內(nèi)蒙古籽用西葫蘆病毒病病原鑒定

岳建英，韋學鋒，鄭紅麗，李正男，趙明敏

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 園藝與植物保護學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019 )

籽用西葫蘆(CucurbitapepoL.)屬葫蘆科南瓜屬作物[1]，是一種以取食籽粒為主的內(nèi)蒙古特色經(jīng)濟作物[2]。由于其籽粒含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，因而在我國廣泛種植[3]。隨著種植面積不斷增加，籽用西葫蘆病害發(fā)生日趨嚴重[4]，尤其是病毒引起的花葉病，已成為制約籽用西葫蘆種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素[5]。

據(jù)報道，目前國內(nèi)外能侵染葫蘆科作物的病毒有89種[6]，其中馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)所占比例最多，為18.6%[7]。馬鈴薯Y病毒屬中最常見、危害最為嚴重的有小西葫蘆黃化花葉病毒 (Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)、西瓜花葉病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)和番木瓜環(huán)斑病毒西瓜株系(Papayaringspotviruswatermelonstrain,PRSV-W)[8]。不同病毒復合侵染是引起西葫蘆花葉病的主要原因[9]，常造成嚴重的經(jīng)濟損失[10]。在法國和黎巴嫩地區(qū)侵染西葫蘆的病毒主要有小西葫蘆黃化花葉病毒(ZYMV)、南瓜蚜傳黃化病毒(Cucurbitaphid-borneyellowsvirus,CABYV)、南瓜花葉病毒(Squashmosaicvirus,SqMV )和黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)[11]。在美國俄克拉荷馬州葫蘆種植區(qū)，主要檢測到番木瓜環(huán)斑病毒(Papayaringspotvirus,PRSV )、西瓜花葉病毒(WMV)和小西葫蘆黃化花葉病毒(ZYMV)[12]。在我國山東地區(qū)葫蘆科蔬菜上主要檢測到煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)和CMV等[13]，在新疆石河子及新湖籽用西葫蘆上主要檢測到CMV、ZYMV、WMV、PRSV-W的侵染[14]，在重慶地區(qū)黃瓜上檢測到CMV、SqMV、蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus,TuMV)、WMV、ZYMV 5種病毒[15]，在云南建水西葫蘆上檢測到ZYMV[16]，在甘肅河西地區(qū)瓜類作物上檢測到WMV、CMV、ZYMV、PRSV-W和SqMV-W[17]。

近年來，籽用西葫蘆花葉病在內(nèi)蒙古自治區(qū)西部地區(qū)大面積發(fā)生，減產(chǎn)達80%以上，部分田塊甚至全田絕收，引起嚴重的經(jīng)濟損失。籽用西葫蘆花葉病在田間的癥狀為系統(tǒng)性花葉和斑駁，葉脈深綠；西葫蘆畸形，表面色澤不均一，呈深綠斑駁和突起，有深綠花斑。本研究通過sRNA深度測序技術和RT-PCR技術，對內(nèi)蒙古土默特左旗侵染西葫蘆的花葉病病原進行鑒定，為籽用西葫蘆花葉病的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在內(nèi)蒙古土默特左旗籽用西葫蘆田間采集7份具有典型花葉癥狀的葉片和健康西葫蘆葉片，分別裝在干凈的自封袋中，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存。選擇花葉癥狀嚴重的2份樣品用于本研究，并分別命名為Z1和Z2。

1.2 籽用西葫蘆樣品總RNA的提取

將Z1、Z2樣品和健康西葫蘆葉片分別在液氮中充分研磨，取100 mg樣品裝于1.5 mL無酶離心管，用 TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取籽用西葫蘆樣品的總RNA，操作步驟參照TRIzol試劑使用說明書進行。經(jīng)檢測總RNA質(zhì)量達到了建庫要求。

1.3 文庫的構建和測序

按照small RNA Sample Pre Kit ( Illumina)說明進行文庫構建。文庫構建后使用Illumina HiSeq4000平臺測序獲取原始數(shù)據(jù)。利用生物信息學分析法去除帶接頭和低質(zhì)量、短于18或長于35個核苷酸序列的reads以及不能確定的堿基數(shù)大于10%的reads，獲得Clean reads。采用Bowtie軟件[18]對sRNA進行分類注釋，過濾掉rRNA、tRNA及重復序列；利用Velvet軟件對sRNA進行拼接，然后在數(shù)據(jù)庫(GenBank Virus RefSeq、GenBank Virus RefSeq、NCBI NR、NCBI NT)中比對以獲得病毒信息。

1.4 籽用西葫蘆花葉病病毒的RT-PCR鑒定

根據(jù)NCBI發(fā)表的WMV和ZYMV外殼蛋白(coat protein,CP)基因序列設計引物(表1)，用于RT-PCR檢測和驗證sRNA測序結(jié)果，以健康的西葫蘆植株作為陰性對照。以總RNA為模板，按照GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒(Promega)的操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈。用合成的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq酶0.3 μL，用ddH2O補足25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃(CMV)、50 ℃(ZVMV)、50 ℃(WMV)或58 ℃(CLLV)退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收并純化目標產(chǎn)物。根據(jù)試劑盒說明將產(chǎn)物連接到pTOPO-T載體(北京艾德萊生物技術有限責任公司)上，挑取陽性克隆進行測序。

