酶解和酸解處理對楊梅汁鍵合態(tài)香氣釋放的影響

陳亦欣，陳虹吉，葉興乾，2，劉東紅，2，陳健初，2*

（1 浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院 智能食品加工技術與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室 浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究重點實驗室 浙江省食品加工技術與裝備工程實驗室 杭州310058 2 浙江大學馥莉食品研究院 杭州310058）

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）是楊梅科（Myricaceae）楊梅屬（Myrica）常綠喬木植物，楊梅果實香氣怡人，富含花色苷和類黃酮等活性成分[1]。由于楊梅成熟期集中、采后保鮮難，因此將楊梅加工成楊梅制品是一種可以有效緩解銷售壓力，減少楊梅采后損失，提高楊梅產(chǎn)品附加值的手段。楊梅汁是一種色澤艷麗、酸甜可口的飲料，其保質期長，且保留了花青素、抗壞血酸等生物活性化合物，具有一定的保健功能，有較大的市場發(fā)展?jié)摿2]。

香氣是水果和果品加工產(chǎn)品品質評價重要的指標之一，其客觀地反映了果汁的風味和商品品質[3]。香氣物質以游離態(tài)和糖苷鍵合態(tài)的形式存在于水果中，游離態(tài)香氣物質可被人直接感受到，對果香起主要貢獻作用；糖苷鍵合態(tài)香氣物質作為風味前體，與糖或無味的糖苷結合在一起，經(jīng)水解釋放后才能為人體感知[4-5]。在水果及其制品加工、貯藏過程中鍵合態(tài)香氣成分會釋放，引起香氣的改變，對于鍵合態(tài)香氣的研究能夠為生產(chǎn)上提高產(chǎn)品品質提供理論支持[6-8]。目前，國內(nèi)外研究學者已陸續(xù)從多種水果中發(fā)現(xiàn)了糖苷鍵合態(tài)香氣物質，并對其結構、含量、水解方式、加工及貯藏過程中的變化等進行較為廣泛而深入的研究[9]。例如：Pabst 等[10]分離得到樹莓果實中的以鍵合態(tài)形式存在的4-氧代-β-紫羅蘭醇和芳樟醇2 種物質。Wen 等[11]研究表明3 種櫻桃中的鍵合態(tài)香氣物質酶解后釋放出苯甲醇、香葉醇和2-苯基乙醇等物質。一般情況下，酸解和酶解所得產(chǎn)物不完全相同。如：范剛等[12]在水解錦橙汁時發(fā)現(xiàn)，酸解產(chǎn)物以酚類和酮類為主，而酶解產(chǎn)物以酸類和醇類為主，且產(chǎn)物有較強的刺激性。酸解和酶解[13]的條件對產(chǎn)物的種類和含量也有影響。彭邦遠等[14]比較了2 種來源的β-葡萄糖苷酶酶解刺梨汁的效果及差異性。Williams 等[15]在研究葡萄和葡萄酒時發(fā)現(xiàn)，酸解時pH 值條件不同，水解后產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣成分的種類有很大不同。目前對楊梅汁中的糖苷鍵合態(tài)香氣物質的研究還未見報道。

本研究以楊梅為試驗對象，采用Amberlite XAD-2 樹脂吸附洗脫分離楊梅汁中的游離態(tài)和鍵合態(tài)香氣物質，對得到的鍵合態(tài)香氣物質在2種酸解條件（pH 1.0，2.0）和2 種酶解條件（β-葡萄糖苷酶、果膠酶）下進行水解釋放，基于GC-MS分析方法對水解得到的鍵合態(tài)香氣物質進行鑒定，并比較不同水解方式釋放的揮發(fā)性物質組分的差異，為楊梅及其加工制品的增香調控提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荸薺種楊梅，采自浙江寧波慈溪。采摘后貯藏在-18℃冰箱中，待用。

Amberlite XAD-2（20～60 目），美國Supelco公司；β-D-葡萄糖苷酶（來源于杏仁，100 000 U/g）、果膠酶（30 000 U/g）、環(huán)己酮標品（≥99.9%），阿拉丁公司；所用試劑乙醚、戊烷、乙醇、NaCl 均為分析純級，國藥集團。

