基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)當(dāng)歸黃柏治療慢性前列腺炎的作用機(jī)制研究?

劉勝京，郭 軍，王 福，張繼偉，晏 斌，杜冠潮，高慶和△

(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病。據(jù)報(bào)道，35%～50%的男性曾受到CP癥狀的影響[1]。國(guó)外1項(xiàng)10600人的調(diào)查顯示，CP的發(fā)病率為8.2%[2]。國(guó)內(nèi)關(guān)于CP的流行病學(xué)研究因調(diào)查方法及調(diào)查人群的不同，發(fā)病率差異較大，處于6%～-32.9%之間，高于國(guó)外的文獻(xiàn)報(bào)道[3]。隨著環(huán)境、社會(huì)及生活方式的改變，CP發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì)[2]。目前西醫(yī)治療CP主要以抗生素、α受體阻滯劑、非甾體抗炎藥為主，多為經(jīng)驗(yàn)性治療，治療效果不佳，尚無(wú)治療CP的有效藥物[4]。CP屬于中醫(yī)學(xué)“精濁”“淋濁”“白淫”等范疇，臨床實(shí)踐證明中醫(yī)藥是治療CP的重要方法之一。

本研究前期通過(guò)臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)及數(shù)據(jù)挖掘中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院首席研究員、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科主任郭軍教授治療CP的用藥處方規(guī)律，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸-黃柏為治療CP的核心藥對(duì)，且郭軍教授基于“瘡瘍內(nèi)消法”以當(dāng)歸和黃柏為君藥，擬定方劑歸黃方，臨床多獲良效[5]。郭軍教授認(rèn)為，當(dāng)歸質(zhì)潤(rùn)性動(dòng)，活血行滯止痛；黃柏性寒潤(rùn)降，清熱瀉火燥濕，此藥對(duì)活血、清濕熱之功著，清熱而不傷陰，活血以消瘀滯，對(duì)濕熱瘀滯型CP有較好效果?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸提取物具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗凝作用，并可提高熱刺激致痛的痛閾[6]。黃柏抑制金黃色葡萄球菌效果較強(qiáng)，有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用[7]。目前關(guān)于CP的機(jī)制研究主要集中在炎癥免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)機(jī)制，其中對(duì)于導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的基因及作用機(jī)制研究日益受到重視[8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，對(duì)藥物有效成分進(jìn)行多靶點(diǎn)、多途徑生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)分析的方法[9]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討當(dāng)歸-黃柏多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，預(yù)測(cè)當(dāng)歸-黃柏治療CP的可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步分析其活性成分和作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 當(dāng)歸-黃柏活性成分及靶點(diǎn)的篩選

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)(http://tcmspw.com/)檢索當(dāng)歸、黃柏的所有活性成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為篩選條件，并在中國(guó)知網(wǎng)及PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中查閱當(dāng)歸、黃柏目前已研究的主要相關(guān)活性成分進(jìn)行補(bǔ)充。

根據(jù)已經(jīng)得到的化合物，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其成分進(jìn)行打靶提取，對(duì)于補(bǔ)充得到的化合物，首先在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取化合物對(duì)應(yīng)的SMILES結(jié)構(gòu)，并錄入pharmmapper數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)進(jìn)行靶點(diǎn)垂釣，匯總?cè)ブ睾蟮玫疆?dāng)歸-黃柏的最終預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中將種屬選擇“Homo sapiens”對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 CP的疾病靶點(diǎn)

通過(guò)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org/)檢索CP的疾病靶點(diǎn)，檢索詞為“chronic prostatitis”，匯總整理后去重得到CP對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用R語(yǔ)言軟件(https://www.r-project.org/)對(duì)校正后的藥物靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)進(jìn)行取交集處理，得到藥物與疾病的共同靶點(diǎn)。

1.4 可視化網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥物活性成分、藥物和疾病共同靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)文件等導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)展示當(dāng)歸-黃柏活性成分與CP間相互作用的關(guān)系。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用STRING平臺(tái)(https://string-db.org/)構(gòu)建(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，將最低相互閾值設(shè)為0.95。應(yīng)用R語(yǔ)言軟件將出現(xiàn)頻次前20的基因繪制條形圖。

1.6 GO分析和KEGG通路富集分析

利用David網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)，將中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因symbol轉(zhuǎn)換為基因ID。利用R語(yǔ)言軟件通過(guò)基因功能注釋(gene ontology，GO) 和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行基因功能及通路的注釋分析，并將結(jié)果以條形圖或氣泡圖形式呈現(xiàn)，根據(jù)核心通路富集程度探究當(dāng)歸、黃柏治療CP可能的作用機(jī)制。以上R包的下載通過(guò)R3.6.1以及Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸、黃柏活性成分及靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選當(dāng)歸、黃柏的活性成分，去重后共得到38個(gè)活性成分。通過(guò)檢索當(dāng)歸與黃柏藥理學(xué)研究的相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)所得成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸中的Ligustilide、Butylidenephthalide、glucuronic acid、galacturonic acid、Ferulic Acid、senkyunolide、vanillic acid、neocnidilide，經(jīng)多篇文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)具有較高的生物學(xué)活性，故將其納入潛在活性成分進(jìn)行分析[6, 10]。通過(guò)TCMSP及pharmmapper數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所得活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，去重后通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行校正。

