不同帶電特性的殼聚糖/酪蛋白相互作用研究

張 超，傅玉穎，2*，沈亞麗，陳國文，2，張 豪，靳 冰

（1 浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州310018 2 浙江工商大學杭州商學院 杭州310018）

多糖/蛋白質(zhì)作為食品結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)物質(zhì)，對食品的物理、化學性質(zhì)起決定性的作用?，F(xiàn)代食品制造除以營養(yǎng)學為基本外，還兼顧質(zhì)構(gòu)設計。近些年，越來越多的研究者開始著力于從底層結(jié)構(gòu)設計食品，從而實現(xiàn)對食品質(zhì)構(gòu)的準確調(diào)控。例如：設計不同質(zhì)構(gòu)的凝膠體系以及不同的蛋白質(zhì)-多糖復合物體系等。多糖/蛋白質(zhì)因相異的電性和易于復合等性質(zhì)而得到關(guān)注。利用蛋白質(zhì)-多糖復合后物理、化學性質(zhì)的不同可構(gòu)建各異的應用場景，例如用酪蛋白酸鈉-可溶性淀粉復合物可以制備可食性薄膜[1]，乳蛋白/黃原膠復合后可以充當脂肪或肉類的替代品等[2]。

多糖、蛋白質(zhì)在復合過程中受到內(nèi)、外環(huán)境的影響而形成具有不同微結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，二者間相互作用的最終產(chǎn)物往往具有各異的宏觀性質(zhì)，例如不同的流動特性及黏彈特性等。多糖/蛋白質(zhì)間的相互作用可以從外部因素（pH 值、離子強度、溫度等）調(diào)控。pH 值通過改變多糖和蛋白質(zhì)的帶電性及帶電量，影響二者間的靜電相互作用；離子強度如高濃度的Na+會屏蔽兩者間的電荷效應[3]，使得體系變得不穩(wěn)定；溫度的升高則會導致蛋白質(zhì)變性，結(jié)構(gòu)舒展，使內(nèi)部的帶電基團大量暴露，與多糖的凝聚反應強度增加[4]。從內(nèi)部因素（分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)等）看，多糖分子質(zhì)量的增加，促進了多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而有利于形成靜電復合物[5]。Bekale 等[6]討論了殼聚糖（CS）與牛和人血清蛋白間的相互作用，得出蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的差異，最終導致CS 與兩種模式蛋白間相互作用力的不同。以上幾種因素的影響已有大量的研究，而基于多糖本身的帶電特性對多糖/蛋白質(zhì)復合的影響研究較少。利用大分子的帶電特性來調(diào)控多糖與蛋白質(zhì)的非共價相互作用十分關(guān)鍵。

CS 目前作為自然界中唯一的陽離子多糖，具有天然無毒，良好的生物相容性，可降解等優(yōu)點[7]，因此在食品、化妝品、生物醫(yī)學和制藥工程領(lǐng)域的應用前景被普遍看好。殼聚糖脫乙酰度（D.D）的差異影響CS 帶電特性。如王偉等[8]在研究CS的Mark-Houwink 方程時，發(fā)現(xiàn)D.D 較高的CS 氨基質(zhì)子化后形成的陽離子聚電解質(zhì)分子鏈段間以及鏈段與溶劑間的相互作用增強，有效電荷密度增加使得聚電解質(zhì)溶液黏度增大。酪蛋白又稱干酪素，是牛乳中特有的一組含有大量鈣、磷的蛋白質(zhì)[9]。正是由于酪蛋白獨特的膠束結(jié)構(gòu)，其與多糖的復合物可被用作脂肪替代品以及肉模擬物[10]。酪蛋白分子的可降解性使其穩(wěn)定性較差[11]，而CS被廣泛用于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑，提高了蛋白質(zhì)的活性與穩(wěn)定性[12]。CS 與酪蛋白通過非共價相互作用復合，使復合物具有更好的穩(wěn)定性和功能性。

