分蘗洋蔥微鱗莖盤快繁技術(shù)體系建立

蘇雪嬌，王秀峰，張 悅，王學(xué)國，王健鸝，藤 巍，宋述堯

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，吉林 長春 130118；2吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院，吉林 長春 130033)

分蘗洋蔥(AlliumcepaL.varagrogatum Don.)別名毛蔥、鬼子蔥、分蘗蔥頭等，為蔥科蔥屬草本植物，其營養(yǎng)成分豐富，具有良好的保健功能，能提高人體免疫力和抗癌能力[1-4]。分蘗洋蔥是黑龍江省和吉林省重要的優(yōu)勢(shì)蔬菜品種之一，對(duì)農(nóng)民增收起到了積極的促進(jìn)作用[5]。然而由于其主要繁殖方式為營養(yǎng)繁殖，易受植物病毒病侵染，品種退化嚴(yán)重，很大程度上制約了分蘗洋蔥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[6-7]。此外，生產(chǎn)上分蘗洋蔥利用蘗生小鱗莖進(jìn)行種苗繁殖，繁殖系數(shù)較低[8]。目前關(guān)于分蘗洋蔥組培快繁技術(shù)方面的研究還較少。選擇合適的外植體材料是組培快繁成功的關(guān)鍵，一般來說，莖尖組織分生能力較強(qiáng)，且莖尖分生組織中極少甚至無病毒分布[9]，徐啟江等[10]和陳典等[11]以莖尖組織為外植體經(jīng)兩種不同途徑獲得了分蘗洋蔥再生植株，但增殖系數(shù)較低且周期較長，因此開辟蔥蒜類植物新的外植體材料受到了廣泛關(guān)注。孔素萍等[12]以鱗莖盤為外植體誘導(dǎo)出了大蒜的簇生芽；董瑞等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在MS+2 mg/L NAA+7.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上，新疆白皮蒜每個(gè)鱗莖盤不定芽生長最大值為39.22株，以鱗莖盤為外植體進(jìn)行快繁不僅可以獲得較高的增殖效率,且較莖尖取材操作相對(duì)容易。然而，關(guān)于利用分蘗洋蔥鱗莖為外植體進(jìn)行快繁的研究目前尚未見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)擬開展分蘗洋蔥莖尖啟動(dòng)、微鱗莖盤增殖及生根馴化等關(guān)鍵技術(shù)研究，旨在建立脫毒、較高效的分蘗洋蔥快繁體系，為分蘗洋蔥種苗的快繁提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料選取吉林省公主嶺市懷德鎮(zhèn)地方分蘗洋蔥品種為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莖尖啟動(dòng)培養(yǎng) 將分蘗洋蔥種球外層鱗莖逐層剝下，剝至長度2 cm左右，用自來水沖洗30 min，再于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡30 s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%次氯酸鈉浸泡13 min，無菌水沖洗3～5次，備用。

以MS(蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同激素組成啟動(dòng)培養(yǎng)基，用以誘導(dǎo)成苗，培養(yǎng)基配方共設(shè)6個(gè)處理，詳見表1。將經(jīng)過消毒的外植體在無菌條件下，利用顯微鏡剝離出0.3 mm大小的莖尖組織，用于接種。每個(gè)處理接種40個(gè)莖尖，3次重復(fù)。培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計(jì)成苗數(shù)和成苗率并測(cè)量株高莖粗。培養(yǎng)條件為：溫度20～25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間16 h/d，以下試驗(yàn)的培養(yǎng)條件與此相同。成苗率的計(jì)算公式為：

表1 分蘗洋蔥莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基配方Table 1 Formula of starter medium for tiller onion stem tip

成苗率=(成苗數(shù)/接種個(gè)數(shù))×100%。

1.2.2 微鱗莖盤增殖培養(yǎng) 試管鱗莖誘導(dǎo)：待莖尖培養(yǎng)至成苗后，把通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)無洋蔥黃矮病毒的植株作為分蘗洋蔥快繁體系的原始種苗(試管苗脫毒率約為60%)。將原始種苗轉(zhuǎn)接至鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+0.1 mg/L NAA+45 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂)中誘導(dǎo)結(jié)球。

微鱗莖盤增殖：當(dāng)脫毒種苗試管微鱗莖直徑達(dá)到8 mm以上時(shí)，切去根及鱗莖盤以上部分，去除主生長點(diǎn)后將鱗莖盤切割成4份，分別接種于以MS(附加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的6-BA(0.1，0.4，1.0 mg/L)與NAA(0.1，1.0，2.0 mg/L)組合和6-BA(0.1，0.4，1.0 mg/L)與IAA(0.1，1.0，2.0 mg/L)組合的增殖培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)叢生芽，4周后統(tǒng)計(jì)分化芽總數(shù)，計(jì)算平均增殖系數(shù)。每個(gè)配方接種20個(gè)1/4鱗莖盤，3次重復(fù)。平均增殖系數(shù)的計(jì)算公式為：

