基于“病證結合”構建與評價一種新的抑郁癥肝郁脾虛證小鼠模型?

童 萍，李玉芳，李睿博，劉 晶，卜 平△，孔桂美

(1. 揚州大學臨床醫(yī)學院，江蘇 揚州 225001； 2. 揚州大學醫(yī)學院，江蘇 揚州 225001； 3. 大連醫(yī)科大學，遼寧 大連 116044)

抑郁癥(major depressive disorder，MDD)因其較高的發(fā)病率、致殘率、自殺率和較低的治愈率，影響著全球3億多人的健康[1-2]。抑郁癥是一種高度異質性的疾病，由于缺乏確切的現(xiàn)象學標準和神經生物學基礎[3]，使診療過程復雜，或常因缺乏個體差異性導致治療效果不佳[4-5]。中醫(yī)學在診療過程中強調“辨證論治”，同樣的疾病可表現(xiàn)不同的證型。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，抑郁癥肝郁脾虛證最為常見[6]。然而至今，基于“病證結合”的抑郁癥肝郁脾虛證動物模型的建立及外周血液特征性指標的探索，國內外鮮有報道。本研究采用西醫(yī)病因病理復制疾病的動物模型，聯(lián)合中醫(yī)病因病機復制證候的模型，建立抑郁癥肝郁脾虛證小鼠模型，并初步研究血漿GABA代謝的變化，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物

ICR成年雄性小鼠30只，購自揚州大學比較醫(yī)學中心，體質量25～29 g，動物生產許可證號SCXK(蘇)2017-0007。于揚州大學中西醫(yī)結合系實驗動物房適應性飼養(yǎng)1周(適應過程中死亡1只)。動物房環(huán)境溫度20～26 ℃，濕度40%～60%。1周后完成體質量、曠場實驗、蔗糖偏好實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗以及糞便性狀的基線水平測量，隨后將小鼠分為對照組14只和實驗組15只。為避免造模過程中小鼠之間的相互嚙咬，每籠只飼養(yǎng)1只小鼠。本實驗已通過揚州大學實驗動物倫理委員會審查(SYXK(蘇)2017-0044)。

1.2 藥物

10%水合氯醛、1%(w/v)的蔗糖溶液、生大黃粉。

1.3 試劑及儀器

小鼠γ氨基丁酸(GABA)、谷氨酸脫羧酶65(GAD65)和谷氨酸脫羧酶67(GAD67)抗體檢測試劑盒(購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，Rayto RT-6100酶標儀、電子計數(shù)稱、秒表、計時器、懸掛支架，動物行為視頻分析系統(tǒng)，1 ml注射器，9號灌胃針頭。

1.4 造模方法

CUMS(Chronic unpredictable mild stress)[7-8]是經典的構建抑郁癥動物模型的方法，是指以持續(xù)溫和不可預知的刺激誘導動物出現(xiàn)和抑郁癥患者類似的行為表現(xiàn)；大黃灌胃[9-11]法是以大黃模擬苦寒敗胃、肝郁日久、木郁乘土、肝郁脾虛的病理演變過程來構建肝郁脾虛證方法。利用病證結合的原則，復合運用CUMS和大黃灌胃進行造模。

相關研究表明，影響數(shù)控機床熱變形誤差的主要原因是主軸部件熱變形誤差，由于實驗條件有限，并且這篇論文主要是驗證LWT-LSSVM建模預測方法的可行性與準確性，所以只對數(shù)控機床部分發(fā)熱部件進行實驗分析和研究。

1.4.1 抑郁癥的造模方法 參照CUMS模型，對實驗組施行斷水斷食24 h，夾尾1 min，10 ℃冰水游泳5 min，水平搖晃1次/s，持續(xù) 5 min，燈光刺激24 h，濕墊料24 h，傾斜鼠籠45°，持續(xù)24 h。每天隨機選擇1 種刺激，每種刺激平均使用4次，連續(xù)刺激28 d。

1.4.2 肝郁脾虛證的造模方法 于實驗組行CUMS造模第15天開始，同時對實驗組給予15%大黃粉懸液0.5 ml灌胃(分3次，早0.2 ml，中0.15 ml，晚0.15 ml)，連續(xù) 14 d，于CUMS造模28 d結束。

1.5 觀察指標及方法

造模前和造模后完成2組小鼠的體質量測量、行為實驗和糞便收集，造模結束后采集小鼠血漿。為避免順序對觀察指標的影響，實驗組與對照組交叉進行。

1.5.1 抑郁癥的觀察 曠場實驗(open field test,OFT)、蔗糖偏好實驗(sucrosepreference test,SPT)、懸尾實驗(tail suspension test,TST)和強迫游泳實驗(forced swimming test,FWT)是常用的評價實驗動物抑郁癥模型的指標。本實驗以曠場實驗中的活躍度和平均速度、蔗糖偏好指數(shù)(蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+純水消耗量)×100%)、懸尾和強迫游泳不動時間來評估模型小鼠的抑郁程度。

表1 Bristol糞便量表

1.5.3 血漿GABA濃度的檢測 造模結束后，以ELISA法測定小鼠血漿GABA、GAD65和GAD67濃度。10%水合氯醛腹腔注射(0.04 ml/10 g)，小鼠麻醉后摘眼球取血3 ml，置于EDTA抗凝管中混合15 min后離心20 min(3000 r/min)，收集上清分裝于1.5 ml離心管，-80℃冰箱凍存待檢,檢測過程按試劑盒步驟進行。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 造模對小鼠行為的影響