本試驗選用不同帶電特性的CS 和酪蛋白為研究對象，采用熒光光譜、紫外-可見吸收光譜、傅里葉紅外吸收光譜及黏度分析法研究CS 與酪蛋白的復合機制及流變特性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

殼聚糖分子質(zhì)量約740 ku，南通興成生物制品廠；酪蛋白（Lot#SLBL6515V），美國Sigma-Aldrich 公司；氫氧化鈉、鹽酸，杭州市化學試劑有限公司；氯化鈉、乙酸（冰乙酸）、無水乙酸鈉，上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙酸（冰乙酸）、無水乙酸鈉均為分析純試劑。

1.2 試驗儀器與設備

pH 計（PHS-3C），上海理達儀器廠；激光粒度分析儀（Zeta sizer Nano ZS），英國馬爾文公司；熒光分光光度（RF-5301PC），日本島津公司；紫外-可見分光光度計（UV-2600），日本島津公司；傅里葉變換紅外光譜儀（NicoletiS5），上海力晶科學儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)流變儀（MCR302），奧地利安東帕有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品溶液的制備 CS 和酪蛋白儲備溶液：準確稱取一定質(zhì)量的CS 溶于0.1 mg/mL 乙酸溶液中，于1 000 r/min 的磁力攪拌器上勻速攪拌3 h，置于4 ℃冰箱貯藏過夜，保證充分水合，制得質(zhì)量濃度為8 mg/mL 的CS 溶液。稱取一定質(zhì)量的酪蛋白溶于去離子水中，在磁力攪拌器上攪拌溶解，配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的酪蛋白溶液。

1.3.2 測定CS 脫乙酰度 準確稱取一定質(zhì)量的CS 樣品于燒杯中，用0.1 mol/L 鹽酸在室溫下充分溶解。將pH 計電極置于溶液中，用0.1 mol/L NaOH 溶液滴定，記錄消耗NaOH 的體積及相應的pH 值，繪制pH 值與消耗NaOH 體積的關(guān)系曲線以及CS 的雙突躍滴定曲線。

式中：c——消耗NaOH 濃度（mol/L）；V2——第1 次pH 值突變時消耗的NaOH 體積（mL）；V1——第2 次pH 值突變時消耗的NaOH 體積（mL）；m——CS 樣品的質(zhì)量（g）。

1.3.3 測定不同脫乙酰度CS 帶電特性 一般情況下，研究者利用Zeta 電位測量多糖/蛋白質(zhì)復合后粒子的帶電特性。從微觀角度看，帶電的分散粒子在溶液中相互靠近時形成擴散雙電層。當擴散層內(nèi)的粒子相對于層外粒子發(fā)生遷移時會形成滑動面，在滑動面測得的電荷即粒子的表面電荷б[13]。其中，Zeta 電位中粒子的遷移速率與表面電荷б 密切相關(guān)。而多肽鏈作為蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)構(gòu)成部分，與多糖復合后多肽鏈極性改變，鏈段伸展或收縮，表面電荷相對不穩(wěn)定。為了表征粒子的真實電荷，采用Ohshima 軟粒子模型，Ohshima 軟粒子的遷移率不取決于表面電荷б，而取決于體積電荷密度ZN[14]。在復合體系中，粒子體積的變化導致粒子結(jié)構(gòu)、電子態(tài)密度以及電荷分布的改變。Ohshima 軟粒子模型可以反映粒子在聚合體系中的真實電荷。

在25 ℃條件下分別測定0.1% CS 在10，40，60，80 mmol/L NaCl 溶液的電泳遷移率（μE）。以μE對NaCl 溶液的濃度繪制曲線圖，用公式擬合CS在區(qū)域空間的電荷密度N 與代表這些電荷價態(tài)的Z，以及代表在聚電解質(zhì)（CS）區(qū)域阻止液體流體的程度。其公式如下：