最終篩選后共得到當(dāng)歸-黃柏的46個(gè)活性成分、212個(gè)校正靶點(diǎn)，其中當(dāng)歸主要包括揮發(fā)油類、有機(jī)酸類、甾醇類、內(nèi)酯類等共10個(gè)活性成分，作用靶點(diǎn)140個(gè)；黃柏主要包括生物堿類、甾醇類、黃酮類等共37個(gè)活性成分，作用靶點(diǎn)98個(gè)；共同活性成分1個(gè)，為β-谷甾醇(beta-sitosterol)。

2.2 CP的疾病靶點(diǎn)篩選

通過(guò)檢索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)得到CP的疾病靶點(diǎn)，分別篩選到7376個(gè)和23個(gè)靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)去重共得到7397個(gè)CP的疾病治療靶點(diǎn)。

2.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用R語(yǔ)言軟件對(duì)校正后的藥物靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)取并集獲得共同靶點(diǎn)，共同靶點(diǎn)數(shù)為159個(gè)。

2.4 可視化網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥物活性成分、藥物和疾病共同靶點(diǎn)等導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病的可視化網(wǎng)絡(luò)圖共包括191個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中靶點(diǎn)159個(gè)，活性成分30個(gè)，疾病和藥物各1個(gè)。圖中橙色代表藥物，綠色代表活性成分，藍(lán)色代表藥物與疾病相互作用靶點(diǎn)，墨綠色代表疾病，相連的邊表示藥物、成分與疾病靶點(diǎn)的互相作用關(guān)系(見(jiàn)圖1)。

圖1 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病互作網(wǎng)絡(luò)

圖2 共同靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 PPI互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共同靶點(diǎn)輸入STRING平臺(tái)，構(gòu)建共同靶點(diǎn)PPI互作網(wǎng)絡(luò)，選取置信度高于0.95的數(shù)據(jù)得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖2)。應(yīng)用R語(yǔ)言軟件統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)頻次前20的靶點(diǎn)并繪制條形圖(見(jiàn)圖3)。通過(guò)PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析可見(jiàn)蛋白互作頻次較高的有腫瘤抑制基因(TP53)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR、ESR1、EGF)、核受體輔激活蛋白1(NCOA1)、特異性周期蛋白D1(CCND1)、白介素6(IL6)、凋亡信號(hào)分子(CASP3，CASP8)等，是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)蛋白。

圖3 當(dāng)歸-黃柏治療CP核心基因

2.6 GO分析和KEGG通路富集分析

對(duì)所獲得的當(dāng)歸-黃柏差異基因進(jìn)行富集分析，從生物途徑(biology process，BP)、細(xì)胞定位(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類，得到基因富集情況的柱狀圖(見(jiàn)圖4)。對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到通路富集的氣泡圖(見(jiàn)圖5)。在柱狀圖及氣泡圖中，柱狀圖高度/圓圈的大小代表富集的數(shù)目，顏色代表富集的顯著程度，P值越小顯著程度越高、顏色越紅。排除廣泛通路后，選出排名前10的信號(hào)通路進(jìn)行分析(見(jiàn)表1)。經(jīng)文獻(xiàn)檢索結(jié)合前期研究，最終選出3條與當(dāng)歸-黃柏治療CP最可能相關(guān)的核心信號(hào)通路，分析其核心基因數(shù)目、名稱及來(lái)源(見(jiàn)表2)。

3 討論

本研究經(jīng)初步篩選得到當(dāng)歸-黃柏46個(gè)活性成分，其中當(dāng)歸的主要活性成分為藁本內(nèi)酯(ligustilide)。藥理學(xué)研究證實(shí)，其能抑制多種炎性因子表達(dá)抗炎作用，實(shí)驗(yàn)證明藁本內(nèi)酯對(duì)CP模型大鼠的前列腺病理和痛覺(jué)敏感性有改善作用[11-12]。黃柏活性成分中口服利用度最高的化合物為鹽酸巴馬汀(palmatine，OB=64.6%)，藥理學(xué)研究證實(shí)，具有抗細(xì)菌、病毒、真菌感染以及抗癌作用[13]?；钚猿煞种蓄愃幮暂^高的化合物為甲基黃連堿(Worenine，DL=0.87)和黃連堿(coptisine，DL=0.86)，具有抗炎、抗氧化的作用[14]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》謂當(dāng)歸“諸惡瘡瘍，金創(chuàng)，煮飲之”[15]，《本草綱目》謂黃柏“口舌生瘡，用黃柏含之良”“兩股生瘡，其汁淋瀝，用黃柏末摻之，立愈”[16]。本草古籍所載與實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上有吻合之處，具有一定參考價(jià)值。除度值較高的靶點(diǎn)，當(dāng)歸-黃柏藥對(duì)還有許多成分、靶點(diǎn)與其他疾病有關(guān)，值得進(jìn)一步挖掘。

