,15-環(huán)氧-11-烯-10-醇[(+)-(1S,4S,5S,7R,10R)-guaiacane-5,15-epoxy-11-ene-10-ol，1]、patchouliguaiol C（2）。其中化合物1 為新化合物，命名為環(huán)氧愈創(chuàng)木醇。并對(duì)獲得的化合物進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)作用篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物2 具有顯著的神經(jīng)保護(hù)活性。

1 儀器與材料

Bruker D8 QUEST X 單晶衍射儀（德國Bruker公司）；Waters Synapt G2 高分辨質(zhì)譜儀（Waters 公司）；安東帕MCP 200 旋光儀（美國安東帕有限公司）；Agilent Cary 600 FTIR 顯微鏡和成像系統(tǒng)（美國Agilent 公司）；Bruker-600 核磁共振儀（德國Bruker 公司）；圓二色譜儀（Chirascan CD 光譜儀）；Búchi Gradient Former B-687 中壓液相色譜儀（Rp C18，43～60 μm）、Búchi Rotavapor R-205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI 公司）；Shimadzu UV-260 型紫外光譜儀（日本島津公司）；色譜柱：Agilent C18（250 mm×9.4 mm，5 μm，安捷倫公司）；Sephadex LH-20（Amersham Pharmacia 公司）；GF254薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；醋酸乙酯均購自成都科龍?jiān)噭S；色譜甲醇購自天地試劑公司。

DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco 公司）；胎牛血清（Gibico 公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar 公司）。Water Jacket CO2孵箱（Thermo Scientific 公司）；Series II Allegra X-12R 離心機(jī)（Beckman Coulter 公司）；AE 2000 電子顯微鏡（Motic 公司）；Sunrise 酶標(biāo)儀（TECAN 公司）；甲基噻唑藍(lán)（MTT，Sigma 公司）。SH-SY5Y、PC12 神經(jīng)細(xì)胞株購自江蘇凱基生物細(xì)胞庫。

廣藿香藥材于2017年12月采自廣東省陽春縣廣藿香種植基地，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室高繼海副教授鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香P.cablin(Blanco) Benth.的全草。標(biāo)本（SGHX-20171205）現(xiàn)存于成都中醫(yī)藥大學(xué)。

2 提取與分離

取干燥的廣藿香藥材地上部分80 kg，采用水蒸氣蒸餾裝置進(jìn)行提取，收集得到揮發(fā)油，然后用無水硫酸鈉干燥除水，最終得到廣藿香揮發(fā)油405 g。采用硅膠柱色譜（100～200 目）對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行薄層色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（100∶0～0∶100）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測(cè)，合并組成相似的流分，回收溶劑得到21 個(gè)洗脫部分（F1～F21）。F18（15.5 g）部分通過反相中壓液相色譜以40%～100%甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測(cè)，合并組成相似的流分，得到14份洗脫部分F18-a～F18-n。F18-f部分采用Sephadex LH-20 柱色譜進(jìn)行分離，以石油醚-氯仿-甲醇（5∶5∶1）為流動(dòng)相，分離得到3 個(gè)亞組分F18-f-1～F18-f-3。對(duì)F18-f-1采用Sephadex HW-40F 柱色譜進(jìn)行分離，以80%甲醇水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，最后經(jīng)制備薄層色譜，石油醚-醋酸乙酯（7∶1）展開，得到含化合物1 的混合物，再經(jīng)過反相半制備高效液相色譜，以69%的甲醇溶液為流動(dòng)相進(jìn)行分離純化，最終得到化合物1（6.5 mg，tR＝73 min，體積流量1 mL/min）。F18-h部分采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，以石油醚-醋酸乙酯（100∶1～1∶1）梯度洗脫，得到12 個(gè)亞組分（F18-h-1～F18-h-12），F(xiàn)18-h-10通過采用反相半制備高效液相色譜法（78%甲醇水溶液）處理組分F18-h-11得到化合物2（10.3 mg，tR＝54 min，體積流量1 mL/min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 的1H-1H COSY 譜顯示H2-6/H-7/H2-8/H2-9、H-4/H3-14/H-1/H2-2/H2-3 的相關(guān)信號(hào)，揭示出1 個(gè)連續(xù)的質(zhì)子偶合體系（圖1）。HMBC 譜中，Me-14 與C-3、C-4、C-5 相關(guān)；H-1 與C-2、C-3、C-10 相關(guān)；H-15 與C-1、C-5、C-9、C-10 相關(guān)；H-7 與C-6 和C-8 相關(guān)；H-12 與C-7 和C-11相關(guān)，表明含氧季碳取代于C-10 位，且C-15 與C-5之間形成1 個(gè)五元環(huán)醚。

