非小細(xì)胞肺癌患者血漿外泌體APE1的表達(dá)與鉑類化療敏感性相關(guān)

趙曉龍，代曉燕，毛成毅，肖華亮，王 東，戴 楠*

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院 1.腫瘤科； 2.病理科，重慶 400042)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%～85%[1]。在中國，由于早期肺癌臨床癥狀不明顯，肺癌篩查未全面普及，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已為中晚期[2]。含鉑化療是無驅(qū)動基因突變的NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療，然而有相當(dāng)一部分患者對鉑類治療不敏感，出現(xiàn)耐藥后迅速進展，這嚴(yán)重影響患者的療效和生存[3]。

脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(apurinic aprimidinic endonuclease 1, APE1)與非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，APE1 蛋白及自身抗體存在于NSCLC 患者外周血中，NSCLC 患者血清 APE1蛋白和抗體水平明顯高于健康體檢者[5]。問題是缺乏分泌信號肽的典型核蛋白APE1是通過什么方式進入血液的呢？外泌體是直徑在30～150 nm的小囊泡，能夠包裹核酸、蛋白和脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)[6]。據(jù)此推測，APE1可能存在于外泌體中，并通過外泌體分泌到血液中。為驗證這種假設(shè)，本研究提取了無驅(qū)動基因突變的晚期NSCLC患者血漿外泌體，首次發(fā)現(xiàn)APE1存在于血漿外泌體中。對NSCLC患者鉑類化療前后的血漿外泌體APE1進行動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體APE1與鉑類化療敏感性密切相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究人群：選取2017年1月至2018年1月保存于大坪醫(yī)院臨床生物樣本庫的晚期NSCLC患者72例，48例體檢的正常人作為對照，用于研究NSCLC患者與正常人血漿外泌體APE1水平的比較；其中31例有對應(yīng)的穿刺組織標(biāo)本，用于檢測組織APE1水平與血漿外泌體APE1水平的關(guān)系。收集2018年1月至2019年6月就診大坪醫(yī)院腫瘤科的晚期NSCLC患者64例，用于研究外泌體APE1與鉑類治療敏感性的關(guān)系；其中24例有化療前后血漿樣本，用于研究化療前后APE1水平變化。根據(jù)RECIST 1.1版評價標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為化療應(yīng)答組(CR+PR，n=22)和無應(yīng)答組(SD+PD，n=42)。所有患者均明確診斷為ⅢB或Ⅳ期無驅(qū)動基因突變的NSCLC，并接受含鉑雙藥一線化療，未聯(lián)合抗血管生成治療。本研究經(jīng)大坪醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)(倫理審批編號：2018-113)，所有患者均簽署知情同意書(表1)。

表1 研究對象基本資料

1.1.2 試劑： Total Exosome Isolation Kit(Invitrogen公司)；RIPA裂解液(碧云天公司)；抗APE1抗體(Novus Biological公司)，抗CD9、CD63、β-tubulin 抗體(Abcam公司)，人APEX1酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體的分離和鑒定：采用EDTA采血管收集靜脈血5.0 mL，靜置30 min，2 000 r/min離心10 min，取上層血漿，10 000×g離心20 min，取上清后采用血漿外泌體提取試劑盒，按說明書步驟提取血漿外泌體。

1.2.2 電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察外泌體及納米示蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)：取外泌體樣本 5 μL 滴加在銅網(wǎng)上，室溫孵育 5 min，滴加2%的乙酸雙氧鈾，室溫干燥20 min，采用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。取10 μL外泌體樣本進行相應(yīng)比例稀釋，利用納米粒度顆粒跟蹤分析儀進行納米示蹤分析。

1.2.3 Western blot檢測蛋白：配制SDS-PAGE膠，取10 μL外泌體蛋白進行電泳，100 V恒壓條件下轉(zhuǎn)膜90 min，在5%的脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，加入一抗稀釋液(APE1 1∶1 000，CD9 1∶1 000，CD63 1∶1 000，β-tubulin 1∶2 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后加入相應(yīng)種屬二抗(1∶5 000), 37 ℃ 孵育1 h，TBST洗滌，采用化學(xué)發(fā)光顯影系統(tǒng)顯影。

1.2.4 ELISA檢測APE1蛋白：提取200 μL血漿中的外泌體，根據(jù)實驗需要，將外泌體加入含或不含1% Triton X-100 的PBS溶液中充分混勻后，采用人脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(APEX1)酶聯(lián)免疫試劑盒，按說明書操作，對外泌體APE1進行定量檢測。

1.2.5 免疫組化(IHC)檢測APE1蛋白：取石蠟標(biāo)本進行切片、脫蠟和水化后置于含pH 9.0 EDTA溶液高壓鍋中加熱修復(fù)。流水沖洗后，用30% H2O2-methanol溶液浸泡封閉10 min。PBS沖洗3次后滴加APE1一抗，置于濕盒中，4 ℃過夜。PBS清洗3次，擦干后滴加二抗，37 ℃孵育25 min后，PBS清洗3次，滴加DAB顯色，沖洗后用蘇木精復(fù)染，脫水封片、評分并拍照。評分方法：根據(jù)細(xì)胞染色深淺及陽性細(xì)胞比例將APE1表達(dá)水平分為0,1,2,3，共4個等級，將評分0,1定義為低表達(dá)，評分2,3定義為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體的提取與鑒定