1.2 儀器與設備

SPME 自動進樣裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，美國Supelco 公司；Agilent7890B/5977A 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅汁樣品制備 將冷凍楊梅果實在常溫下解凍、榨汁，經(jīng)4 層紗布過濾得到粗汁。將粗汁用高速冷凍離心機離心（4 000 r/min，4 ℃）處理15 min，得到楊梅清汁，做固相微萃取供GC-MS 分析，每個試驗重復平行3 次。

1.3.2 Amberlite XAD-2 樹脂預處理 稱取100 g Amberlite XAD-2 樹脂于索氏抽提器中，先、后用戊烷、乙酸乙酯和乙醇回流處理后置乙醇中保存。裝柱時使用乙醇為溶劑進行濕法裝柱，用去離子水以4 mL/min 流速沖洗至無醇味后即可使用。

1.3.3 分離提取鍵合態(tài)香氣物質 將1.3.1 節(jié)中得到的楊梅清汁以3 mL/min 流速流經(jīng)處理好的Amberlite XAD-2 樹脂柱，然后用去離子水洗柱至水澄清，目的是除去水溶性的糖和酸類物質。接著用乙醚/戊烷（1∶1）溶液洗柱除去游離態(tài)揮發(fā)性物質，再用乙醇將吸附在Amberlite XAD-2 樹脂柱上的鍵合態(tài)揮發(fā)性物質洗脫出來。收集乙醇部分，在50 ℃下減壓濃縮至干，用25 mL 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5.0）溶解，最后用100 mL 乙醚/戊烷（1∶1）溶液分3 次萃取除去殘留的游離態(tài)揮發(fā)性物質，剩下的水相即鍵合態(tài)香氣組分。

1.3.4 酶法水解鍵合態(tài)香氣成分 參考林雯雯[16]的方法并稍作調整，分別稱取β-葡萄糖苷酶與果膠酶4 mg，置于50 mL 頂空瓶中，加入上述水相，密封后38 ℃下保溫水解48 h，將得到的酶解液進行固相微萃取，供GC-MS 分析，每個試驗平行重復3 次。

1.3.5 酸法水解鍵合態(tài)香氣成分 參考范剛[17]的方法并稍作調整，按照酸解pH 值的不同，將楊梅汁中鍵合態(tài)香氣物質的酸解條件設置為劇烈和溫和2 組條件，其中，劇烈酸解條件為：將1.3.3 節(jié)的水相部分，用1.0 mol/L HCl 調整為pH 1.0，置40℃搖床中水解4 d；溫和條件為：將1.3.3 節(jié)的水相部分，用1.0 mol/L HCl 調整為pH 2.0，置40 ℃搖床中水解4 d。待水解完畢，將所有水解后的樣品用1.0 mol/L NaOH 調pH 值至中性，將水解液進行固相微萃取，供GC-MS 分析，每個試驗平行重復3 次。

1.3.6 固相微萃?。⊿PME）萃取揮發(fā)性成分 參考程煥[18]的方法稍作調整，準確量取4 mL 樣品于20 mL 頂空進樣瓶中，加入1.5 g NaCl 以促進揮發(fā)性成分的揮發(fā)，再加入10 μL 內(nèi)標物環(huán)己酮（溶于乙醇，質量濃度為4.75 μg/mL），用聚四氟乙烯隔墊密封，放入自動進樣裝置。50 ℃加熱平衡15 min 后，通過隔墊插入已老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS 的SPME 萃取頭（270 ℃活化1 h），推出纖維頭，頂空吸附30 min 后，插入GC-MS 進樣口解析5 min。

1.3.7 GC-MS 分析 Agilent 7890B/5977A 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，氣相色譜條件：毛細管柱為HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm），程序升溫，起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min 升至240 ℃，保持4 min，進樣口溫度250 ℃。

質譜條件：離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，離子化方式EI，電子能量70 eV，質量范圍45～350 AMU。

1.3.8 香氣物質的定性、定量分析 定性分析采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，化合物經(jīng)計算機檢索與NISTII 譜庫相匹配，選擇較高匹配度的檢索結果。利用C8～C20正構烷烴的保留時間計算每種香氣物質的保留指數(shù)，再結合文獻報道的已知化合物及保留指數(shù)進行比對，確認檢測物成分。