化合物1 的相對(duì)構(gòu)型通過NOESY 譜確定，其中H-1 與H-6a 和H-9a 相關(guān)；H-15 與H-3a、H-6b和H-9b 相關(guān)；H2-12 與H-9b 相關(guān)，H-3a 與H3-14相關(guān)（圖1），說明H-6a、H-1、OH-10、H-4 和H-7位于環(huán)系的同側(cè)；H3-14 與H-15 和isopropenyl-7 位于另外一側(cè)。同時(shí)對(duì)該化合物進(jìn)行了單晶測(cè)定，見圖2。進(jìn)一步通過計(jì)算ECD 確定化合物1 的絕對(duì)構(gòu)型。在乙腈中使用等電聚焦連續(xù)極化（IEF-PCM）溶劑化模型針對(duì) 1a (1S,4S,5S,7R,10R) 和 1b(1R,4R,5R,7S,10S) 在CAM-B3LYP/DGDZVP 級(jí)計(jì)算得到的ECD 光譜。通過ECD 光譜比較，計(jì)算得出的1a (1S,4S,5S,7R,10R) ECD 譜與實(shí)驗(yàn)ECD 譜非常吻合。因此，將化合物1 的絕對(duì)構(gòu)型確定為1S,4S,5S,7R,10R。最終化合物鑒定為(＋)-(1S,4S,5S,7R,10R)-愈創(chuàng)木烷-5,15-環(huán)氧-11-烯-10-醇。

化合物1 的X-ray 單晶衍射數(shù)據(jù)：C15H24O2,M＝236.34 g/mol，單斜晶系（monoclinic），手性非心空間群（P21）；a＝7.048(4)×10?7mm,b＝10.887(4)×10?7mm,c＝9.457(5)×10?7mm,α＝90°,β＝102.96(3)°,γ＝90°,V＝707.2(6) ×10?7mm3,T＝298(2) K,Z＝2,μ(Cu Kα) ＝0.558 mm?1,12 502 次單晶反射收集的數(shù)據(jù)（reflections measured），其中收集到的2285 個(gè)數(shù)據(jù)為較完整的可用數(shù)據(jù)（independent reflections）；Rint＝0.037 7,R1＝0.036 4 (I＞2σ(I)),wR(F2)＝0.092 6(I＞2σ(I)),R1＝0.041 6 (all data),wR(F2)＝0.097 1(all data),F2＝1.084,Flack parameter＝?0.20(15)。

表1 化合物1 的碳、氫核磁共振波譜數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR (600 MHz,acetone-d6) and 13C-NMR (150 MHz,acetone-d6) data of compound 1

圖1 化合物1 的結(jié)構(gòu)及主要的1H-1H COSY、HMBC 和NOESY 信號(hào)Fig.1 Structure and key correlations of 1H-1HCOSY,HMBC and NOESY of compound 1

圖2 化合物1 的X-ray 單晶衍射結(jié)構(gòu) (左) 和ECD 圖 (右)Fig.2 X-ray crystal structure (left) and ECD (right) of compound 1

化合物2：白色粉末，10%硫酸乙醇顯紫色；HR-ESI-MSm/z:259.168 5 [M＋Na]+（計(jì)算值259.167 4，C15H24O2Na）；1H-NMR (600 MHz,Acetone-d6)δ:5.17 (1H,brs,H-15a),4.91 (1H,brs,H-15b),4.65 (1H,brs,H-12a),4.59 (1H,brs,H-12b),4.46 (1H,q,J=6.6 Hz,H-2a),2.49 (1H,m,H-4),2.47 (1H,m,H-9a),2.22 (1H,ddd,J=13.2,6.0,4.2 Hz,H-9b),2.09 (1H,m,H-7),2.05 (1H,m,H-5),1.87(1H,m,H-8a),1.80 (1H,ddd,J=12.6,7.8,6.6 Hz,H-3a),1.68 (3H,brs,H3-13),1.67 (1H,ddd,J=12.6,7.8,6.6 Hz,H-3b),1.50 (1H,brd,J=13.8 Hz,H-6a),1.36 (1H,m,H-8b),1.12 (1H,ddd,J=13.8,12.0,10.8 Hz,H-6b),0.87 (3H,d,J=7.2 Hz,CH3-14)；13CNMR (150 MHz,Acetone-d6)δ:154.7 (C-10),152.5(C-11),111.9 (C-15),108.6 (C-12),84.4 (C-1),74.0(C-2),54.6 (C-5),49.7 (C-7),41.4 (C-3),38.0 (C-8),32.9 (C-9),32.8 (C-4),31.9 (C-6),20.5 (C-13),16.8(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[20]，故鑒定化合物2 為patchouliguaiol C。