表1 當(dāng)歸-黃柏靶點(diǎn)通路富集結(jié)果比較(前10)

圖4 當(dāng)歸-黃柏活性成分治療CP的關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析柱狀圖

圖5 KEGG 通路富集氣泡圖

表2 核心信號(hào)通路靶點(diǎn)富集比較

根據(jù)篩選出的46個(gè)活性成分，預(yù)測(cè)相關(guān)靶點(diǎn)212個(gè)，通過(guò)與疾病靶點(diǎn)取交集處理發(fā)現(xiàn)，兩者的共同靶點(diǎn)有159個(gè)，說(shuō)明當(dāng)歸-黃柏治療CP的覆蓋范圍較廣，藥物靶向性較好。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得到蛋白互作頻次較高的基因，主要包括癌癥相關(guān)基因(TP53)、表皮生長(zhǎng)因子(EGFR，ESR1，EGF)、炎癥基因(IL-6)、凋亡信號(hào)分子(CASP3，CASP8)等。目前研究表明，CP中表皮生長(zhǎng)因子EGFR、EGF表達(dá)情況明顯高于正常前列腺組織，與CP的發(fā)病呈正相關(guān)[17-18]。細(xì)胞因子IL-6能夠激活淋巴細(xì)胞分化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的作用，且CP患者精漿中IL-6變化水平可作為CP的1項(xiàng)預(yù)測(cè)指標(biāo)，對(duì)CP的診斷具有一定價(jià)值[19]。

基因功能注釋分析結(jié)果顯示，差異基因最可能相關(guān)的生物途徑主要涉及異源生物刺激反應(yīng)、類固醇激素反應(yīng)、抗生素反應(yīng)、氧化相關(guān)反應(yīng)等；分子功能主要涉及膜筏、膜區(qū)、膜微區(qū)、突觸前膜和突觸后膜成分、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、核染色質(zhì)等，細(xì)胞定位主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性等。

通路富集分析結(jié)果提示，當(dāng)歸-黃柏可能涉及表1中多條信號(hào)通路，其中與表2中的PI3K-Akt信號(hào)通路(22個(gè)靶點(diǎn))、MAPK信號(hào)通路(15個(gè)靶點(diǎn))、HIF-1信號(hào)通路(13個(gè)靶點(diǎn))作用關(guān)系相對(duì)更為密切。對(duì)此3條信號(hào)通路分析顯示，在與治療CP相關(guān)的機(jī)制中，當(dāng)歸-黃柏的多成分均參與作用，體現(xiàn)了中藥多途徑的治療特點(diǎn)，也體現(xiàn)了當(dāng)歸-黃柏藥對(duì)治療的協(xié)同作用。PI3K-Akt信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化凋亡等，與炎癥、腫瘤和生殖系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。通過(guò)抑制PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化以及上下游調(diào)質(zhì)的釋放，可減輕炎癥痛及神經(jīng)病理性疼痛[20-21]。MAPK信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)的重要系統(tǒng)，其家族信號(hào)通路包括P38MAPK、ERKs、JNK/SAPK、ERK5/BMK1，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程，并與炎癥、腫瘤等密切相關(guān)[22-23]。其中p38 MAPK信號(hào)通路與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控更為密切，被認(rèn)為是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)和共同通路[24]。目前有實(shí)驗(yàn)及研究表明，p38MAPK通路抑制會(huì)使大鼠機(jī)械和熱痛的痛閾下降，并能調(diào)控IL-6、TNF-α等多種細(xì)胞因子抑制炎癥細(xì)胞的聚集或活化[25-26]。當(dāng)歸-黃柏可能涉及調(diào)控PI3K-Akt、MAPK、HIF-1等信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、氧化與抗氧化等生物學(xué)過(guò)程治療CP。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，篩選當(dāng)歸-黃柏藥對(duì)的活性成分及作用靶點(diǎn)，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，并進(jìn)一步預(yù)測(cè)當(dāng)歸-黃柏治療CP的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)與相關(guān)通路，體現(xiàn)當(dāng)歸-黃柏對(duì)CP多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療特點(diǎn)，為CP的治療提供思路借鑒，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用機(jī)制提供理論依據(jù)。