定量分析采用內(nèi)標法，內(nèi)標物為環(huán)己酮（4.75 μg/mL 無水乙醇）。計算公式為：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

楊梅汁中鍵合態(tài)香氣物質平行試驗的平均值及標準差用軟件SPSS 24.0（IBM）計算，使用Excel 2016（Microsoft）作圖。

2 結果與分析

2.1 楊梅汁游離態(tài)香氣物質

表1 列出楊梅汁中主要的游離態(tài)和鍵合態(tài)香氣物質，共鑒定出34 種游離態(tài)香氣物質，包括萜類物質18 種，酯類8 種，醇類4 種，烷烴類3 種及醛類1 種。游離態(tài)物質總含量為32 751.79 μg/L，其中萜類物質含量最高，占總含量的84.40%，β-石竹烯（木香，辛香）是檢出的含量最高的游離態(tài)香氣物質，其次為異石竹烯（木香，辛香）、3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯（堅果香）、β-石竹烯氧化物（草藥香，木香）、γ-壬內(nèi)酯（花香，椰子香）等。Kang等[19]對楊梅進行HS-SPME 和GC-O 分析，結果表明萜類物質是主要的揮發(fā)性成分，占總含量的89.9%，同時也檢測到芳樟醇、苯乙醇、γ-壬內(nèi)酯等具有高香氣強度的物質，與本研究結果基本一致。

2.2 不同酶水解得到的楊梅汁鍵合態(tài)香氣物質

β-葡萄糖苷酶[7]和果膠酶[20]是常用于水解鍵合態(tài)香氣物質的2 種酶，用2 種酶分別對楊梅汁釋放的鍵合態(tài)風味物質進行酶解，得到的鍵合態(tài)揮發(fā)性組分具有明顯差異。由表1 可知，2 種酶水解共釋放出22 種鍵合態(tài)香氣物質，β-葡萄糖苷酶水解得到的物質總含量為845.42 μg/L，果膠酶水解所得物質總含量為545.83 μg/L，香氣損失率高于β-葡萄糖苷酶。2 種酶共同釋放出14 種物質，包括3 種醛酮類、2 種醇類、5 種酯類、2 種萜類等。順-3-壬烯-1-醇（花香、青草香）是β-葡萄糖苷酶水解后檢出的含量最高的物質，為230.33 μg/L，而果膠酶水解后得到的含量僅為84.35 μg/L。十六酸甲酯（蠟味）是果膠酶水解后檢出的含量最高的物質，為116.90 μg/L，β-葡萄糖苷酶水解后僅有55.12 μg/L。苯乙醇（果香，蜂蜜香）也被檢出以鍵合態(tài)的形式存在，β-葡萄糖苷酶水解后檢出160.15 μg/L，接近果膠酶水解后（55.55 μg/L）的3倍，苯乙醇在草莓和樹莓中也被檢出以鍵合態(tài)的形式存在[10，21]。萜類物質是水果中重要的鍵合態(tài)香氣物質[22]，酶解后β-石竹烯和香樹烯氧化物都被檢測到，其中β-石竹烯（辛香、木香）是荸薺楊梅中含量最高的萜烯類物質[23]。此外，在2 種酶的處理下都檢出2-戊基呋喃（花香、果香）和4-乙基愈創(chuàng)木酚（丁香味）。

