中醫(yī)失眠證候模型的研究述評(píng)

葉鈺娟，李昕蓉，曹夢(mèng)琪，鄒依純，馬 翠，嚴(yán)興科

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，蘭州 730000)

失眠是臨床常見病、多發(fā)病，是以不能獲得正常睡眠且影響日間工作及日常生活為臨床特征的一類疾病[1-2]。長期失眠易損害機(jī)體健康，影響人們的生活質(zhì)量及工作效率[3]。中醫(yī)藥是臨床防治失眠的有效方法之一，能夠顯著增加失眠患者入睡時(shí)間，改善睡眠質(zhì)量[4]。近年來，中醫(yī)藥干預(yù)失眠的機(jī)制研究日益深入[5]，中醫(yī)失眠證候模型的制備在失眠機(jī)制研究中具有重要意義[6]。目前常見的失眠動(dòng)物模型復(fù)制以嚙齒類動(dòng)物如大、小鼠為主[7-8]，主要因其與人類的神經(jīng)調(diào)節(jié)和睡眠機(jī)制相似，且可操作性強(qiáng)，在神經(jīng)系統(tǒng)類疾病動(dòng)物模型的制備中應(yīng)用廣泛[9]。當(dāng)前關(guān)于中醫(yī)失眠證候模型的制備主要以肝郁型、心腎不交型和陰虛型為主，其他證候類型報(bào)道較少；其復(fù)制方法主要有應(yīng)激為主的物理方法和以藥物注射為主的化學(xué)方法，現(xiàn)就相關(guān)內(nèi)容述評(píng)如下。

1 肝郁氣滯、肝郁化火型

1.1 物理方法

1.1.1 夾尾刺激+快速眼動(dòng)睡眠(REMS)剝奪法 肝郁致瘀，血瘀證與血漿中血管舒張劑前列環(huán)素(epoprostenol，PGI2)、血管收縮劑血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)的水平密切相關(guān)，且通過觀察血漿中PGI2和TXA2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物6-酮-前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)和血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)的變化，可反映PGI2、TXA2的水平[10]。游秋云等[11]采用夾尾刺激+REMS剝奪法復(fù)制肝郁失眠證候大鼠模型。模型復(fù)制后監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，大鼠總睡眠時(shí)間減少，且晝夜節(jié)律紊亂，提示大鼠處于失眠狀態(tài)；同時(shí)出現(xiàn)眼色暗紅、活動(dòng)減少、激惹回避等類似臨床肝郁表現(xiàn)，且血漿中TXB2含量顯著升高，6-keto-PGF1a含量明顯降低，說明肝郁失眠模型造模成功；隨后研究者采用舒郁安神方灌胃，上述癥狀及異常指標(biāo)明顯改善，“以方測證”佐證肝郁型失眠模型成功復(fù)制。

“以方測證”依據(jù)方劑或組成藥物的功效，推測或反證對(duì)應(yīng)證候的屬性[12]。由于動(dòng)物模型復(fù)雜性及不確定性，該法為佐證中醫(yī)證候動(dòng)物模型制備的常用方法。

1.1.2 改良小平臺(tái)水環(huán)境間斷睡眠剝奪法 盧巖等[13]用改良小平臺(tái)水環(huán)境間斷睡眠剝奪法[14]復(fù)制肝郁失眠大鼠模型，模型組大鼠出現(xiàn)睡眠時(shí)間減少、興奮性提高，同時(shí)大鼠警覺性、進(jìn)攻等行為提高，出現(xiàn)易激惹、精神萎靡、毛發(fā)雜亂無光澤等類似臨床肝郁表現(xiàn)，且大鼠丘腦內(nèi)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、γ-氨基丁酸(aminobutyric acid，GABA)含量降低，去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)含量明顯升高，說明本模型成功模擬了臨床肝郁失眠特征。同時(shí)“疏肝調(diào)神”針法干預(yù)后上述指標(biāo)均有改善，進(jìn)一步證實(shí)肝郁證失眠大鼠模型成功復(fù)制。