血漿外泌體呈現(xiàn)橢圓形的雙層膜結(jié)構(gòu)，外泌體的粒徑大小整體合乎標(biāo)準(zhǔn)(30～150 nm) (圖1A,B)。 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)有外泌體特異性標(biāo)志物CD63和CD9的存在 (圖1C)。

2.2 外泌體中的APE1是外周血中APE1存在的主要方式

血漿外泌體中存在APE1蛋白(圖2A)。ELISA檢測結(jié)果顯示，NSCLC患者外泌體中的APE1水平明顯高于未用Triton X-100處理過的樣本(P<0.0001)(圖2B)，提示APE1主要被包裹于外泌體的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)內(nèi)。

2.3 非小細(xì)胞肺癌患者外泌體APE1高表達(dá)

ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者外泌體APE1水平為(658±251)pg/mL，明顯高于正常人的(182±96)pg/mL(P<0.0001)(圖3)。

A.TEM(80 kV)；B.NTA；C.Western blot圖1 NSCLC患者血漿外泌體的鑒定Fig 1 Identification of plasma exosomes in NSCLC patients

A.Western blot；B.APE1 level in exosomes；*P<0.000 1 compared with PBS group圖2 血漿外泌體APE1的表達(dá)情況Fig 2 Expression of APE1 in

2.4 非小細(xì)胞肺癌組織APE1水平與血漿外泌體APE1水平成正比

腫瘤組織免疫組化染色情況圖4A，評分為0或1分(低表達(dá))患者為15例，評分2或3分(高表達(dá))為16例。組織高表達(dá)APE1的患者，其血漿外泌體APE1水平較組織APE1低表達(dá)患者明顯升高(P<0.01)(圖4B)。

*P< 0.0001 compared with the control group圖3 NSCLC患者與正常人血漿外泌體APE1的表達(dá)Fig 3 Expression of APE1 in NSCLC

2.5 外泌體APE1水平與鉑類治療敏感性相關(guān)

與化療應(yīng)答組相比，無應(yīng)答組的外泌體APE1水平明顯升高 (P<0.001)(圖5A)。對比化療前后APE1水平的改變，無應(yīng)答組的外泌體APE1在化療后明顯增高(P<0.01)(圖5B)，而應(yīng)答組APE1則無明顯變化(圖5C)。

3 討論

鉑類一直是晚期無驅(qū)動基因突變NSCLC患者的基礎(chǔ)治療藥物。然而有研究表明，以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案有效率僅為30%～40%[7]，耐藥嚴(yán)重制約了鉑類在NSCLC中的應(yīng)用。鉑類主要通過與DNA結(jié)合形成加合物[8]來對腫瘤細(xì)胞造成殺傷。研究發(fā)現(xiàn)APE1在 DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]，APE1可能在一定程度上影響鉑類治療的療效，腫瘤組織高表達(dá)APE1的患者中有高達(dá)83.3%的患者對順鉑化療耐藥[10]。然而，目前大部分的研究僅局限于腫瘤組織，因此研究血液中的外泌體APE1，可以拓展其臨床應(yīng)用價值。

A.IHC；B.APE1 level in plasma exosomes；*P<0.01 compared with low t-APE1 group圖4 腫瘤組織低表達(dá)與高表達(dá)APE1患者的血漿外泌體APE1表達(dá)情況

A.exosome APE1 level of responding **P<0.001 compared with responding group; B.exosome APE1 level during chemotherapy in non-responding patients *P<0.01 compared with pre-chemotherapy level; C.exosome APE1 level during chemotherapy in responding

外泌體是直徑在30～150 nm脂質(zhì)膜囊泡，內(nèi)含核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)[6]。本研究通過免疫學(xué)方法發(fā)現(xiàn)APE1確實存在于血漿外泌體中。在檢測過程中，如使用非離子型去垢劑Triton處理外泌體，APE1的檢出濃度將迅速提高。究其原因，極有可能是由于外泌體脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致其中包裹的APE1更容易被檢出。實際上，血液樣本中APE1的檢出濃度很低[11]，因此檢測血漿外泌體APE1的表達(dá)水平，可以極大的提高檢測靈敏度，提高其在臨床上的應(yīng)用價值。

本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血漿外泌體APE1的表達(dá)與組織APE1表達(dá)水平成正比，這提示外泌體APE1也可作為判斷NSCLC療效的指標(biāo)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，鉑類化療療效不佳的患者中，外泌體APE1的表達(dá)明顯升高；同時，化療后外泌體APE1升高的患者，其療效比外泌體APE1無明顯變化(甚至降低)的患者更差。其機制可能為該部分患者，除自身腫瘤組織APE1表達(dá)增高外，APE1還會以外泌體的形式釋放，并通過外泌體來傳遞耐藥性。這也說明血漿外泌體APE1同樣能作為鉑類化療療效的指標(biāo)，且更有意義：血液檢測屬無創(chuàng)操作，可用于動態(tài)監(jiān)測評估療效和調(diào)整用藥方案，更好的服務(wù)于臨床實際。

綜上所述，APE1在NSCLC患者血漿外泌體中高表達(dá)，其表達(dá)高低與患者鉑類治療療效有關(guān)。然而，為了更加全面的對NSCLC外泌體APE1進行研究，未來還需要對APE1進入外泌體中的機制以及非癌性肺部病變患者血漿的外泌體APE1表達(dá)情況進行探索；此外，由于APE1是具有DNA損傷修復(fù)功能和氧化還原調(diào)控功能的雙功能基因，可通過多種途徑導(dǎo)致化療耐藥[12]，因此外泌體APE1導(dǎo)致鉑類耐藥的機制也有待一步研究。