圖1 顯示了不同酶解得到的楊梅汁鍵合態(tài)香氣物質的種類、組成情況，其中β-葡萄糖苷酶釋放所得物質以醇類為主，占總含量的70.51%，其次是酯類（15.99%）、萜烯類（3.86%）。Lasekan[7]將黑梅（Vitex doniana sweet）中的鍵合態(tài)物質經(jīng)β-葡萄糖苷酶酶解得到的主要物質是醇類，這與本研究結果一致。果膠酶水解得到的鍵合態(tài)風味物質以酯類為主，占總含量的49.30%，其次是醇類（25.62%）、醛酮類（6.96%）、萜類（6.41%）。β-葡萄糖苷酶水解釋放出175.90 μg/L 3，6-壬二烯-1-醇（黃瓜香）、8.61 μg/L 3-苯丙醇（果香）和21.08 μg/L 4-異丙基苯甲醇（木香，草藥香）等4 種果膠酶未釋放出的鍵合態(tài)風味物質，且多為嗅感物質。經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后產(chǎn)生的這些香氣可能是構成楊梅復雜濃郁香氣的一部分，而經(jīng)果膠酶水解楊梅汁后的物質并不具有此類香氣。果膠酶水解后也產(chǎn)生4 種新物質，分別為1，2，3，4-四甲基苯8.41 μg/L，間叔丁基苯酚1.33 μg/L，月桂醛10.96 μg/L 和肉豆蔻酸甲酯5.37 μg/L。其中，月桂醛具有柑橘香，含量較低，而其它物質并不具有相應的香氣成分。綜合比較，使用β-葡萄糖苷酶所處理的楊梅汁香味較強于果膠酶所處理的楊梅汁，因此β-葡萄糖苷酶更適合作為楊梅汁的風味增香酶。

圖1 不同酶解得到的楊梅汁鍵合態(tài)香氣物質的種類、組成Fig.1 The composition and contents of bound volatile compounds in Myrica rubra juice hydrolyzed by different enzymes

表1 楊梅汁中主要的游離態(tài)和鍵合態(tài)香氣物質Table 1 Main free and bound volatile compounds in Myrica rubra juice

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

2.3 不同酸解條件下水解得到的楊梅汁鍵合態(tài)香氣物質

楊梅汁中的鍵合態(tài)香氣物質在其加工和貯藏過程中會發(fā)生自發(fā)的水解釋放。2 種酸解條件（pH 1.0，pH 2.0）的結果見表1，共釋放19 種鍵合態(tài)香氣物質，pH 1.0 條件下酸解得到的鍵合態(tài)風味物質總含量為1 215.2 μg/L，pH 2.0 酸解所得含量為734.15 μg/L，香氣物質含量明顯低于pH 1.0條件下的酸解結果。相同的結論也出現(xiàn)在其它研究中，如任婧楠等[9]發(fā)現(xiàn)pH 值越低越有利于糖苷鍵的水解，得到的鍵合態(tài)香氣物質種類越多，而在過低的pH 值條件下容易引起鍵合態(tài)香氣物質發(fā)生化學反應。2 種酸解條件共同釋放出13 種物質，包括1 種酮類，1 種醇類，4 種酯類，3 種萜類和4 種烷烴類。2，4-二甲基苯乙烯（柑橘香，松樹香）是酸解后含量最高的物質，分別為229.28 μg/L（pH 1.0）和214.53 μg/L（pH 2.0），無明顯差異。2-戊基呋喃（花香，果香）也被檢出以鍵合態(tài)的形式存在，含量分別為150.25 μg/L（pH 1.0）和154.41 μg/L（pH 2.0），差異較小。對傘花烴具有柑橘味，pH 1.0 條件下得到的含量為130.76 μg/L，接近pH 2.0 結果（23.52 μg/L）的6 倍。2 種pH 值條件下共同檢出的3 種萜類物質，分別為γ-松油烯（苦味）、1-松油醇（霉味）和水芹醛，并不是楊梅的特征香氣物質。

圖2 顯示了不同pH 值條件下酸解得到的楊梅汁中鍵合態(tài)香氣物質的種類、組成情況。2 種條件下酸解所得鍵合態(tài)物質均以烷烴類為主，約占55%。pH 1.0 條件下酸解釋放出順-2-壬烯醛187.46 μg/L、茶螺烷45.60 μg/L、α-二去氫菖蒲烯26.31 μg/L 和卡達烯9.19 μg/L 4 種在pH 2.0 條件下未釋放出的鍵合態(tài)風味物質。其中，順-2-壬烯醛具有黃瓜香，茶螺烷具有蜂蜜香，α-二去氫菖蒲烯具有木香。pH 2.0 條件下酸解也產(chǎn)生2 種新物質，分別為4-松油醇和β-大馬酮，質量濃度分別為18.81 μg/L 和55.08 μg/L。β-大馬酮具有花香、果香，而含量較低，4-松油醇具有土味、霉味的不良味道。綜合比較，pH 1.0 條件下酸解處理得到的鍵合態(tài)香氣物質種類多，香氣成分更為豐富，而pH 2.0 條件下有異味產(chǎn)生，因此在pH 1.0 條件下水解產(chǎn)生的鍵合態(tài)香氣物質更為全面。