平均增殖系數(shù)=分化芽總數(shù)/接種塊數(shù)。

1.2.3 生根壯苗與移栽馴化 生根培養(yǎng)基配方設(shè)3個(gè)處理，分別為MS+0.1 mg/L NAA、1/2 MS+0.1 mg/L NAA和1/4 MS+0.1 mg/L NAA。將增殖后的組培苗分株接種于不同生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，誘導(dǎo)組培苗進(jìn)行生根，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)生根率和生根數(shù)并測(cè)量根長。每個(gè)培養(yǎng)基配方接種30株，3次重復(fù)。生根率的計(jì)算公式為：

生根率=(已生根株數(shù)/接種個(gè)數(shù))×100%。

將生根后的分蘗洋蔥組培苗移栽至穴盤中馴化，基質(zhì)配比為V(草炭)∶V(田土)= 2∶1，覆膜保濕，在培養(yǎng)溫度20 ℃、相對(duì)濕度80%的條件下培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計(jì)成活率，并觀察后續(xù)田間生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和Duncan’s多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分蘗洋蔥莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)

由表2可以看出，分蘗洋蔥莖尖組織經(jīng)過35 d培養(yǎng)后，在6種培養(yǎng)基上的成苗率和生長狀態(tài)有一定差異。分蘗洋蔥莖尖組織在A1培養(yǎng)基上的成苗率最高，為87.50%，顯著高于其他處理；植株的平均株高和莖粗也最大，分別為3.41和1.17 cm。A2和A3培養(yǎng)基中分別添加了0.4 mg/L 6-BA和0.8 mg/L 6-BA，分蘗洋蔥莖尖組織成苗率有所下降，分別為75.00%和67.50%，平均株高和莖粗也有所減小，其中平均株高顯著低于A1培養(yǎng)基，平均莖粗與A1培養(yǎng)基差異不顯著。A4和A5培養(yǎng)基中分別添加了0.4 mg/L ZT和0.8 mg/L ZT，分蘗洋蔥莖尖組織成苗率分別為77.50%和67.50%，平均株高分別為3.17 和2.78 cm，平均莖粗分別為1.06 和0.87 cm。分孽洋蔥莖尖組織在A6培養(yǎng)基上的成苗率最低，僅為57.50%，平均株高和莖粗也最小。由于莖尖組織在A1培養(yǎng)基上的成苗率最高且植株生長狀態(tài)最好，因此A1培養(yǎng)基為分蘗洋蔥的最佳莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)分蘗洋蔥莖尖成苗及生長狀況的影響Table 2 Effects of different media on seedling formation and growth status of stem tip

2.2 分蘗洋蔥微鱗莖盤增殖

2.2.1 微鱗莖盤的獲得 本試驗(yàn)分蘗洋蔥增殖快繁是以試管微鱗莖盤為外植體進(jìn)行的，因此需先對(duì)分蘗洋蔥原始種苗進(jìn)行試管結(jié)球誘導(dǎo)以獲得試管微鱗莖。本試驗(yàn)將原始種苗接種于MS+0.1 mg/L NAA+45 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)結(jié)球，培養(yǎng)8周后獲得了直徑大于8 mm的試管微鱗莖。圖1為分蘗洋蔥微鱗莖盤獲得流程，其中圖1-a為經(jīng)結(jié)球誘導(dǎo)后的試管微鱗莖，圖1-b-d為分蘗洋蔥微鱗莖切割過程圖。首先將分蘗洋蔥試管苗的根部切除，再將鱗莖盤以上部分去除，最后將鱗莖盤上的主生長點(diǎn)去除后切割成4份，分別接種于添加不同質(zhì)量濃度的6-BA與NAA組合和6-BA與IAA組合的增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽。

2.2.2 不同激素組合對(duì)分蘗洋蔥微鱗莖盤增殖的影響 將切割后的分蘗洋蔥鱗莖盤接種于增殖培養(yǎng)基上，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，微鱗莖盤分化數(shù)增加，經(jīng)2周培養(yǎng)后，在顯微鏡下觀察到了叢生芽的分化；3周后，叢生芽株高最大可達(dá)1 cm；4周后叢生芽株高可達(dá)3 cm，分化數(shù)達(dá)到最大值(圖2)。

a.試管微鱗莖；b.切除根部；c.切除鱗莖盤以上部分；d.鱗莖盤切割4份a.Micro-squamous tube;b.Removal of roots;c.Removal of upper bulbous disk;d.Scale stalk cut 4 parts圖1 分蘗洋蔥微鱗莖盤的獲得流程Fig.1 Process of obtaining micro-squamous stem disc of tiller onion

a.培養(yǎng)2周；b.培養(yǎng)3周；c.培養(yǎng)4周a.Culture for 2 weeks;b.Culture for 3 weeks;c.Culture for 4 weeks圖2 分蘗洋蔥微鱗莖盤增殖Fig.2 Multiplication of tiller onion microscale

