電解質(zhì)誘導(dǎo)膠原在云母基底上的類外延附生有序聚集

魏香奕，代娟，袁亞，孫警輝，李學(xué)理，劉玲玲＊

（1.成都醫(yī)學(xué)院四川省動物源性食品獸藥殘留防控技術(shù)工程實驗室，四川成都610500；2.成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院，四川成都610500）

1 前言

膠原是許多動物組織細胞間質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)組分，與此同時，膠原分子的超分子聚集模型是生物大分子研究領(lǐng)域的一個代表性模型，對于模擬組織生長過程、人工生物材料和制備生物相容性界面等都有重要的基礎(chǔ)研究價值。

云母是一種極完全解理礦物，新剝離的優(yōu)質(zhì)云母表面具有原子級的平整度，因此它是一種理想的基底材料，特別適用于原子力顯微鏡（atomic force microscope,AFM）這種測量納米尺度微觀形貌的檢測手段。因此在檢測精度小于微米級時，通常使用云母片作為制樣的基底材料[1,2]。然而由于云母表面帶電荷，蛋白質(zhì)等樣品在云母表面的吸附行為不可避免地要受到影響。一些研究發(fā)現(xiàn)，膠原分子在云母片上能夠形成有取向性的聚集結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)和云母的晶格排列密切相關(guān)，可能是一種“類外延附生”現(xiàn)象[3]。

“類外延附生”現(xiàn)象被認為是制備功能性納米材料的潛在手段，許多分子量較小的生物分子在無機礦物表面的外延附生現(xiàn)象被觀察到[4,5]，但這些蛋白質(zhì)分子和無機基質(zhì)表面的作用力較弱，其附生結(jié)構(gòu)不易嚴格按照基質(zhì)的晶格走向生長。對于像膠原這樣的生物大分子，其分子量較大，外延附生現(xiàn)象更難以獲得。此外，由于納米尺度的界面行為主要是由一些分子間弱相互作用力驅(qū)動，因此受各種物化環(huán)境影響較大，且輔助的檢測手段也很少，因此對生物大分子在無機基質(zhì)表面外延附生現(xiàn)象的研究主要集中在現(xiàn)象觀察上，例如通過調(diào)節(jié)某些物化條件，觀測外延附生結(jié)構(gòu)的變化[6,7]，但從機理上解釋生物大分子在無機基質(zhì)表面外延附生現(xiàn)象的研究相對缺乏[8,9]。

近期的研究表明，電解質(zhì)可能在生物大分子的外延附生聚集過程中扮演了重要的角色[10,11]。本文通過研究電解質(zhì)濃度、電解質(zhì)種類對膠原在白云母基底上的類外延附生現(xiàn)象，并結(jié)合膠原溶液在一定電解質(zhì)環(huán)境中的表面電位變化，嘗試闡明類外延附生過程中膠原-電解質(zhì)-無機質(zhì)基底之間的交互作用，以期對生物大分子有序聚集行為在生物工程材料、生物傳感器以及納米科技等領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2 實驗部分

2.1 主要實驗儀器和材料

2.1.1 主要實驗儀器

原子力顯微鏡SPM-9600，日本島津公司；NSG-11 型鍍金硅探針（輕敲模式用），彈性系數(shù)5.5～22.5 N/m， 俄 羅 斯 NT-MDT 公 司；OMCL-TR800PSA 氮化硅探針（接觸模式用），美國Olympus 公司；生化培養(yǎng)箱LRH-250，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；精密酸度計PHC-3C，上海雷磁公司；激光粒度儀Zetasizer Nano ZS90，英國馬爾文公司。

