堿水解-SPE-HPLC-MS/MS法檢測(cè)乳制品中喹乙醇及代謝物

林琳

（江蘇康正生物科技有限公司，江蘇高郵225600）

0 引 言

喹乙醇(O laquindox)又稱喹酰胺醇，屬喹噁啉類化合物，對(duì)人體有致突變和致癌的作用[1-3]。中國(guó)自2019年5月1日起停止使用喹乙醇獸藥的原料藥及各種制劑[4-5]。而3-甲基-喹喔啉-2-羧酸（3-m ethyl-quinoxaline-2-carboxy,MQCA）作為喹乙醇的主要代謝產(chǎn)物之一[6]，在體內(nèi)殘留量相對(duì)穩(wěn)定。

目前對(duì)喹乙醇及其代謝物常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-12]。高效液相色譜法前處理復(fù)雜，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性；而高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可以在降低檢出限的同時(shí)避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生。喹乙醇及代謝物的前處理一般有酶解法和酸解法[13-17]，但是兩者的效果都不太理想。本試驗(yàn)擬建立堿水解提取，固相萃取法凈化和液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法，為快速檢測(cè)和監(jiān)管乳制品中喹乙醇及其代謝物殘留提供技術(shù)保障和參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Agilent1120型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；API 3500 Q T rap超高壓液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)AB公司。

喹乙醇和MQCA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 樣品來(lái)源

樣品均為隨機(jī)的市售乳制品。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱型號(hào)：Waters ACQU ITY UPLC BEH C18柱色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)；色譜柱溫度為35℃；進(jìn)樣量為5μL；流速為0.30 m L/min;流動(dòng)相A為0.1%氨水溶液，B為乙腈；洗脫條件如表1所示。

表1 HPLC-MS/MS梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源為正離子電離(ESI+)；監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子源溫度為105℃；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；脫溶劑氣流量為10 L/min；錐孔流量為0.5 L/min；去溶劑溫度為400℃。

1.3.3 樣品的提取與凈化

稱取5 g(精確至0.01 g)乳制品樣品至50 m L離心管中，加入25 m L濃度為2 m oL/L的N aOH溶液，混合均勻，50℃水浴條件下水解60min。然后再加入HC l溶液將水解液調(diào)至pH值7.0后,轉(zhuǎn)速為5 000 r/min離心5 min。取上清液加入固相萃取柱，分別用6 m L甲醇和水依次活化后上樣，首先棄去流出液，然后用6 m L水洗滌，棄去流出液，用3 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液并于40℃氮?dú)獯蹈?。殘余樣品?.0 m L流動(dòng)相溶解混勻，用0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，供液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別稱量10 m g喹乙醇和MQCA標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成1 m g/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再稀釋成質(zhì)量濃度均為1μg/m L中間標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用前，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液配制成質(zhì)量濃度為0.1～50 ng/m L的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

以未檢出喹乙醇和MQCA的乳制品為空白基質(zhì)，加入3個(gè)梯度的混合標(biāo)液，堿水解提取后使用固相萃取柱凈化和富集后，上機(jī)檢測(cè)計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

由于喹乙醇和MQCA為極性一般的弱酸性化合物[18]，實(shí)驗(yàn)考察了Waters ACQU ITY UPLC BEH C18柱色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)和Waters A talantis T3（2.1×50 mm，3μm）這2款不同的色譜柱對(duì)其分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種目標(biāo)物在C18柱上有好的保留效果好，喹乙醇和MQCA的峰形得到改善，與基質(zhì)中的雜質(zhì)也有較好的分離度，峰型尖銳，整個(gè)分離過(guò)程可以在5 min內(nèi)完成。

2.2 流動(dòng)相體系的選擇

流動(dòng)相的組成會(huì)影響目標(biāo)化合物的分離和離子化效率，從而影響到目標(biāo)化合物的靈敏度。在流動(dòng)相選擇中，比較了純甲醇、純乙腈、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.10%甲酸、甲醇-0.1%氨水、乙腈-0.1%氨水作為流動(dòng)相條件下喹乙醇和MQCA檢測(cè)靈敏度及出峰情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相體系中含有乙腈會(huì)改善起到目標(biāo)物峰形的作用，乙腈-0.10%甲酸及乙腈-0.1%氨水均能分離測(cè)定喹乙醇和MQCA。但乙腈-0.10%甲酸流動(dòng)相體系下，喹乙醇響應(yīng)低且MQCA峰形拖尾展寬嚴(yán)重；乙腈-0.1%氨水體系下，兩個(gè)目標(biāo)物均有較高響應(yīng)，峰形窄，且分離時(shí)間縮短，在3 min內(nèi)就能完成分離，如圖1所示，所以本試驗(yàn)選擇流動(dòng)相體系為乙腈-0.1%氨水（梯度洗脫）。