1.1.3 慢性束縛法+復(fù)合慢性疼痛刺激法 何林熹等[15]采用慢性束縛法復(fù)合慢性疼痛刺激法復(fù)制肝郁化火證失眠大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠24 h自發(fā)活動(dòng)量顯著增加且睡眠節(jié)律紊亂，伴有高度緊張、具有攻擊性、目光焦灼、耳廓干焦、鼻尖及四肢趾端發(fā)紅等類似臨床肝郁化火表現(xiàn)，同時(shí)藍(lán)斑核去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(norepinephrine transporter，NET)平均光密度值和血漿NE含量顯著升高，提示藍(lán)斑核處于興奮狀態(tài)，與動(dòng)物的宏觀表征相符，說明此模型符合臨床肝郁化火證失眠特征；且采用龍膽瀉肝湯合朱砂安神丸作為治療藥物可有效緩解上述癥狀及指標(biāo)，佐證肝郁化火證失眠模型成功復(fù)制。

1.1.4 電柵刺激法 李越峰等[16]采用電柵刺激法復(fù)制肝郁失眠大鼠模型，模型復(fù)制后大鼠出現(xiàn)慢波睡眠第1期(SWS1)、慢波睡眠第2期(SWS2)及總睡眠時(shí)間(TST)減少，且腦電圖(EEG)和肌電圖(EMG)顯示大鼠覺醒時(shí)間明顯增多。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，電擊可以使大鼠出現(xiàn)易激怒、好斗等類似于臨床肝郁的體征[17]，表明該法成功模擬臨床肝郁失眠特征。同時(shí)研究者[16]采用四逆散凍干粉灌胃后，上述指標(biāo)均有改善，提示肝郁證失眠大鼠模型復(fù)制成功。模型復(fù)制過程中用EEG、EMG有創(chuàng)性操作作為檢測睡眠狀況指標(biāo)，在植入動(dòng)物體內(nèi)對(duì)其睡眠會(huì)造成不同程度影響[18]。

1.2 化學(xué)方法

1.2.1 慢性夾尾刺激和腹腔注射PCPA復(fù)合因子法 朱潔等[19]采用慢性夾尾刺激和腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸(para-chlorophenylalanine,PCPA)復(fù)合因子方法復(fù)制肝郁證失眠大鼠模型，刺激后大鼠出現(xiàn)睡眠節(jié)律消失且活動(dòng)及進(jìn)食明顯減少，毛發(fā)散亂枯燥、胡須下垂等癥狀；同時(shí)大鼠的肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，全血黏度及NE含量顯著升高，5-HT含量明顯降低，動(dòng)物宏觀體征類似臨床肝郁失眠特征；采用酸棗仁湯作為佐證藥物，發(fā)現(xiàn)上述微觀指標(biāo)顯著改善，說明肝郁證失眠大鼠模型成功復(fù)制。

1.2.2 腹腔注射PCPA 劉倩等[20]采用腹腔注射PCPA復(fù)制肝郁證失眠大鼠模型，造模后大鼠出現(xiàn)入睡率顯著降低，伴有興奮、煩躁、易激惹等類似臨床肝郁的癥狀，大鼠腦內(nèi)5-HT含量明顯降低，模型符合肝郁失眠臨床實(shí)際。采用調(diào)和肝脾方(組成:柴胡、黃芩、干姜、合歡皮等)干預(yù)后上述癥狀及指標(biāo)有所緩解，佐證肝郁證失眠模型復(fù)制成功。

2 心腎不交證失眠型

2.1 物理方法

水環(huán)境小平臺(tái)法：全世建等[21]采用水環(huán)境小平臺(tái)法復(fù)制心腎不交證失眠模型[22]，模型制作后發(fā)現(xiàn)大鼠入睡率降低，伴有喜扎堆、貼邊、瞇眼、精神萎靡等癥狀，且中樞神經(jīng)遞質(zhì)GABA水平顯著降低，增食素Orexin A水平明顯升高，說明該模型符合臨床心腎不交型失眠特點(diǎn)；采用交泰丸干預(yù)后，相關(guān)指標(biāo)改善，表明心腎不交證失眠大鼠模型成功復(fù)制。