2.1.2 主要實驗材料

I 型膠原儲備溶液（3 mg/mL），自制；云母片，日本島津公司提供；KCl，NaCl，K2SO4等無機鹽均為分析純，購于成都科龍化工試劑廠。

2.2 實驗方法

2.2.1 KCl 濃度對膠原在云母基底上聚集的影響

配制pH 為4.2 的醋酸-醋酸鈉緩沖液，醋酸濃度約0.02 mol/L，并用其稀釋膠原儲備液，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的膠原溶液，待用。同時用醋酸-醋酸鈉緩沖液配制1 mol/L 的KCl 溶液。向膠原溶液中加入一定量的KCl 溶液和醋酸-醋酸鈉緩沖液，使混合體系的最終膠原質(zhì)量濃度為10 μg/mL，KCl 濃度分別為0、0.05、0.1、0.35 mol/L。用漩渦震蕩儀將混合體系充分混合并平衡30 min 后，用微量移液槍取25 μL 的混合溶液滴于新剝離的云母片上，吸附15 min 后，用蒸餾水將表面多余的膠原溶液輕輕沖走，并吸干多余殘液。

樣品置于潔凈操作臺內(nèi)室溫條件下自然干燥12 h，并于干燥器內(nèi)放置12 h，得到用于原子力顯微鏡檢測的樣品。使用島津SPM-9600 原子力顯微鏡檢測樣品，原子力顯微鏡帶有氣床緩沖附件減小測試噪音。使用島津SPM-9600 附帶軟件進行快速傅里葉轉(zhuǎn)換（fast Fourier transform,FFT）處理。

2.2.2 KCl 濃度對膠原溶液zeta 電位的影響

采用論文2.2.1 的方法，用pH 為4.2 的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制膠原質(zhì)量濃度為40 μg/mL，KCl 濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.15 mol/L 的混合溶液。用漩渦震蕩儀將混合體系充分混合，平衡30 min 后，用激光粒度儀測量膠原溶液的zeta 電位。

2.2.3 電解質(zhì)類型對膠原在云母基底上聚集的影響

采用論文2.2.1 的方法，用pH 為4.2 的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制一系列膠原質(zhì)量濃度為10 μg/mL，K2SO4，(NH4)2SO4，NaCl，KNO3濃度不同的混合溶液，制備用于AFM 觀測的樣品，并使用輕敲模式觀測。

2.2.4 電解質(zhì)類型與濃度對膠原溶液zeta 電位的影響

采用論文2.2.1 的方法，配制膠原質(zhì)量濃度為40 μg/mL，中性鹽濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.15、0.02、0.25 mol/L 的混合溶液。用漩渦震蕩儀將混合體系充分混合，平衡30 min 后，測量膠原溶液的zeta 電位。

3 結(jié)果與討論

3.1 膠原在云母基底上的類外延附生現(xiàn)象

圖1 KCl 對膠原在云母基底上聚集的影響a)對照樣；b)0.35 mol/L（pH 4.2,膠原濃度10 μg/mL）Fig.1 Effect of KCl on the assembly of collagen on mica substratea)control；b)0.35 mol/L(pH 4.2,collagen concentration:10 μg/mL)

圖2 膠原在云母表面上形成的有序聚集結(jié)構(gòu)的方向特征Fig. 2 Directional characteristics of the collagen assembly structures deposited on mica surface

在無KCl 作用時，膠原于云母表面上形成了一層致密的膜，如圖1a 所示，這表明膠原在云母表面未發(fā)生聚集。當KCl 濃度為0.35 mol/L 時，具有方向性的膠原聚集纖維清晰可見，如圖1b 所示。

由圖1 和2 可以看出，膠原在云母表面上形成的纖維狀聚集結(jié)構(gòu)，主要集中在兩個方向，如圖1b、圖2a、圖2b 所示，初步觀察兩個方向間夾角約為60°。為了進一步采集膠原的纖維狀聚集結(jié)構(gòu)的取向信息，我們使用快速傅立葉轉(zhuǎn)換工具對圖像進行處理，圖2a 右上角的插圖為圖像處理后得到的二維快速傅立葉轉(zhuǎn)換過濾圖像，更清晰的表明了兩個方向之間的60°夾角。