圖1 兩種流動(dòng)相下的TIC圖

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

用質(zhì)量濃度為50 ng/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜掃描，并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。兩種目標(biāo)物的質(zhì)譜分析參數(shù)如表2所示，包括目標(biāo)物的母離子精確質(zhì)量數(shù)，碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)以及去簇電壓和碰撞電壓參數(shù)。

表2 各化合物質(zhì)譜參數(shù)

2.4 方法的線性范圍與靈敏度

在乙腈-0.20%甲酸流動(dòng)相體系中，以表1梯度洗脫的步驟，按1.3.4實(shí)驗(yàn)步驟配制MQCA的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：喹乙醇和MQCA在質(zhì)量濃度為0.1～50.0 ng/m L內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果如表3所示。

表3 2種目標(biāo)物的出峰時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.5 前處理方式的優(yōu)

2.5.1 樣品水解方式的選擇

水解方式一般為酶水解、酸水解、堿水解3種[19-20]，酶水解過(guò)程十分溫和，需在50℃振蕩水浴中反應(yīng)24 h，酶解過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)且步驟繁瑣；酸水解反應(yīng)相對(duì)較溫和，所以對(duì)于乳制品等樣品，其水解效率不高。因?yàn)猷掖己蚆QCA與樣品基質(zhì)主要是共價(jià)結(jié)合，采用酶解和酸解的方式并不能完全將喹乙醇和MQCA從樣品基質(zhì)中解離出來(lái)。強(qiáng)堿水解相對(duì)于酶解和酸解效果更好，反應(yīng)通常較為劇烈，能在短時(shí)間內(nèi)有效水解樣品中的蛋白質(zhì)并將喹乙醇和MQCA從基質(zhì)中解離出來(lái)。試驗(yàn)通過(guò)改變堿水解時(shí)間以及N aOH堿溶液的濃度，通過(guò)水解液狀況評(píng)價(jià)水解效果。選擇水解時(shí)間分別為20，40，60，80，100，120min，N aOH溶液濃度分別采用 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 m oL/L，在60℃條件下對(duì)樣品進(jìn)行水解。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，N aOH濃度太低，水解過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)；N aOH濃度越高水解液相反會(huì)變得濃稠，不適合后續(xù)的提取凈化過(guò)程。選用2.0 m oL/L N aOH溶液水解60 min時(shí)，基質(zhì)樣品被完全水解，MQCA從樣品中被完全釋放出來(lái)，沒(méi)有殘?jiān)Ｓ唷Ｒ虼?，選擇該條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5.2 SPE柱的選擇

由于喹乙醇及MQCA的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有喹喔啉-1,4-二氮氧結(jié)構(gòu)，其在弱堿或者酸性條件下能離子化成為分子，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了已經(jīng)商品化了的H LB、PAX以及MAX 3款固相萃取小柱的做凈化效果對(duì)比，記錄下目標(biāo)物峰面積，分析不同類型的SPE柱對(duì)喹乙醇及MQCA提取的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 喹乙醇及MQCA經(jīng)不同SPE柱處理后的回收率

由圖2可知，MAX小柱回收率最好，兩個(gè)目標(biāo)組分的回收率最高，且不同類型SPE柱間目標(biāo)組分的回收率差異顯著(P＜0.05），因此選擇MAX小柱進(jìn)行固相萃取凈化。且對(duì)60 m g/3 m L和150 m g/6 m L兩種規(guī)格的MAX小柱進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)對(duì)喹乙醇及MQCA都有非常好的保留，回收率沒(méi)有明顯差異，從節(jié)省成本的角度考慮，60m g/3 m L小柱更為合適。

2.6 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，分別選用滅菌乳和乳粉基質(zhì)2種動(dòng)物源性基質(zhì)的樣品，分別添加2倍限量、5倍限量和10倍限量低、中、高的3個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)結(jié)果測(cè)定5次，進(jìn)行加標(biāo)回收的試驗(yàn)。

表4 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

由表4可見(jiàn)，在兩種不同的種類基質(zhì)樣品中，喹乙醇及MQCA的回收率為81.6%～97.1%，精密度為2.15%～5.67%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和精密度可行。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)在堿性環(huán)境下水解提取樣品中的喹乙醇及MQCA，經(jīng)60 m g/3 m L的MAX固相萃取小柱凈化處理后，建立了一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)喹乙醇及其代謝物MQCA在乳制品中殘留量的SPE-HPLC-MS/MS方法。在滅菌乳基質(zhì)和乳粉基質(zhì)樣品基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為81.6%～97.1%，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.15%～5.67%(n=5)。該方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度，能準(zhǔn)確快速有效地檢測(cè)乳制品中的喹乙醇及MQCA的殘留量，可為該方面的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。