由表3可知,6-BA與NAA組合對(duì)分蘗洋蔥微鱗莖盤誘導(dǎo)增殖的效果優(yōu)于6-BA與IAA組合。不同質(zhì)量濃度的6-BA與NAA組合對(duì)分蘗洋蔥微鱗莖盤的增殖誘導(dǎo)效果存在明顯差異，隨NAA質(zhì)量濃度增加，分蘗洋蔥微鱗莖盤平均增殖系數(shù)普遍下降；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時(shí)，分蘗洋蔥微鱗莖盤平均增值系數(shù)普遍較高。6-BA與NAA組合中，分蘗洋蔥微鱗莖盤在添加0.4 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基上分化芽總數(shù)和平均增殖系數(shù)最大，平均增殖系數(shù)達(dá)16.05，顯著高于其他處理。

表3 不同激素組合對(duì)分蘗洋蔥微鱗莖盤增殖的影響Table 3 Effect of different hormone combinations on growth of microscale disk of tiller onion

由表3還可知，不同質(zhì)量濃度的6-BA與IAA組合也可以誘導(dǎo)出叢生芽，但增殖系數(shù)較低，且增殖苗存在畸形苗。同樣隨IAA質(zhì)量濃度的增加，分蘗洋蔥微鱗莖盤平均增殖系數(shù)普遍下降；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時(shí)，分蘗洋蔥微鱗莖盤平均增殖系數(shù)普遍較高；6-BA與IAA組合中分蘗洋蔥微鱗莖盤在添加 0.4 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IAA的培養(yǎng)基中，分化芽總數(shù)和平均增殖系數(shù)最大，平均增殖系數(shù)達(dá)13.05，顯著高于其他處理。綜合考慮認(rèn)為MS+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為分蘗洋蔥微鱗莖盤增殖的最佳培養(yǎng)基。

2.3 分蘗洋蔥生根壯苗與移栽馴化

由表4可知，將增殖后的分蘗洋蔥苗分株接種于不同生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后各培養(yǎng)基上分蘗洋蔥的生根率均達(dá)100%，但根的生長狀況存在一定差異。D1培養(yǎng)基上的組培苗平均生根數(shù)較多，但根長較短；D2培養(yǎng)基上的組培苗平均生根數(shù)最多，顯著高于D1和D3培養(yǎng)基；D3培養(yǎng)基上的組培苗平均根長最大，與D2培養(yǎng)基差異不顯著，但D3和D2培養(yǎng)基均顯著高于D1培養(yǎng)基。綜合分析認(rèn)為，D2培養(yǎng)基為分蘗洋蔥組培苗的最佳生根培養(yǎng)基。

表4 不同生根培養(yǎng)基對(duì)分蘗洋蔥生根的影響Table 4 Effect of different rooting medium on rooting of tiller onion

圖3為分蘗洋蔥組培苗田間馴化結(jié)果，圖3-a為生根后的分蘗洋蔥組培苗，圖3-b為移栽至穴盤的組培苗。將生根后的分蘗洋蔥組培苗移栽到穴盤中，基質(zhì)為V(草炭)∶V(田土)=2∶1，覆膜保濕，在20 ℃、相對(duì)濕度80%條件下培養(yǎng)20 d后，分蘗洋蔥組培苗成活率在95%以上。與正常鱗莖種植相比，組培苗后續(xù)田間長勢(shì)較好，且生長期相對(duì)延長，分蘗數(shù)4～6個(gè)，鱗莖平均質(zhì)量為25～30 g。

a.分蘗洋蔥組培苗；b.組培苗穴盤栽培a.Seedling culture of tiller onion;b.Cultivation of tissue culture圖3 分蘗洋蔥組培苗的田間馴化栽培Fig.3 Field domestication cultivation of tiller onion tissue culture seedlings