實驗所得的膠原聚集結(jié)構(gòu)，其方向特征和云母（001）表面的晶體學(xué)方向是基本一致的。圖2b 右上角插圖即為AFM 接觸模式高分辨率掃描云母基底，并使用快速傅立葉轉(zhuǎn)換的周期信息校正處理后的云母基底圖像；圖2c 為云母的晶格走向示意圖。這表明，膠原分子在云母表面的有序聚集，與云母表面晶體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，即外延附生現(xiàn)象。值得注意的是，對于那些小的生物分子在云母表面上的外延附生，有序聚集結(jié)構(gòu)一般能嚴格的和云母表面的六邊形結(jié)構(gòu)吻合，即按照三個互為60°夾角的方向聚集。但是對于膠原這種分子量較大的生物分子，聚集結(jié)構(gòu)可能和云母的晶體結(jié)構(gòu)不能完全吻合，因此本實驗中能清晰觀察到兩個主導(dǎo)的聚集方向，第三個方向不太明顯。研究結(jié)果初步表明，KCl 的存在對膠原在云母表面上的有序聚集十分關(guān)鍵。

3.2 KCl 濃度對膠原類外延附生的影響及對應(yīng)的zeta 電位分析

圖3 KCl 濃度對膠原在云母基底上聚集的影響a)0 mol/L；b)0.05 mol/L；c)0.1 mol/L；d)0.35 mol/L（pH 4.2,10 μg/mL 膠原）Fig. 3 Effect of KCl concentration on the collagen assembly on mica substratea)0 mol/L；b)0.05 mol/L；c)0.1 mol/L；d)0.35 mol/L(pH 4.2,10 μg/mL collagen)

為了進一步了解KCl 對這種類外延附生的影響，我們研究了不同KCl 濃度下膠原在云母表面的聚集行為，結(jié)果見圖3。當未加入KCl 的時候，膠原分子無序的吸附在云母表面上，分子間幾乎沒有產(chǎn)生聚集（圖3a）。KCl 濃度為0.05 mol/L 的時候，膠原分子產(chǎn)生一定程度的聚集，纖維變長變粗，并在云母片上形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但是方向上仍是雜亂無序（圖3b）。當KCl 濃度為0.1 mol/L 時，膠原分子的聚集結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的方向性，但仍然稍顯雜亂（圖3 c）。當KCl 濃度為0.35 mol/L 時，膠原束在云母片上的有序排列更為清晰，膠原束聚集更為緊密（圖3d）。當KCl 濃度進一步增大，可能是由于膠原分子聚集過度，在蒸餾水流沖洗后很難繼續(xù)吸附在云母表面上。

以上結(jié)果表明，KCl 的加入促進了膠原在云母表面上的類外延附生聚集。在一定的KCl 濃度范圍，類外延附生聚集結(jié)構(gòu)隨著KCl 濃度的增大而變得明顯。有文獻曾對生物分子在云母或其他無機表面上的類外延附生機理進行研究，但由于缺乏有效的輔助研究手段，對于機理的研究仍不充分[11-13]。Richard W. Loo 等認為鉀離子是膠原在云母基底上形成取向性聚集結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵所在[11]；Tomoyuki Akutagawa 等認為鉀離子是電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物在云母基底上外延附生的主要條件[14]；Klemen Kunstelj 等認為云母基底上固有的鉀離子對鳥苷酸的外延附生有關(guān)鍵作用，大于溶液中引入的鉀離子對其的貢獻[15]。這些研究的結(jié)論都認為鉀離子可能是這些生物分子外延附生現(xiàn)象的關(guān)鍵因素，然而由于輔助研究手段的缺乏，這些結(jié)論都缺少更進一步的數(shù)據(jù)支持和理論分析[16]。

