真武湯治療慢性心力衰竭的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究?

高 攀，張 姍，焦巨英，婁 妮，李 希，王幼平Δ

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000； 2. 虞城縣人民醫(yī)院，河南商丘 476300； 3. 大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，遼寧大連 116044； 4. 大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院， 遼寧大連 116044)

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是指持續(xù)存在的心力衰竭狀態(tài)，是各種心臟疾病發(fā)展的終末階段，隨著年齡增長(zhǎng)，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。目前臨床多采用正性肌力藥、利尿劑、擴(kuò)張血管等藥物進(jìn)行對(duì)癥治療，但效果不甚理想[2]。

真武湯源于《傷寒論》，由附子、生姜、白術(shù)、茯苓、白芍組成，具有溫陽(yáng)利水的功效，主要治療陽(yáng)虛水泛證，如心下悸動(dòng)、小便不利、四肢沉重疼痛、浮腫、以腰以下為甚。有研究證明，真武湯結(jié)合西藥治療能明顯改善慢性心力衰竭患者的臨床癥狀[3]。雖然真武湯治療慢性心力衰竭效果較好，但其作用機(jī)制的研究也僅局限于單個(gè)蛋白水平[4]，難以體現(xiàn)真武湯多成分、多靶標(biāo)的作用機(jī)制及中醫(yī)藥整體性特點(diǎn)[5]。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中醫(yī)藥系統(tǒng)性研究奠定了基礎(chǔ)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析與藥理學(xué)相結(jié)合，深入研究方劑中藥與疾病之間的復(fù)雜機(jī)制[6]。同時(shí)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法也體現(xiàn)了中藥“多成分-多靶標(biāo)”的作用特點(diǎn)，便于更好地理解中藥之間的協(xié)同作用和進(jìn)一步研究“中藥-疾病”之間的關(guān)系。本研究通過(guò)對(duì)真武湯有效成分的篩選，預(yù)測(cè)相關(guān)靶標(biāo)通路，以探討真武湯治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制。

1 材料與方法

在本課題實(shí)驗(yàn)研究中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法總體來(lái)說(shuō)可以分為以下幾步：(1)真武湯中各味藥物所含化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫(kù)建立；(2)通過(guò)口服吸收利用度和藥物相似性對(duì)成分進(jìn)行篩選；(3)成分相關(guān)靶標(biāo)的預(yù)測(cè)；(4)慢性心力衰竭相關(guān)靶標(biāo)的搜索；(5)潛在靶標(biāo)的選擇，蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和通路分析(圖1)。

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP) (http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、韓國(guó)傳統(tǒng)知識(shí)門(mén)戶(hù)數(shù)據(jù)庫(kù)(korean traditional knowledge portal, KTKP) (http:∥www.koreantk.com/ktkp2014/)、有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem (https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)、化學(xué)物質(zhì)相互作用搜索工具(STITCH) (http:∥stitch.embl.de./)、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) UniProt (https:∥www.uniprot.org/)、藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database, TTD) (http:∥bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man, OMIM) (http:∥omim.org/)、基因疾病大集合數(shù)據(jù)庫(kù)(DisGeNET) (http:∥www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)、人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù) GeneCards (https:∥www.genecards.org/)。網(wǎng)絡(luò)可視化軟件采用Cytoscape3.2.1 (http:∥www.cytoscape.org)；蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)STRING (https:∥string-db.org/)、生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(database for annotation, visualization and integrated discovery, DAVID) (https:∥david.ncifcrf.gov/home.jsp, V6.8)、蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB) (https:∥www.rcsb.org/)，在線系統(tǒng)分子對(duì)接(http:∥systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)。

圖1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析流程圖Fig.1 Workflow of network pharmacology analysis

1.2 真武湯成分的獲取與數(shù)據(jù)庫(kù)建立

通過(guò)計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái) (TCMSP)[7]和韓國(guó)傳統(tǒng)知識(shí)門(mén)戶(hù)數(shù)據(jù)庫(kù) (KTKP)[8]，獲取中藥化學(xué)成分信息，建立真武湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)等信息均使用PubChem進(jìn)行確認(rèn)。

1.3 藥代動(dòng)力學(xué)ADME 評(píng)價(jià)

所有成分均通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中納入的ADME信息進(jìn)行篩選，沒(méi)有ADME信息的成分從數(shù)據(jù)庫(kù)中刪除。研究中使用ADME篩選標(biāo)準(zhǔn)為：口服生物利用度(OB) ≥30% 和 藥物相似性(DL) ≥0.18[9]。