2.1.1 造模前后2組小鼠行為指標差異 表2示，對造模前后2組小鼠的曠場實驗、蔗糖偏好實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗結果分別進行獨立樣本t檢驗和配對樣本t檢驗。

結果顯示，造模使小鼠的平均速度和活躍度降低(P<0.01)，小鼠活動受限，蔗糖偏好指數(shù)下降(P<0.01)，快感缺失，懸尾實驗中不動時間延長(P<0.05)，強迫游泳時放棄掙扎時間延長(P<0.01)，呈現(xiàn)絕望樣抑郁狀態(tài)。

2.1.2 實驗組小鼠行為指標相關性分析 表3示，對實驗組小鼠的行為指標進行Pearson相關分析，反應活躍程度的指標如平均速度、活躍度，與反應快感的指標如蔗糖偏好指數(shù)之間呈顯著正相關(P<0.01)；反應絕望程度的指標如強迫游泳不動時間、懸尾不動時間之間呈顯著正相關(P<0.05)；反應活躍程度的指標與反映絕望程度的指標之間呈顯著負相關(P<0.01)。結果顯示，造模致實驗組小鼠的抑郁樣行為相關性高，結果穩(wěn)定一致。

表3 實驗小鼠各行為指標的相關性比較

2.2 造模對小鼠體質量和糞便的影響

表4示，對2組小鼠體質量和糞便BSFS得分分別進行獨立樣本t檢驗和配對樣本t檢驗。造模降低小鼠體質量增加的幅度(P<0.05)，使小鼠糞便含水量增加(P<0.01)，出現(xiàn)大便溏薄及類似肝郁脾虛證的表現(xiàn)。

表4 2組小鼠造模前后體質量和糞便性狀比較

2.3 造模對小鼠血漿GABA代謝的影響 表5示，對2組小鼠造模后血漿GABA、GAD65和GAD67濃度進行獨立樣本t檢驗。結果顯示， 造模致小鼠血漿GABA、GAD65和GAD67濃度顯著下降(P<0.01)。

表5 2組小鼠造模后血漿GABA、GAD65及GAD67比較

3 討論

抑郁癥的癥狀異質性大，其差異性直接影響治療的結局[4]。診療的個體化及獨特癥狀的識別與預后有關[14-15]。中醫(yī)的“辨證論治”和“整體觀”強調診治的個體差異，是通過綜合體征、癥狀與脈象、舌象等多方面信息進行辨別診治的過程。不同證型的疾病，需要根據(jù)個體差異進行有針對性的治療[16]。

動物模型是研究抑郁癥發(fā)病機制的重要手段[17]。目前，有關抑郁癥不同中醫(yī)證型的動物模型大都借用抑郁癥造模方法，往往通過觀察總結中醫(yī)證型[18]或根據(jù)中藥治療效果反推可能的證型[19]，但存在滯后性和缺乏特異性，影響研究結果的臨床轉化[20]。

血液特征性指標異常的發(fā)現(xiàn)對于快速診斷疾病意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，GABA能系統(tǒng)地與抑郁癥的發(fā)病高度相關[21-23]，且可通過調整GABA及其受體功能調整肝脾的消化功能[24-25]。GABA在體內是由興奮性氨基酸谷氨酸(Glu)經谷氨酸脫羧酶(GAD)脫羧而來，GAD 包含2種同工酶GAD65和 GAD67[26]。研究發(fā)現(xiàn)，GABA能系統(tǒng)功能與肝郁脾虛證密切相關[27-28]。

基于此，本研究運用“病證結合”理論原則，在CUMS的基礎上聯(lián)合大黃灌胃，構建抑郁癥肝郁脾虛證的小鼠模型。模型小鼠表現(xiàn)活動速度減慢、活躍度下降、蔗糖偏好指數(shù)降低、懸尾不動時間和強迫游泳不動時間延長等典型的抑郁癥狀；同時，模型小鼠出現(xiàn)納差、體質量增長緩慢、大便稀溏的肝郁脾虛癥狀，說明模型小鼠具備抑郁癥肝郁脾虛證的癥狀學表現(xiàn)[29-30]。本研究以血漿GABA、GAD65和GAD67濃度為指標，探索抑郁癥肝郁脾虛證小鼠的外周GABA代謝情況，以期為抑郁癥肝郁脾虛證尋找特征性病理指標，結果提示“病證結合”造模方式削弱了模型小鼠GABA的代謝。

“病證結合”動物模型在中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中具有明顯優(yōu)勢[31]。該模型可克服西醫(yī)辨病與中醫(yī)辨證局限，使診療過程更加具有個體差異，使臨床醫(yī)療行為更加精準[32]。本研究結果顯示，“病證結合”構建的抑郁癥肝郁脾虛證小鼠具備成功模擬抑郁癥病與肝郁脾虛證的臨床表型，符合其精神緊張、憂郁惱怒, 致肝氣郁結、肝失疏泄、橫逆犯脾，或思慮傷脾、土虛木乘、脾失健運、氣機升降失常[36]的病機，可作為抑郁癥肝郁脾虛證的病機、治療的進一步研究，血漿GABA代謝指標可作為佐證指標。當然，樣本量和小鼠性別的選擇是本研究的不足之處，新模型仍需擴大樣本量，挖掘并驗證更多客觀指標。本課題組將會繼續(xù)探究其機制與穩(wěn)定性，促進中醫(yī)證候模型的深入研究，不斷挖掘病證結合動物模型在中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中的價值和應用。