式中：μ——CS 的電泳淌度（m2/s·V）；ε0——CS 溶液的真空絕對介電常數(shù)；εr——CS 溶液的相對介電常數(shù)；η——介質(zhì)黏度（Pa·s）；ψ0——表面區(qū)域和溶液的邊界的電勢（V）；Km——表面區(qū)域的Debye-Hückel 有效參數(shù)；k——玻爾茲曼常數(shù)；T——絕對溫度（K）；z——溶液離子價態(tài)（NaCl 溶液中z=1）；n——CS 溶液的濃度（mol/L）；e——基本電荷（C）；ψDON——Donnan 電勢（V）；N——電解質(zhì)區(qū)域電荷密度（C/m3）；Z——相應的電荷價態(tài)。

1.3.4 熒光光譜 將酪蛋白與CS 分別置于303 K 和313 K 恒溫水浴中30 min，采用熒光分光光度對pH 6.0 的酪蛋白和CS-酪蛋白溶液在波長290～500 nm 范圍掃描，設定熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm，采樣間隔1.0 nm，激發(fā)波長280 nm，記錄溶液在336 nm 附近熒光強度的變化。

1.3.4.1 熒光猝滅機制 熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子的壽命和猝滅劑的濃度直接影響動態(tài)猝滅的效率，

其過程遵循Stern-Volmer 方程[15]。

式中：F0——猝滅劑加入前（CS）的熒光強度（A.U.）；F——猝滅劑加入后（CS-酪蛋白）的熒光強度（A.U.）；[Q]——猝滅劑（CS）的濃度（mol/L）；Kq——猝滅速率常數(shù)；Ksv——Stem-Volmer 猝滅常數(shù)；τ0——分子聚合物的熒光平均壽命（10-8s）[16]。在動態(tài)猝滅中，猝滅劑對分子聚合物的最大擴散碰撞速率常數(shù)為2.0×1010L/（mol·s）[17]。

1.3.4.2 結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù) 假設酪蛋白分子上對CS 有n 個等同的且獨立的結(jié)合部位，結(jié)合常數(shù)為KA，則CS-酪蛋白間的相互作用過程中，結(jié)合常數(shù)KA 和結(jié)合位點數(shù)n 符合下面Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)公式[18]。

式中：F0——猝滅劑加入前（CS）的熒光強度（A.U.）；F——猝滅劑加入后（CS-酪蛋白）的熒光強度（A.U.）；[Q]——CS 的濃度（mol/L）；KA——結(jié)合常數(shù)；n——結(jié)合位點數(shù)。

1.3.4.3 作用力類型 多糖/蛋白質(zhì)間的非共價相互作用主要是由靜電相互作用、疏水效應、氫鍵及范德華力等驅(qū)動[19]。Ross 等[20]根據(jù)熱力學常數(shù)（焓變值ΔH、熵變值ΔS）的符號和大小總結(jié)出高分子聚合物與其它物質(zhì)之間結(jié)合的熱力學規(guī)律：ΔH、ΔS 均為正值，兩者間的相互作用力主要為疏水作用力；ΔH、ΔS 均為負值，兩者間的相互作用主要是范德華力或氫鍵；ΔH＜0，ΔS＞0，兩者間的相互作用主要是靜電相互作用。

在測量的溫度范圍變化不大時，ΔH、ΔS 可看作常數(shù)，由Vant Hoff 等式和熱力學公式可得CS-酪蛋白間的熱力學參數(shù)[21]。

式中：K1，K2為303 K 和313 K 溫度下的結(jié)合常數(shù)；R——氣體常數(shù)；T——熱力學溫度（K）。

1.3.5 紫外-可見吸收光譜 在25 ℃條件下，采用紫外-可見分光光度計測定各組溶液在pH 6.0時的吸光值。波長范圍200～800 nm，掃描速度為中速，采樣間隔1 nm，掃描方式為自動，狹縫寬度0.2 mm，記錄紫外吸收值的變化。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）稱取一定質(zhì)量的CS、酪蛋白及冷凍干燥后的CS-酪蛋白復合物（pH 7.5）樣品，按質(zhì)量比1∶100 的比例與KBr混合、研磨，用壓片機將研磨均勻的粉末制成透明薄片。在25 ℃下，用傅里葉變換紅外光譜儀在波數(shù)400～4 000 cm-1范圍，以4 cm-1的分辨率掃描樣品16 次。