1.4 成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)

基于所篩選的成分，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中得到成分相關(guān)的InChI Key、Canonical SMILES和CAS number。利用Swiss Target Prediction[10]和STITCH[11]數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)成分進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，種屬設(shè)置為“Homo sapiens”，綜合閾值得分≥0.4，基因名稱(chēng)、基因ID和種屬等信息使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) (UniProt)[12]確認(rèn)。

表1 真武湯中5種中藥成分篩選比較

1.5 慢性心力衰竭相關(guān)疾病靶標(biāo)的預(yù)測(cè)

以“慢性心力衰竭”為關(guān)鍵詞，從OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)[14]、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)[15]和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[16]中獲得疾病相關(guān)靶標(biāo)，把上述4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的靶標(biāo)匯總作為疾病靶標(biāo)。

1.6 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)Cytoscape3.2.1[17]軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，在一個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中，“節(jié)點(diǎn)”可表示中藥、成分、靶標(biāo)、疾病、通路，“邊”代表各個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，節(jié)點(diǎn)的“度”表示與之相連邊的數(shù)目，節(jié)點(diǎn)的度值越大則說(shuō)明這個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中的重要性越大[18]。

1.7 潛在靶標(biāo)的選擇與分析

將成分靶標(biāo)映射到慢性心力衰竭疾病靶標(biāo)上，獲得真武湯治療慢性心力衰竭的潛在靶標(biāo)，把潛在靶標(biāo)輸入蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)(STRING)獲得蛋白-蛋白之間的相互關(guān)系(protein-protein interaction，PPI)，利用Cytoscape3.2.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用STRING[19]、DAVID[20]和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)[21]對(duì)潛在靶標(biāo)進(jìn)行功能富集分析，進(jìn)一步闡明真武湯的作用機(jī)制。設(shè)定種屬為“Homo sapiens”，根據(jù)通路富集結(jié)果，以P<0.05作為顯著功能的臨界值，利用Cytoscape3.2.1構(gòu)建中藥-成分-靶標(biāo)-疾病-通路的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 分子對(duì)接

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，利用蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)獲取蛋白結(jié)構(gòu)，利用在線分子對(duì)接網(wǎng)站(Systems Dock)對(duì)相關(guān)靶標(biāo)蛋白和成分進(jìn)行分子對(duì)接。Systems Dock是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)和分析的在線服務(wù)器，能夠通過(guò)高精度對(duì)接模擬和分子路徑圖來(lái)全面描述配體選擇性，并說(shuō)明配體如何作用于復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)。對(duì)接結(jié)果的分?jǐn)?shù)是指實(shí)驗(yàn)解離/抑制常數(shù)值 (PKD/PKI) 的負(fù)對(duì)數(shù), 分子對(duì)接分?jǐn)?shù)值通常為0～10。

2 結(jié)果

2.1 成分獲取

真武湯由白芍、白術(shù)、茯苓、附子和生姜5種中藥組成。通過(guò)TCMSP和KTKP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)共搜索到421個(gè)化合物，其中白芍126個(gè)，白術(shù)75個(gè)，茯苓35個(gè)，附子65個(gè)，生姜120個(gè)。

2.2 化合物篩選

“ADME”指機(jī)體對(duì)外源化學(xué)物吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)的過(guò)程。以藥物代謝動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)分析預(yù)測(cè)有助于理解分子機(jī)制。因此，利用藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)OB和DL值對(duì)化合物進(jìn)行篩選。以O(shè)B ≥30% 和 DL ≥0.18篩選得到421個(gè)化合物中有73個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)。在這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)之外，五沒(méi)食子酰葡萄糖(pentagalloylglucose)[22]、土莫酸(tumulosic acid)[23]和姜酚 (6-gingerol)[24]也作為活性成分進(jìn)行后續(xù)分析，最終選擇的化合物結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 化合物靶標(biāo)的預(yù)測(cè)與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

Swiss Target Prediction是一個(gè)在線服務(wù)器，能夠與已知配體的二維和三維相似性測(cè)量相結(jié)合，精確預(yù)測(cè)生物活性分子的目標(biāo)。STITCH整合了代謝途徑和晶體結(jié)構(gòu)，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)和藥物靶向關(guān)系的相互作用信息，利用表型效應(yīng)、文本挖掘和化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性等信息進(jìn)行預(yù)測(cè)。在Swiss Target Prediction和STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)中，預(yù)測(cè)的化合物和基因之間相互作用歸因于“綜合閾值得分”，分?jǐn)?shù)越高表明相互作用越強(qiáng)，中藥、成分、預(yù)測(cè)靶標(biāo)和綜合閾值得分如表2所示。刪除重復(fù)之后，共有120個(gè)基因與16個(gè)已鑒定化合物之間的綜合閾值得分≥0.4。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果構(gòu)建化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)，包括139個(gè)節(jié)點(diǎn)和178條邊。