3 討論與結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，分蘗洋蔥最佳莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+0.1 mg /L NAA，成苗率為87.50%。關(guān)于分蘗洋蔥最佳莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基已有一些報(bào)道，徐啟江[8]研究表明，分蘗洋蔥最佳誘芽培養(yǎng)基為 MS+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L BA。姜玉東[14]研究表明，MS+0.1 mg/L NAA+0.7 mg/L BA和MS+0.1 mg/L NAA+0.7 mg/L zip培養(yǎng)基都適合分蘗洋蔥的誘芽培養(yǎng)。王健鸝等[15]研究表明，分蘗洋蔥最佳莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L zip。以上結(jié)果說明，分蘗洋蔥最佳莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基中的最佳NAA質(zhì)量濃度均為0.1 mg/L，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致，所不同的是添加的其他植物生長調(diào)節(jié)劑種類和質(zhì)量濃度有差別，造成這種差異的原因可能與莖尖培養(yǎng)時(shí)所采用的分蘗洋蔥品種和所處發(fā)育時(shí)期不同有關(guān)，不同的分蘗洋蔥品種和所處時(shí)期會(huì)導(dǎo)致其內(nèi)源激素水平差異，進(jìn)而導(dǎo)致莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)選擇的培養(yǎng)基激素種類和水平有所差異。本試驗(yàn)進(jìn)行莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)是為了獲得生長狀況較好的分蘗洋蔥植株，在培養(yǎng)基中添加6-BA、ZT等激素會(huì)促使莖尖啟動(dòng)時(shí)產(chǎn)生芽的分化，影響植株生長狀況。因此本試驗(yàn)通過比較確定，只添加0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基為最佳莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基，不僅能有效節(jié)約生產(chǎn)成本，同時(shí)也提高了誘導(dǎo)效率。

本試驗(yàn)首次利用分蘗洋蔥微鱗莖盤為外植體進(jìn)行增殖，研究結(jié)果表明，分蘗洋蔥1/4微鱗莖盤在MS+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA增殖培養(yǎng)基上的平均增殖系數(shù)可達(dá)16.05，相當(dāng)于1個(gè)鱗莖盤平均增殖系數(shù)可高達(dá)64.20。前人研究表明，莖尖外植體分化不定芽平均最大為3.1，莖尖愈傷組織分化形成的芽最多為14個(gè)[10-11]，因此本試驗(yàn)很大程度上提高了分蘗洋蔥的快繁效率。目前，利用鱗莖盤作為外植體增殖在大蒜、朱頂紅和洋蔥等植物上已有一些報(bào)道[16-19]。董瑞等[20]研究表明，在MS+1.799 mg/L NAA+7.50 mg/L 6-BA增殖培養(yǎng)基上，伊寧紅皮蒜每個(gè)鱗莖盤不定芽生長平均值可達(dá)22.92株。陳漢鑫等[21]研究表明，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA增殖培養(yǎng)基上，朱頂紅鱗莖盤的增殖系數(shù)達(dá)5.62倍。潘美紅等[19]研究表明，以連蔥15號(hào)鱗莖盤為外植體，在MS+7 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA培養(yǎng)基上的增殖效果最好。本試驗(yàn)與前人研究結(jié)果均表明，利用鱗莖盤進(jìn)行快繁可以獲得較高的增殖效率。本試驗(yàn)建立的分蘗洋蔥微鱗莖盤快繁體系主要流程是分蘗洋蔥經(jīng)莖尖啟動(dòng)后獲得組培苗，再經(jīng)結(jié)球誘導(dǎo)后進(jìn)行鱗莖盤增殖，待鱗莖盤增殖的苗長至3～5 cm時(shí)進(jìn)行分株結(jié)球培養(yǎng)，然后再進(jìn)行鱗莖盤增殖，這樣反復(fù)循環(huán)。此過程不僅可以提高分蘗洋蔥的快繁效率，同時(shí)能縮短種苗的增殖周期。

試管苗的生根馴化是脫毒種苗生產(chǎn)的最后一步。前人研究表明，MS+1.5 mg/L IBA+0.01 mg/L NAA、MS+2.5 mg/L IBA和1/2 MS+0.1 mg/L PP333+0.01 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA等培養(yǎng)基都適合分蘗洋蔥的生根培養(yǎng)[6,10,14]。本試驗(yàn)研究表明：在本試驗(yàn)條件下，分蘗洋蔥最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg /L NAA，以單獨(dú)添加NAA為分蘗洋蔥的最佳生根培養(yǎng)基，這與前人研究結(jié)果不同。以往研究表明，NAA、IBA和PP333等激素都有促進(jìn)植物生根的作用，前期誘導(dǎo)組培苗的外植體種類和誘導(dǎo)條件影響組培苗內(nèi)在激素水平和生長狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致誘導(dǎo)生根所需要的條件不同[22-25]。本試驗(yàn)在移栽基質(zhì)為V(草炭)∶V(田土)= 2∶1及覆膜保濕條件下，保持培養(yǎng)溫度為20 ℃，相對(duì)濕度為80%，經(jīng)馴化20 d后分蘗洋蔥組培苗成活率在95%以上。

本試驗(yàn)以分蘗洋蔥鱗莖盤為外植體進(jìn)行增殖誘導(dǎo)，建立了分蘗洋蔥組培苗快繁技術(shù)體系，提高了種苗快繁的增殖系數(shù)，反復(fù)循環(huán)結(jié)球增殖環(huán)節(jié)，縮短了種苗增殖周期，可為分蘗洋蔥的種苗快繁研究提供一定的參考。