4 神經(jīng)保護(hù)作用篩選

采用MTT 法測(cè)定化合物1 和2 對(duì)β 淀粉樣蛋白1-42（amyloid β-protein，Aβ1-42）損傷人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 和H2O2損傷PC12 細(xì)胞的作用[22-23]。

SH-SY5Y 細(xì)胞接種于DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，取出離心。接種SH-SY5Y 細(xì)胞于96 孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，其中DMEM 含有10%胎牛血清（100 μL）。將SH-SY5Y 細(xì)胞與樣品一起預(yù)孵育24 h，最終濃度為3.125、6.25、12.5、25 和50 μmol/L，然后分別用25 μmol/L Aβ1-42處理4 h。培養(yǎng)期后，向各孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h。以0.1%DMSO為對(duì)照，50 μmol/L 維生素E 用作陽性對(duì)照，使用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)量吸光度（A）。每個(gè)測(cè)定重復(fù)3 次，計(jì)算細(xì)胞存活率。

當(dāng)PC12 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行收集，PC12細(xì)胞接種于DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，取出離心。接種PC12 細(xì)胞于96 孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，其中DMEM 含有10%胎牛血清（100 μL）。將PC12 細(xì)胞與樣品一起預(yù)孵育24 h，最終濃度為3.125、6.25、12.5、25 和50 μmol/L，然后分別用400 μmol/L H2O2處理4 h。培養(yǎng)期后，向各孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h。以0.1%DMSO 為對(duì)照，50 μmol/L 維生素E用作陽性對(duì)照，以使用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)定A，每個(gè)測(cè)定重復(fù)3 次，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝A給藥/A對(duì)照

由圖3、4 可知，化合物2 在50 μmol/L 濃度下，對(duì)Aβ1-42損傷SH-SY5Y 細(xì)胞和H2O2損傷PC12神經(jīng)細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，存活率分別為（79.57±4.33）%和（69.14±2.55）%。而化合物1 在3.13～50 μmol/L 濃度內(nèi)，對(duì)Aβ1-42 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞和H2O2損傷PC12 神經(jīng)細(xì)胞未表現(xiàn)出明顯作用。

5 討論

圖3 化合物1 和2 對(duì)Aβ1-42 損傷SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of compounds 1 and 2 against Aβ1-42-damage in SH-SY5Y cells

圖4 化合物1 和2 對(duì)H2O2 損傷PC12 神經(jīng)細(xì)胞的影響Fig.4 Effect of compounds 1 and 2 against H2O2-damage in PC12 cells

神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元和（或）其髓鞘的喪失所致，隨著時(shí)間的推移而惡化，出現(xiàn)功能障礙的一種老年人常發(fā)疾病[24]，作為當(dāng)今研究的重點(diǎn)，科學(xué)家尚未發(fā)現(xiàn)療效很好的藥物。結(jié)合中醫(yī)藥“芳香藥行散走竄、芳香上達(dá)”的理論，選擇芳香中藥的代表廣藿香為研究對(duì)象，從中探索對(duì)神經(jīng)性疾病具有較好作用的物質(zhì)。通過對(duì)廣藿香的揮發(fā)性成分進(jìn)行分離純化以及活性篩選，發(fā)現(xiàn)化合物2 對(duì)Aβ1-42損傷SH-SY5Y 和H2O2損傷PC12 神經(jīng)細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用，為現(xiàn)代藥物的研究與開發(fā)提供參考。

廣藿香油中含有豐富的愈創(chuàng)木烷型倍半萜，同時(shí)該類型化合物也是自然界中存在的重要天然產(chǎn)物類型，受到廣大醫(yī)藥研究者的密切關(guān)注[25]。愈創(chuàng)木烷型倍半萜含有多個(gè)手性中心，其絕對(duì)構(gòu)型的確定成為該類型成分結(jié)構(gòu)鑒定的難點(diǎn)。本研究聯(lián)合HR-ESI-MS、NMR、ECD 以及X 單晶衍射等多種技術(shù)手段對(duì)新化合物1 進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。不僅豐富了廣藿香油的化學(xué)組成，同時(shí)也為愈創(chuàng)木烷型倍半萜的結(jié)構(gòu)鑒定提供可靠的數(shù)據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突