2.2 化學(xué)方法

2.2.1 腹腔注射PCPA 趙俊云等[23]采用腹腔注射PCPA復(fù)制心腎不交證失眠大鼠模型，造模后，下丘腦-垂體-腎上腺(The hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA軸)較活躍，血清腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin-releasing factor,CRF)、血清酶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1[DNA (cytosine-5)-Methyltransferase 1，DNMT1]活性上升，說明腹腔注射PCPA可引起大鼠HPA軸激素水平上升，提示大鼠處于失眠狀態(tài)；采用交泰丸灌胃后上述指標(biāo)顯著下降，進(jìn)一步佐證心腎不交證失眠大鼠模型建立。

2.2.2 母乳鼠分離法+多種焦慮刺激+PCPA 研究表明，幼年期強(qiáng)烈應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致成人期出現(xiàn)心腎不交證失眠，母乳鼠分離法能夠很好地模擬這一刺激[24-25]。郜紅利等[26]采用母乳鼠分離法、多種焦慮刺激+腹腔注射PCPA復(fù)制心腎不交證失眠大鼠模型，刺激后大鼠睡眠時(shí)間顯著減少，且出現(xiàn)目光呆滯，雙眼及口唇蒼白，皮毛枯槁蓬亂，同時(shí)血漿中促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing，CRH)水平顯著性升高，表明該實(shí)驗(yàn)成功模擬了心腎不交證失眠大鼠HPA軸內(nèi)分泌紊亂特點(diǎn)。

2.2.3 復(fù)合刺激+PCPA 楊鈺涵等[27]在腹腔注射PCPA[28]和多因素共同作用[26]基礎(chǔ)上復(fù)制心腎不交證失眠模型，隨后發(fā)現(xiàn)大鼠睡眠時(shí)間減少，伴精神萎靡、毛發(fā)枯槁且易脫落、反應(yīng)遲鈍、爪甲冰涼等符合心腎不交證臨床癥狀；ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)，ACTH、CRH均升高，提示HPA軸激活。全世建等[29]發(fā)現(xiàn)，交泰丸“交通心腎”的作用機(jī)理是其對(duì)HPA軸的ACTH、CRH，從而提示心腎不交證失眠模型的成功復(fù)制。

3 陰虛型失眠

3.1 化學(xué)方法

3.1.1 腹腔注射PCPA 研究者發(fā)現(xiàn)，良好睡眠有助于機(jī)體發(fā)揮抗氧化應(yīng)激效應(yīng)[30]。Trx系統(tǒng)主要由還原型輔酶II(nicotinamide adenosine denucleotide hydro-phosphoric acid，NADPH)、硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)和硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)組成。在NADPH、TrxR的催化作用下，Trx可以保持還原型狀態(tài)。TrxR的活性以及表達(dá)量直接影響還原型Trx的生成，進(jìn)而影響機(jī)體抗氧化過程[31]。謝光璟等[32]采用腹腔注射PCPA法復(fù)制陰虛證失眠模型，造模后大鼠24 h晝夜自主活動(dòng)節(jié)律紊亂，伴有興奮性顯著增高，且下丘腦細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白NADPH、Trx1陽性細(xì)胞顯著減少，TrxR1表達(dá)明顯增加，以上宏觀癥狀符合臨床陰虛失眠體征；同時(shí)天王補(bǔ)心丹干預(yù)后，上述癥狀及指標(biāo)明顯改善，佐證陰虛證失眠模型成功復(fù)制。

3.1.2 咖啡因腹腔注射疊加多平臺(tái)水環(huán)境持續(xù)睡眠剝奪法 黃攀攀等[33]采用咖啡因腹腔注射+多平臺(tái)水環(huán)境睡眠剝奪法復(fù)制失眠大鼠模型，模型復(fù)制后大鼠出現(xiàn)睡眠時(shí)間明顯減少，同時(shí)力竭游泳時(shí)間縮短，且精神萎靡、雙目及口唇蒼白、皮毛重度枯槁蓬亂、爪甲粗糙，說明陰虛失眠大鼠模型復(fù)制成功；天王補(bǔ)心丹干預(yù)后上述癥狀明顯緩解，提示陰虛證失眠模型復(fù)制成功。