新剝離的云母其解理面同時具有正電荷帶和負電荷帶，活性氧原子層形成了負電帶，隨著云母晶層剝離而部分缺失的鉀原子形成了正電帶，兩種電荷帶以幾個大小的周期交替出現(xiàn)，這是分子在其表面進行外延附生的晶體學(xué)基礎(chǔ)。然而由前面的實驗結(jié)果可以看出，膠原在云母基底上形成的取向性聚集結(jié)構(gòu)其尺度為數(shù)百納米，比云母晶格尺度大幾千倍[3,17]。經(jīng)初步分析，氨基酸殘基和云母表層的原子也不太可能產(chǎn)生特殊的定點結(jié)合。綜上所述，膠原在云母基底上的外延附生更可能是受一些微小區(qū)域的分子間弱相互作用力推動，這些弱作用力通過放大、總和從而產(chǎn)生納米尺度的外延附生現(xiàn)象。考慮到云母解理面上的周期性正負帶，我們認為靜電作用力可能是膠原在云母基底上外延附生現(xiàn)象的主要推動力之一。作為膠原- 云母基底交互作用而產(chǎn)生的外延附生現(xiàn)象，其靜電作用力是來自膠原和云母兩者的交互作用。因此，嘗試表征KCl 存在時膠原溶液的zeta 電位，來獲得其表面電荷信息，進而分析靜電作用力對膠原在云母基底上類外延附生的貢獻。

實驗用膠原是通過胃蛋白酶水解牛皮制得，前期實驗測定其等電點在6.8 附近，為了保持膠原溶液的分散穩(wěn)定性，一直用緩沖液將膠原溶液體系的pH 值控制在4.2 附近，此時膠原溶液的zeta電位為正，這意味著膠原分子表面滑動面電位為正[18]。

加入電解質(zhì)能使膠原溶液的zeta 電位符號發(fā)生改變，如圖4 所示（折線圖使用B 樣條曲線擬合）。隨著KCl 濃度的增大，膠原溶液的zeta 電位值逐漸減小趨于0，并在0.1 mol/L 附近發(fā)生了表面電荷反轉(zhuǎn)，zeta 電位的符號由正變負。結(jié)合圖3中的膠原聚集結(jié)構(gòu)圖像來看，我們發(fā)現(xiàn)也是在KCl濃度增大到0.1 mol/L 之后，膠原聚集結(jié)構(gòu)開始呈現(xiàn)有序性，并在KCl 濃度0.35 mol/L 時，出現(xiàn)明顯的類外延附生現(xiàn)象。但是由于KCl 濃度的繼續(xù)升高，導(dǎo)致溶液中膠原聚集加劇，相分離嚴重，使激光粒度儀的測量精度下降、數(shù)據(jù)波動增大，無法采用。通過計算平行樣的標準差，認為KCl 濃度大于0.15 mol/L 時便超出了論文測量方法檢出范圍，zeta 數(shù)據(jù)曲線采用。

3.3 電解質(zhì)類型對膠原類外延附生的影響及對應(yīng)的zeta 電位分析

圖4 KCl 濃度對膠原溶液zeta 電位的影響Fig. 4 Effect of KCl concentration on the zeta potential of collagen solution

如前所述，許多文獻認為鉀離子在類外延附生過程中非常關(guān)鍵，但是這些生物分子與鉀離子并無特殊反應(yīng)位點，同時，論文3.2 中實驗結(jié)果表明了zeta 電位符號改變與膠原類外延附生現(xiàn)象的相關(guān)性?；谝陨辖Y(jié)論我們推測，除鉀離子外，還有其他無機鹽離子亦能使膠原溶液的zeta 電位符號改變，進而同樣能誘導(dǎo)外延附生現(xiàn)象。為了驗證此推論，我們使用了含有K+，NH4+，Na+，SO42-，Cl-，NO3-等其他無機電解質(zhì)開展了進一步的研究。

圖5 兩種電解質(zhì)對膠原在云母基底上聚集形貌和zeta 電位a:0.15 mol/L K2SO4；b:0.35 mol/L(NH4)2SO4Fig. 5 Effects of two electrolytes on the assembly morphology of collagen on mica substrate and its zeta potentiala:0.15 mol/L K2SO4；b:0.35 mol/L(NH4)2SO4

圖6 兩種電解質(zhì)對膠原在云母基底上聚集形貌和膠原溶液zeta 電位的影響a:0.35 mol/L NaCl；b:0.35 mol/L KNO3Fig. 6 Effects of two electrolytes on the morphology of collagen on mica substrate and its zeta potentiala:0.35 mol/L NaCl；b:0.35 mol/L KNO3