表1 RT-PCR檢測所用引物Table 1 Primers for detection of viruses by RT-PCR assay

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

將1.4節(jié)測序結(jié)果與已發(fā)表的侵染西葫蘆的WMV和ZYMV外殼蛋白序列用SDTv2.1軟件進行Blast比對，采用Vector NTI 11軟件進行堿基序列拼接處理，應用SDTv2.1軟件進行堿基序列一致性分析，利用MEGA 6.0軟件中的N-J法[19]構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)蒙古籽用西葫蘆花葉病的田間癥狀

內(nèi)蒙古土默特左旗籽用西葫蘆花葉病的田間癥狀表現(xiàn)為系統(tǒng)性花葉和斑駁，葉脈深綠；西葫蘆畸形，表面色澤不均一，呈深綠斑駁和突起，有深綠花斑(圖1)；發(fā)病瓜后期變軟，不結(jié)籽或結(jié)籽率非常低。

圖1 內(nèi)蒙古籽用西葫蘆花葉病的田間癥狀Fig.1 Mosaic symptoms in leaves and zucchini in field in Inner Mongolia

2.2 籽用西葫蘆花葉病的sRNA深度測序結(jié)果

籽用西葫蘆sRNA深度測序后共獲得15 800 209條reads原始數(shù)據(jù)，去除帶接頭和低質(zhì)量、短于18或長于35個核苷酸序列的reads以及不能確定堿基數(shù)大于10%的reads后，得到15 241 618條Clean reads(占總reads的96.46%)。利用Velvet軟件對sRNA進行拼接后在數(shù)據(jù)庫中比對共注釋到14種病毒(表2)，其中WMV拼接到204條contigs，含有708 908條reads(28.21%)；ZYMV拼接到71個contigs，含有1 731 846條reads(68.92%)；CMV共拼接到47個contigs，含5 235條reads(0.21%)；SMV拼接到6個contigs，含有27 246條reads(1.08%)；CLLV拼接到4個contigs，共有17 991條reads(0.72%)；WVMV拼接到3個contigs，含有10 285個reads(0.41%)；sRNA測序所檢測到的其余8種病毒僅匹配上1個contig，因此認為可能是假陽性。

表2 籽用西葫蘆花葉病的sRNA深度測序結(jié)果Table 2 sRNA deep sequencing results of zucchini mosaic disease

2.3 籽用西葫蘆花葉病病毒的RT-PCR檢測

為驗證sRNA測序分析結(jié)果，根據(jù)Genbank已發(fā)表的侵染西葫蘆的病毒外殼蛋白基因序列設計相應引物，分別以Z1和Z2總RNA合成的cDNA為模板進行PCR擴增。結(jié)果表明，在Z1和Z2 2個樣品中均擴增到ZYMV(283 bp)和WMV(485 bp)特異性條帶(圖2)，同時，也擴增到了CMV(345 bp)和CLLV(315 bp)的特異性條帶。擴增獲得的SMV和WVMV片段經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)，其序列與WMV完全一致?？赡苁荢MV和WVMV這2個病毒與WMV序列相似度較高，且在樣品中含量較低，導致引物優(yōu)先結(jié)合到WMV模板上。

M.DNA Marker；1.健康植物；2.Z1樣品；3.Z2樣品M.DNA Marker;1.Healthy plant;2.Sample Z1;3.Sample Z2圖2 籽用西葫蘆花葉病病毒的RT-PCR檢測Fig.2 RT-PCR detection of main virus in zucchini mosaic disease

2.4 籽用西葫蘆花葉病病毒W(wǎng)MV和ZYMV的序列一致性和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

用SDTv1. 2軟件對擴增產(chǎn)物序列與GenBank已發(fā)表的ZYMV、WMV序列分別進行一致性分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。由圖3和圖4可知，2個籽用西葫蘆樣品中ZYMV分離物MK002236和MK002237的一致性為99.601%，與其他地區(qū)的ZYMV分離物序列一致性為98.601%～99.601%；2個籽用西葫蘆樣品中WMV的分離物MK015646和MK015645的一致性為94.401%，與其他地區(qū)WMV的分離物序列一致性為93.001%～96.101%。