1.3.7 流變穩(wěn)定黏度測定 利用旋轉(zhuǎn)流變儀測定酪蛋白和CS-酪蛋白復合溶液的表觀黏度，選取CC27 型號的同心圓筒模式轉(zhuǎn)子。溫度設置為25℃，剪切速率范圍0.01～100 s-1，記錄樣品表觀黏度隨剪切速率的變化。

Power-law 模型常被用來描述復合溶液的流變行為。

式中，б——剪切應力（mPa）；κ——剪切速率（S-1）；γ——稠度系數(shù)（Pa·sn）；κ 值與復合溶液的黏稠度成正比。n=1，理想牛頓流體，表觀黏度不隨剪切速率而變化；n＞1，脹塑性流體，即剪切增稠；n＜1，假塑性流體，具有剪切變稀的特征，n 越小表示假塑性程度越大[22]。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 本試驗中的結(jié)果平均重復3次，數(shù)據(jù)用Excel 2010 與SPSS 24.0 軟件統(tǒng)計分析，P＜0.05 表示顯著，P＞0.05 表示不顯著。用Origin 2017 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 CS 脫乙酰度

由圖1 可知，在滴加NaOH 時，整個體系中出現(xiàn)兩個突變點。第1 次突變是由于NaOH 中和溶液中的HCl，第2 次突變是NaOH 與CS 的氨基反應的結(jié)果。由公式（1）計算得到本試驗中測得的CS 的D.D 值分別是82.5%和94.6%。為了便于表述，將兩種CS 簡稱為LDCS 與HDCS。

2.2 不同脫乙酰度CS 帶電特性

由圖2 可知，μE與NaCl 溶液的濃度呈負相關(guān)。表1 中，D.D 為82.5%和94.6%的CS 的ZN 值分別是0.0077 mol/L 和0.0110 mol/L，表明隨著CS脫乙酰度的增加，ZN 也隨著升高。這是由于CS 分子鏈上的氨基質(zhì)子化，使得CS 在溶液中的帶電基團增加，帶電量提高。表2 中，擬合得到的軟粒子電位幾乎是所測電位的一半，可能是因為軟粒子模型中帶電粒子極化，對可穿透層內(nèi)的粒子起到屏蔽作用[23]。

2.3 CS-酪蛋白復合溶液的熒光光譜分析

2.3.1 熒光猝滅機制分析 圖3 是不同脫乙酰度的CS 對酪蛋白的熒光猝滅光譜圖。當激發(fā)波長為280 nm 時，酪蛋白在波長336 nm 附近出現(xiàn)最大熒光發(fā)射峰，其主要由酪蛋白中色氨酸（Trp）殘基產(chǎn)生。在波長336 nm 處，CS 的加入，使得酪蛋白的熒光強度逐漸降低，表明CS 與酪蛋白發(fā)生分子內(nèi)或分子間的相互作用，這也說明CS 對酪蛋白有一定的熒光猝滅效果。同時，添加同濃度的CS，HDCS 對酪蛋白的熒光猝滅效果更明顯。這主要是由于HDCS 分子鏈上的帶電基團增加，與酪蛋白分子結(jié)合后折疊纏繞，比LDCS 對Trp 殘基覆蓋全面，因此猝滅效果更明顯。

圖2 不同脫乙酰度CS 的電泳遷移率Fig.2 Electrophoretic mobility of chitosan with different degrees of deacetylation

表1 不同D.D 值的CS 的電荷密度ZNTable 1 Charge density ZN of chitosan with different degrees of deacetylation

表2 不同D.D 值CS 的電位與基于Ohshima 軟粒子模型電位比較Table 2 Comparison of ζ-potentials of chitosan with different degrees of deacetylation and potentials based on Ohshima soft particle model