表2 化合物靶標(biāo)預(yù)測(cè)比較

表3 潛在性靶標(biāo)通路分析結(jié)果

注：藍(lán)色四邊形代表成分，紅色橢圓形代表靶標(biāo)圖2 成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 潛在靶基因的選擇與分析

以“慢性心力衰竭”為關(guān)鍵詞搜索疾病相關(guān)靶標(biāo)，共得到8215個(gè)靶標(biāo)結(jié)果。利用Cytoscape 3.2.1的merged功能選出成分靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)的交集作為潛在靶標(biāo)。以潛在靶標(biāo)為核心，構(gòu)建成分-潛在性靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，此網(wǎng)絡(luò)圖由15個(gè)化合物和101個(gè)靶基因組成。圖中山柰酚和53個(gè)靶標(biāo)相連接，具有最高的度值。羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51A1)、雄激素受體(AR)、芳香化酶(CYP19A1)與5個(gè)以上成分相連，這些成分和靶標(biāo)可能是網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

注：藍(lán)色四邊形代表成分，紅色橢圓形代表靶標(biāo)圖3 成分-潛在性靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)101個(gè)潛在性靶標(biāo)進(jìn)行分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出靶標(biāo)97個(gè)，在Cytoscape 3.2.1進(jìn)行可視化處理(圖4)。前列腺G/H 合成酶2 (PTGS2)、 表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、雌激素受體(ESR1)、一氧化氮合酶(NOS3)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP9)，芳烴受體(AHR)、雄激素受體(AR)和芳香化酶(CYP19A1)擁有較高的度值。在PPI分析結(jié)果中，節(jié)點(diǎn)的平均度值為9.29，PPI enrichment p-value< 0.01，提示分析結(jié)果可靠性高[18]。

注：紅色圓形代表潛在性靶標(biāo)，度值和大小成正比圖4 潛在性靶標(biāo)相互作用關(guān)系 (PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

為探究潛在性靶標(biāo)功能，利用STRING和 DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在性基因進(jìn)行功能富集分析(表3)，并建立中藥-成分-靶標(biāo)-疾病-通路的網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)，得到PI3K-Akt信號(hào)通路、胰島素抵抗通路、PPAR 信號(hào)通路、雌激素受體信號(hào)傳導(dǎo)等通路。目標(biāo)基因主要涉及一氧化氮合酶(NOS3)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、糖原合成酶激酶(GSK3B)和前列腺G/H 合成酶2 (PTGS2)等。

注：六邊形代表中藥，四邊形代表成分，橢圓形代表靶標(biāo)，三角形代表疾病，“V”形代表通路圖5 中藥-成分-潛在性靶標(biāo)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 系統(tǒng)分子對(duì)接

基于上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，我們對(duì)11個(gè)靶標(biāo)(AHR、AR、PTGS2、CYP19A1、CYP51A1、EGFR、ESR1、GSK3B、MMP9、NOS3、PPARG)和山奈酚進(jìn)行分子對(duì)接(圖6)。一般認(rèn)為，分值大于4.25表示分子與靶標(biāo)之間有一定的結(jié)合活性, 大于5.0表明有較好的結(jié)合活性, 大于7.0則說(shuō)明結(jié)合活性很強(qiáng)[25]。這些結(jié)果表明，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的靶標(biāo)均具有較好活性。

圖6 分子對(duì)接得分

3 討論

本文探討了真武湯通過(guò)15個(gè)成分和97個(gè)潛在性靶基因發(fā)揮治療慢性心力衰竭的作用。通過(guò)對(duì)潛在靶基因的功能富集分析得到可能作用的具體通路和主要涉及的目的基因NOS3、GSK3B、PTGS2等(圖7)。

圖7 真武湯中主要作用成分及靶標(biāo)