1.意大利未知作物分離物 Unknown Italy (EU660590);2.法國甜瓜分離物 Melon France (JF273462);3.韓國人參分離物 Panax ginseng South Korea (KT992070);4.韓國人參分離物 Panax ginseng South Korea (KT992092);5.韓國未知作物分離物 Unknown South Korea (KU240107);6.韓國未知作物分離物 Unknown South Korea (KU240099);7.中國西葫蘆分離物 Zucchiri China (MK015646);8.意大利柑橘分離物Citrullus lanatu Italy (FJ823122);9.法國未知作物分離物 Unknown Francle (EU660585);10.法國西葫蘆分離物 Zucchini France (JF273458);11.法國西葫蘆分離物 Zucchini France (FJ273460);12.法國未知作物分離物 Unknown France (EU660581);13.法國甜瓜分離物 Melon France (JF273469);14.中國西葫蘆分離物 Zucchini China (MK015645);15.韓國人參分離物 Panax ginseng South Korea (KT992088)圖3 籽用西葫蘆花葉病WMV序列一致性分析Fig.3 Consistency analysis of WMV sequences in zucchini mosaic disease1.斯洛伐克西葫蘆分離物 Cucurbita pepo Slovakia (DQ124239);2.捷克西葫蘆分離物 Cucurbita pepo Czech Republic (KF976712);3.斯洛伐克西葫蘆分離物 Cucurbita pepo Slovakia (KF976713);4.伊朗西葫蘆分離物 Cucurbita pepo Iran (KU198853);5.以色列未知作物分離物 Unknown Israel (AY188994);6.以色列未知作物分離物 Unknown Israel (EF062582);7. 以色列未知作物分離物 Unknown Israel (EF062583);8.伊朗西葫蘆分離物 Cucurbita pepo Iran (JN183062);9.中國西葫蘆分離物 Zucchini China (MK002237);10.中國西葫蘆分離物 Zucchini China (MK002236);11.伊朗蚜蟲分離物 Aphis Zran (KU528623)圖4 籽用西葫蘆花葉病ZYMV序列一致性分析Fig.4 Consistency analysis of ZYMV sequences in zucchini mosaic disease

為了進一步明確2個籽用西葫蘆樣品中ZYMV和WMV分離物與GenBank庫中已發(fā)表病毒分離物的親緣關系，采用MEGA 6.0分別構建了WMV和ZYMV的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果(圖 5和圖 6)發(fā)現(xiàn)，2個籽用西葫蘆ZYMV分離物(MK002236和 MK002237)均與伊朗蚜蟲ZYMV分離物(KU528623)聚合在同一支；籽用西葫蘆Z1樣品WMV分離物(MK015646)與意大利柑橘WMV分離物(FJ823122)距離最近，而Z2樣品WMV分離物(MK015645)則與法國甜瓜WMV分離物、法國未知作物WMV分離物、法國西葫蘆WMV分離物以及Z1 樣品(MK015646)WMV分離物和意大利柑橘WMV分離物形成一個大分支。

圖5 11種ZYMV分離物CP蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of nucleic acids of CP for 11 ZYMV isolates

圖6 15種WMV分離物CP蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of nucleic acids of CP for 15 WMV isolates

3 討 論

病毒病是葫蘆科蔬菜的重要病害，常引起西葫蘆產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣，嚴重時甚至導致絕產(chǎn)。本研究通過對內(nèi)蒙古土默特左旗采集的具有典型花葉癥狀的籽用西葫蘆樣品進行分子鑒定，明確了其病原是以WMV、ZYMV、CMV和CLLV為主的多種病毒復合侵染。這與我國各地報道的西葫蘆病毒病復合侵染的情況類似，其中CMV[20-21]、WMV[22]和ZYMV[23]在各地均有檢測到。

sRNA深度測序是近年來常用的植物病毒檢測技術，可通過直接分析寄主中sRNA，拼接出樣品中的單一病毒或復合侵染病毒序列[24]，該技術已在許多植物未知病原鑒定中發(fā)揮了重要作用[25]。本研究中，籽用西葫蘆sRNA經(jīng)拼接和比對共注釋到14種病毒，其中WMV、ZYMV、CMV 3種病毒所占比例較高。RT-PCR擴增也檢測到了相應病毒外殼蛋白的特異性條帶。對于CLLV來說，盡管contig數(shù)目僅為4個，但RT-PCR檢測到了其特異性條帶?？赡苁窃趕RNA建庫時，CLLV的sRNA數(shù)量較少，導致拼接獲得的contig數(shù)目較少，但該病毒仍然存在樣品中，這也是sRNA測序技術的優(yōu)勢，即能夠檢測到較低含量的病毒。但也不排除假陽性的可能，如樣品中也注釋到的其他8種僅含有1個contig的病毒，筆者認為這些病毒的contig可能是s-RNA測序技術中的非特異性擴增導致。

根據(jù)獲得的籽用西葫蘆WMV和ZYMV分離物的CP序列，構建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個籽用西葫蘆ZYMV分離物(MK002236,MK002237)均與伊朗蚜蟲ZYMV分離物(KU528623)聚合在同一支；Z1樣品WMV分離物(MK015646)與意大利柑橘WMV分離物(FJ823122)距離最近，而Z2樣品WMV分離物(MK015645)則與意大利、法國WMV分離物形成一個大分支。因此推測籽用西葫蘆上的WMV和ZYMV最初可能是由媒介昆蟲或人從其他作物上傳播而來的，也可能是籽用西葫蘆種子進口、國內(nèi)調(diào)運而傳播到本地的。