如圖4所示，以CS 的濃度[Q]為橫坐標，F(xiàn)0/F為縱坐標，制得溫度303K 和313K 時不同D.D 的CS 猝滅酪蛋白的Stern-Volmer 圖，斜率即Ksv。表3 是根據(jù)公式8 的得到的Stern-Volmer 常數(shù)（Ksv）和雙分子速率猝滅常數(shù)（Kq）。在溫度303 K和313 K 時的雙分子速率猝滅常數(shù)值均大于最大擴散碰撞速率常數(shù)2.0×1010，這表明CS 對酪蛋白的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。Stern-Volmer 常數(shù)（Ksv）與溫度呈反比，即Stern-Volmer 常數(shù)（Ksv）隨著溫度的升高而下降，這說明CS 對酪蛋白的猝滅方式是靜態(tài)而非動態(tài)的。

圖3 CS 對酪蛋白的熒光猝滅光譜圖Fig.3 The quenching fluorescence spectrometry of chitosan on casein intensity

圖4 不同溫度下CS 猝滅酪蛋白的Stem-Volmer 圖Fig.4 Stem-Volmer curve of chitosan quenching casein at different temperatures

表3 不同溫度下CS-酪蛋白相互作用的Stern-Volmer 常數(shù)和雙分子速率猝滅常數(shù)Table 3 Stern-Volmer constant and bimolecular rate quenching constant of CS-casein interaction

2.3.2 結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)的確定 如圖5所示，在不同溫度下，以lg[Q]為橫坐標，lg[（F0-F）/F]為縱坐標作圖，直線的斜率和截距分別代表結(jié)合位點數(shù)n 和結(jié)合常數(shù)KA。計算得出的結(jié)合位點數(shù)n 和結(jié)合常數(shù)KA 見表4。HDCS 在303K 和313K時的結(jié)合位點數(shù)分別為1.29 和1.36，在相同條件下LDCS 的結(jié)合位點數(shù)分別是1.47 和1.44。二者的結(jié)合位點n 均在1 附近，說明不同D.D 的CS 與酪蛋白均只有一個結(jié)合位點。

2.3.3 作用力類型的分類 由公式（10）、（11）、（12）求得CS-酪蛋白間相互作用的ΔH、ΔS 和吉布斯自由能ΔG，結(jié)果見表5。

圖5 不同溫度下CS 猝滅酪蛋白的雙對數(shù)圖Fig.5 Double logarithmic plot of CS quenching protein at different temperatures

表4 不同溫度下CS 和酪蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)Table 4 Binding constant and binding site number of CS and casein at different temperatures

表5 CS 和酪蛋白相互作用的熱力學參數(shù)和主要作用力類型Table 5 Thermodynamic parameters and major types of interaction between CS and casein

表5 中，在pH 6.0，溫度303K 和313K 條件下的吉布斯自由能△G＜0，表明CS 和酪蛋白間的相互作用是自發(fā)的。HDCS-酪蛋白間的相互作用過程中△H＜0，△S＞0，表明二者的相互作用力以靜電力作用為主，CS 和酪蛋白復合過程中，CS 的正電荷與酪蛋白中的負電荷發(fā)生靜電力相互作用。而LDCS-酪蛋白間的相互作用過程中△H＞0，△S＞0，表明二者間主要以疏水作用力為主，這可能是由于pH 6.0 時LDCS 分子結(jié)構(gòu)中的疏水基團多于HDCS。

2.4 CS-酪蛋白復合溶液的紫外-可見吸收光譜分析

如圖6所示，在pH 6.0 時，酪蛋白溶液紫外特征吸收峰在波長275 nm 附近，主要是由酪氨酸（Tyr）殘基貢獻。隨著CS 的加入，酪蛋白的紫外吸收峰值逐漸增加，這說明CS 氨基與酪蛋白之間發(fā)生分子間或分子內(nèi)的相互作用。添加LDCS 的酪蛋白溶液紫外吸收峰基本不變，說明LDCS 的加入未使酪蛋白中Tyr 的微環(huán)境發(fā)生改變。相反的，添加HDCS 的酪蛋白復合溶液紫外最大吸收峰出現(xiàn)輕微紅移（像右移動），表明HDCS 的加入使得酪蛋白中的Tyr 的微環(huán)境發(fā)生改變，導致其極性升高，疏水性降低。