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析，山柰酚在真武湯中的度值比較高，發(fā)揮的作用比較大。山奈酚是植物中提取的黃酮類(lèi)化合物， 它可以從葡萄柚、花椰菜、蜂膠、金縷梅等植物中獲得[26]。研究顯示，含山奈酚的植物具有抗炎、抗氧化、抗血脂和抗癌的作用[27]。在研究山奈酚對(duì)異丙腎上腺素所致大鼠心肌損傷的影響中，通過(guò)對(duì)血流動(dòng)力學(xué)、心肌梗死面積、心肌損傷標(biāo)志物、脂質(zhì)分布、氧化應(yīng)激、促炎細(xì)胞因子和心、肝組織病理學(xué)等方面進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果山奈酚預(yù)處理的大鼠在心肌梗死面積和心率上均得到降低，同時(shí)血清LDH、CK-MB、肌鈣蛋白和血脂水平也得到明顯改善[28]。在慢性心力衰竭合并糖尿病的條件下，山奈酚可通過(guò)降低血糖、血清心臟標(biāo)志物、氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用[29]。因此，山奈酚可作為治療慢性心力衰竭方面的潛在藥物。

在PPI網(wǎng)絡(luò)圖的主要靶基因中，前列腺素G/H合成酶2 (PTGS2/COX-2) 的度值最大，提示其在慢性心衰治療中發(fā)揮著重要作用。長(zhǎng)期使用COX-2選擇性抑制劑會(huì)增加患者心血管事件(心力衰竭、高血壓和心肌梗塞等)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[30]，所以COX-2在人類(lèi)心臟病中的發(fā)展引起越來(lái)越多的關(guān)注。臨床試驗(yàn)證明，昔布類(lèi)藥物能夠抑制COX-2，降低炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，但同時(shí)也降低抗血栓前列腺素類(lèi)的生成，使心血管事件發(fā)生率增加[31]。此外，心肌細(xì)胞特異性COX-2轉(zhuǎn)基因模型對(duì)缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用[32]。研究表明，在異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心衰病程中加以中藥的應(yīng)用，可以通過(guò)調(diào)節(jié)COX-2發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用[33]。

KEGG通路分析表明，PI3K-Akt信號(hào)通路具有最高的度值，可能是治療機(jī)制中的重要通路。在生理刺激下，Akt的活化促進(jìn)細(xì)胞的肥大[34]。據(jù)報(bào)道，PI3K/Akt活化可刺激MAPKs的磷酸化，在各種應(yīng)激下誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的各種基因轉(zhuǎn)錄，如誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的炎癥[35]。因此，PI3K/Akt是心臟肥大過(guò)程中的一個(gè)重要信號(hào)通路[36]。由于生理性肥大引起的短期AKT活化可能對(duì)心臟具有保護(hù)作用，但長(zhǎng)期會(huì)造成病理性心臟肥大和心肌鈣化，最終導(dǎo)致心力衰竭[37]。所以，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路可能對(duì)緩解心臟肥大進(jìn)展和壓力超負(fù)荷引起的功能改變起到關(guān)鍵作用, 對(duì)慢性心力衰竭的防治具有重要意義[38]。

在通路分析中，除了PI3K-Akt信號(hào)通路之外，PPAR 信號(hào)通路也具有較高的度值，發(fā)揮著治療慢性心力衰竭的重要作用。作為核激素受體超家族中的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)由PPARα、PPARγ 和PPARβ/δ 組成[39]。PPAR 根據(jù)其組織分布不同而具有不同的生理功能[40]。其3種亞型都在心肌細(xì)胞中表達(dá)，并且與脂質(zhì)代謝和能量平衡的調(diào)節(jié)以及心臟方面密切相關(guān)[41]。然而，PPARα/γ 激動(dòng)劑有較多不良反應(yīng)而未能應(yīng)用于臨床[42]。在自發(fā)性高血壓大鼠模型的研究中，中醫(yī)藥能夠改善線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷，恢復(fù)PPARα和PPARγ 表達(dá)水平，發(fā)揮對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟重塑和功能障礙的保護(hù)作用[43]?？梢?jiàn)，PPAR是中醫(yī)藥治療慢性心力衰竭的潛在治療靶標(biāo)，在藥物開(kāi)發(fā)中應(yīng)該充分發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)出更安全、更有效的PPAR激動(dòng)劑。

多項(xiàng)研究表明，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究可以闡明中藥“多成分-多靶標(biāo)”的作用特點(diǎn)。本研究經(jīng)過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，真武湯主要通過(guò)活性化合物(山奈酚)的靶標(biāo)(PTGS2等)調(diào)節(jié)機(jī)制和PI3K-Akt、PPAR 等信號(hào)通路，發(fā)揮治療慢性心力衰竭的作用，不僅為本課題的研究提供了新的方向，也為其他方劑的研究提供參考。