圖2 不同pH 值條件下酸解得到的楊梅汁中鍵合態(tài)香氣物質的種類組成Fig.2 The composition and contents of bound volatile compounds in Myrica rubra juice hydrolyzed by acid at different pH conditions

2.4 酶解與酸解比較

2 種水解方式得到的楊梅汁鍵合態(tài)香氣組分數(shù)量上相差不大，而種類構成有很大差別。酶法水解得到的組分以醇類和酯類物質居多，其中含量最高的是順-3-壬烯-1-醇，還檢出苯乙醇、β-石竹烯等物質。酸法水解得到的組分則以烷烴類偏多，含量最高的是2，4-二甲基苯乙烯，其次是順-2-壬烯醛、2-戊基呋喃和對傘花烴等，酸解后的產(chǎn)物有較強的刺激性及異味的成分。Sakho 等[24]在研究芒果時，既用了三氟乙酸水解，也用了果膠酶水解，結果在酶解后并沒有發(fā)現(xiàn)酸水解產(chǎn)生的芳樟醇和香葉醇，分析它們可能是游離態(tài)或鍵合態(tài)多元醇重排后的產(chǎn)物。

酸解產(chǎn)生的物質中只有十六酸乙酯、2-戊基呋喃和對傘花烴在游離態(tài)物質中有檢出，酸解后產(chǎn)生的萜類物質在游離態(tài)物質和酶解產(chǎn)物中都未發(fā)現(xiàn)。而酶解結果中苯乙醇、順-3-壬烯-1-醇、十六酸乙酯、β-石竹烯和2-戊基呋喃等5 種物質在游離態(tài)香氣物質中也有檢出，據(jù)文獻報道這些都是楊梅的特征香氣物質[19]。Dziadas 等[25]對4 種合成的萜烯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（香葉基、橙花基、香茅基、桃金娘烯基）進行酸解和酶解，結果表明，酶水解后85%～91%的總峰面積是萜烯糖苷配基，而酸水解釋放的萜烯糖苷配基面積不超過總峰面積的1.3%，表明酸水解幾乎完全分解或轉化了萜烯糖苷配基。Hampel 等[26]對含有游離態(tài)物質（芳樟醇、癸酸乙酯、紫羅蘭酮）和糖苷鍵合態(tài)物質（正辛基-、正十二烷基-、苯基-D-吡喃葡萄糖苷）的混合物進行了酸解和酶解，結果表明，酸水解釋放20%～60%的鍵合態(tài)物質，50%的游離態(tài)物質發(fā)生了降解；而酶水解釋放90%～100%的鍵合態(tài)物質，且對游離態(tài)物質影響不大。

酸解和酶解都可以通過將糖苷鍵斷裂，從而釋放出鍵合態(tài)香氣成分，然而其得到的香氣組分不同，可能與水解機制和反應強度有關。酸解作用比較劇烈，且沒有選擇性，從而會影響香氣組分的穩(wěn)定性，易產(chǎn)生異味成分，而且不可避免地發(fā)生重排反應，往往不能反映真實的糖苷結構；而酶解具有選擇性和高度的專一性，條件比較溫和，釋放出的香氣成分更接近楊梅本身的風味，因此更適宜用作分析糖苷類香氣前體結構[12]。

3 結論

本研究基于不同水解方式對楊梅汁鍵合態(tài)香氣物質釋放的效果進行分析。結果表明：β-葡萄糖苷酶水解后得到的香氣物質含量高，更適合作為楊梅汁的風味增香酶。pH 1.0 條件下酸解處理檢出的鍵合態(tài)香氣物質種類多，成分更為豐富。酶解和酸解條件得到的鍵合態(tài)香氣物質存在顯著性差異，酸解后的產(chǎn)物沒有楊梅的特征香氣，且包含異味成分，而酶解得到的組分更接近楊梅本身的風味，因此利用β-葡萄糖苷酶酶解是更適合楊梅汁中鍵合態(tài)香氣物質釋放的方法。