2.5 CS-酪蛋白復合物的傅里葉紅外光譜（FTIR）分析

圖7 中，從CS、酪蛋白和CS-酪蛋白復合物中都檢測到-OH 伸縮振動吸收峰，分別在3 440，3 436，3 434 cm-1處。酪蛋白的FTIR 圖譜顯示，1 637 cm-1處的吸收峰是酰胺Ⅰ帶-C=O 的伸縮振動，1 540 cm-1的吸收峰是酰胺II 帶-C-N 的伸縮振動和-N-H 的彎曲振動，1 439 cm-1為-C-H 的彎曲振動。CS 的FTIR 圖譜中，在1 659 cm-1處的吸收峰是酰胺Ⅰ帶-C=O 的伸縮振動，1 596 cm-1處的吸收峰是-N-H 的彎曲振動，1 420 cm-1處是-CH2的彎曲振動，1 375 cm-1處是-C-H 的伸縮運動，1 319 cm-1處是酰胺Ⅲ帶-C-NH2的伸縮振動，1 155 cm-1處是C-O-C 的對稱收縮，1 081 cm-1處的吸收峰是-C-O 的拉伸振動；CS-酪蛋白復合物的FTIR 光譜圖中出現(xiàn)1 569 cm-1和1 652 cm-1兩個新的吸收峰，CS 在1 596 cm-1處的吸收峰與酪蛋白在1 637 cm-1吸收峰的消失，說明CS 中的-NH3+基團和酪蛋白中-COO-基團發(fā)生相互作用。

2.6 CS-酪蛋白復合物的流變穩(wěn)定黏度分析

如圖8所示，隨著剪切速率的增加，CS-酪蛋白復合物流變穩(wěn)態(tài)黏度總體呈現(xiàn)下降趨勢，且HDCS-酪蛋白在整個剪切速率范圍的黏度要高于LDCS-酪蛋白。如表6所示，HDCS-酪蛋白復合體系的冪律方程中κ 明顯大于LDCS-酪蛋白，正好驗證了圖8 的結(jié)論。此外，復合體系的n 均小于1，表明該復合體系為非牛頓流體，在較高的剪切速率下，整個體系的黏度趨于穩(wěn)定，出現(xiàn)剪切變稀的現(xiàn)象，說明CS-酪蛋白復合體為典型的假塑性流體。

圖6 CS-酪蛋白復合溶液的紫外-可見吸收光譜圖Fig.6 UV-visible absorption spectrum of CS-casein complex solution

圖7 CS、酪蛋白及CS-酪蛋白復合物的FTIR 光譜圖Fig.7 FTIR spectra of CS，casein and CS-casein complex

表6 CS-酪蛋白復合體系的冪律方程參數(shù)Table 6 Power law equation parameters of CS-casein complex system

圖8 CS-酪蛋白復合物流變穩(wěn)態(tài)黏度隨剪切速率的變化曲線Fig.8 Curve of steady-state viscosity versus shear rate of CS-casein complex

3 結(jié)論

基于多糖本身的帶電特性，研究了不同帶電特性的CS 與酪蛋白的非共價相互作用。通過熒光光譜、紫外-可見光譜、紅外吸收光譜等表征方法弄清CS 中的-NH3+基團和酪蛋白中-COO-基團發(fā)生了相互作用。HDCS-酪蛋白間的相互作用主要為靜電相互作用，LDCS-酪蛋白則主要為疏水相互作用。流變穩(wěn)態(tài)黏度分析顯示，HDCS-酪蛋白復合物的黏度要高于LDCS-酪蛋白復合物，說明CS-酪蛋白復合體為典型的假塑性流體。