如圖5 所示，在一定濃度K2SO4和(NH4)2SO4的誘導(dǎo)下，膠原同樣發(fā)生了外延附生現(xiàn)象，其形貌與KCl 誘導(dǎo)的膠原纖維相似。(NH4)2SO4誘導(dǎo)實驗證明，并非只有K+才能誘導(dǎo)膠原在云母基底上發(fā)生外延附生聚集。同時zeta 電位數(shù)據(jù)表明，隨著K2SO4和(NH4)2SO4濃度的增大，膠原溶液的zeta 電位符號同樣發(fā)生了從正到負的轉(zhuǎn)變。實驗結(jié)果表明，膠原在云母基底上發(fā)生外延附生聚集的必要條件，可能不是鉀離子，而是鉀鹽導(dǎo)致的溶液中膠原分子表面電荷符號的反轉(zhuǎn)。

與此同時，如圖6 所示，在NaCl 和KNO3的誘導(dǎo)下，膠原在云母基底上的聚集結(jié)構(gòu)卻仍然無序，而其zeta 電位符號也未發(fā)生轉(zhuǎn)變，一直在正值區(qū)間。實驗結(jié)果進一步驗證了推論，即電解質(zhì)誘導(dǎo)的zeta 電位符號反轉(zhuǎn)，對膠原在云母基底上的類外延附生現(xiàn)象可能起到關(guān)鍵作用。

云母屬于單斜晶系，具有兩層六方網(wǎng)層夾一層八面體層的三層結(jié)構(gòu)層，稱為云母結(jié)構(gòu)層。六方網(wǎng)層中四分之一的Si 為Al 所代替，使結(jié)構(gòu)層內(nèi)有剩余電荷，因而由較大的陽離子K+充填于結(jié)構(gòu)層之間，以維持電荷平衡。當云母沿著其[001]晶面被剝離時，兩層之間的鉀離子發(fā)生了一定缺失，使云母表面略帶負電[17]。

結(jié)合云母的晶體結(jié)構(gòu)，作出以下推論：當膠原溶液zeta 電位為正時，膠原分子的滑動面電位為正，與帶負電的云母表面產(chǎn)生較強的靜電作用力，吸附速度較快，分布隨機，形成雜亂無序的排布。而當膠原溶液zeta 電位為負時，膠原分子的滑動面電位為負，膠原分子和云母表面帶負電的活性氧原子發(fā)生靜電排斥，吸附過程較緩慢，吸附過程中膠原分子與云母表面帶正電的鉀原子相互吸引，雙重作用力推動膠原分子在云母表面形成有取向的排列。膠原分子電荷為負，一方面減緩了靜電作用力導(dǎo)致的吸附，使膠原得到取向性聚集的時間；另一方面，云母表面帶正電荷的鉀原子，其排布間距遠大于活性氧原子晶格帶的間距，有利于膠原這類生物大分子的類外延附生。

4 結(jié)論

在KCl 誘導(dǎo)下，膠原分子能在云母基底上發(fā)生類外延附生聚集，形成具有一定取向性的規(guī)律排布，其方向性受到云母晶格的影響。KCl 的濃度明顯影響類外延附生過程，隨著KCl 濃度的增大，膠原在云母上的聚集結(jié)構(gòu)從無序變有序。約在KCl濃度0.1 mol/L 時，膠原溶液的zeta 電位符號從正變負，同時膠原產(chǎn)生了取向性，說明膠原溶液zeta電位符號變化和膠原類外延附生現(xiàn)象有關(guān)聯(lián)。其他電解質(zhì)實驗表明，K2SO4和(NH4)2SO4能使膠原溶液的zeta 電位符號從正變負，也能使膠原產(chǎn)生外延附生現(xiàn)象；NaCl 和KNO3未能使膠原溶液的zeta電位符號從正變負，也未能使膠原產(chǎn)生外延附生現(xiàn)象。

綜上所述，電解質(zhì)誘導(dǎo)膠原溶液zeta 電位符號由正到負的轉(zhuǎn)變可能是膠原在云母基底上產(chǎn)生類外延附生聚集的重要因素。