3.1.3 甲狀腺素片混懸液灌服 Xiong等[34]采用甲狀腺素片混懸液20.5 mg(kg/d)-1灌服法復(fù)制陰虛證失眠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠自發(fā)活動(dòng)、飲水量、進(jìn)食量顯著增加，體質(zhì)量顯著降低，其整體癥狀符合心陰虛證中心悸、怔忡、不寐等證候，提示甲狀腺素片混懸液灌服法可以復(fù)制陰虛證失眠模型。

4 陽虛型失眠

4.1 化學(xué)方法

4.1.1 腹腔注射PCPA+切除產(chǎn)熱物質(zhì) 韋祎等[35]采用“BAT切除術(shù)”復(fù)合PCPA腹腔注射法復(fù)制脾陽虛證失眠模型，觀察發(fā)現(xiàn)大鼠晝夜活動(dòng)增多，且出現(xiàn)畏冷寒戰(zhàn)、喜扎堆、拱背少動(dòng)、體毛不榮等陽虛癥狀，orexin mRNA表達(dá)含量升高，5-HT含量降低，提示陽虛失眠模型成功制備；附子理中湯灌胃后上述癥狀及指標(biāo)均有改善，佐證陽虛證失眠模型復(fù)制成功。

4.1.2 腹腔注射PCPA+肌肉注射氫化可的松 王志鵬[36]采用腹腔注射PCPA+肌肉注射氫化可的松方法復(fù)制陽虛失眠大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠毛發(fā)雜亂、晝夜節(jié)律消失，畏縮蜷臥，易激惹、尾溫降低，尾、爪皮膚蒼白等類似于臨床陽虛癥狀，且腦組織中5-HT、NE含量升高，表明陽虛失眠模型成功制備。經(jīng)桂甘龍牡湯灌胃后上述癥狀及指標(biāo)均顯著改善，佐證陽虛證失眠模型復(fù)制成功。

5 討論及展望

復(fù)制失眠證候模型是中醫(yī)治療失眠機(jī)制研究的重要手段和載體。常用失眠證候模型制備以物理方法(水平臺(tái)環(huán)境法、快速動(dòng)眼睡眠剝奪法、電柵刺激、慢性束縛法復(fù)合慢性疼痛刺激法)和化學(xué)方法(腹腔注射PCPA)為主，臨床上失眠類型以肝郁型、心腎不交型、陰虛型和陽虛型較常見，故失眠證候模型研究也以上述類型為主，其他類型關(guān)注較少。

文獻(xiàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，部分中醫(yī)證候模型的復(fù)制只有微觀指標(biāo)，如采用單胺類神經(jīng)遞質(zhì)作為模型評(píng)價(jià)指標(biāo)，缺乏中醫(yī)四診合參和病證結(jié)合辨證思路[37]，因此在今后模型評(píng)定過程中應(yīng)注意兩者相結(jié)合。因中藥成分復(fù)雜，體內(nèi)藥理反應(yīng)難以控制，因此單一指標(biāo)升高或降低說服力不高，故在今后中醫(yī)證候失眠模型復(fù)制過程中，應(yīng)注意癥狀學(xué)與病理生理學(xué)相結(jié)合[38]。由于大多數(shù)模型采用正常動(dòng)物復(fù)制，存在一定可逆性，此類失眠動(dòng)物模型具有一定的局限性[39]；目前失眠模型報(bào)道大多選擇嚙齒類動(dòng)物鼠類，但鼠類與人類睡眠時(shí)相及周期與人類存在差異，不能很好地模擬臨床失眠，因此失眠模型動(dòng)物的選擇是今后急需關(guān)注的問題。此外臨床失眠由多種因素造成，要使失眠動(dòng)物模型復(fù)制更符合臨床實(shí)際，復(fù)制涵蓋多因素的模型是將來失眠模型改進(jìn)的切入點(diǎn)[40]。中醫(yī)失眠模型復(fù)制是近年來研究者探索較多的內(nèi)容，因此針對(duì)不同失眠證型，研究出科學(xué)合理的睡眠剝奪模型還需要深入探索與研究。