多囊卵巢綜合征不孕患者血清miR-34a和Sirt1 表達(dá)水平及意義

張曉曉 邱麗雅 顧榮華 陳衛(wèi)青

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一種由內(nèi)分泌及代謝異常引起的常見婦科疾病，是引起不孕癥的最常見原因，在育齡期婦女中發(fā)病率高達(dá)5%～10%[1]。不孕癥指一年以上未采取避孕措施但未成功妊娠或生育。不孕癥易給患者造成重大心理及精神壓力，導(dǎo)致患者抑郁、焦慮，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2]。研究表明，慢性炎癥是PCOS 發(fā)病機(jī)制之一[3]。微小核糖核酸-34a（microRNA-34a，miR-34a）被證實(shí)在肺腺癌、肺鱗癌組織及慢性炎癥性內(nèi)臟疼痛大鼠脊髓組織差異表達(dá)，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠心肌組織中沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，Sirt1）表達(dá)水平下調(diào)，與心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)展中炎癥反應(yīng)增加有關(guān)[5]，而激活糖尿病腎病小鼠腎皮質(zhì)中Sirt1 表達(dá)可減緩腎炎癥、改善腎損傷[6]。由于miR-34a 與Sirt1 在肝星狀細(xì)胞活化和肝纖維化進(jìn)展中可能存在調(diào)控機(jī)制，而二者在PCOS 發(fā)生時相互作用鮮有報道[7]。本研究通過檢測PCOS 不孕患者血清miR-34a、Sirt1 表達(dá)水平，探討其與PCOS 不孕發(fā)生的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2018 年4 月—2020 年2 月浙江省臺州市婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的PCOS 不孕患者79 例作為觀察組，年齡25～36（31.86±4.22）歲。另選取同期在本院進(jìn)行孕前體檢的健康婦女79 名作為對照組，年齡24～35（31.25±3.97）歲。所有入組患者對本研究知情并簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過（批件號：倫審20180302）。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)《多囊卵巢綜合征中國診療指南》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診為PCOS；（2）3 個月內(nèi)未服用避孕、激素類藥物；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并患有其他婦科類疾病，及因其他原因?qū)е滦奂に卦龆嗷颊?；?）合并患有免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病、心血管類疾病者；（3）心腎肝等臟器功能嚴(yán)重不足者。

1.3 主要儀器和試劑 實(shí)時熒光定量PCR（quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）儀（型號：7500 Fast，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、qRT-PCR 試劑盒（批號RR410a，大連寶生物技術(shù)有限公司）、RNA 提取試劑盒（批號JL1256，蘇州凱杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究有限公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號K1622，中國賽默飛世爾科技有限公司）、酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號KA3674，臺灣亞諾法公司）。

2 方 法

2.1 樣本采集與一般資料收集 所有受試者于入組后第2 天清晨（7:00～9:00）空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周靜脈血5mL，離心后分離上清液，保存于-80℃超低溫冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收集所有受試者入組時年齡、體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）、糖尿病家族史、月經(jīng)紊亂情況、收縮壓、舒張壓、空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）等一般資料。

2.2 血清miR-34a 檢測 采用qRT-PCR 法檢測血清miR-34a 表達(dá)水平。采用RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別提取和合成cDNA 后，用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。20μL 反應(yīng)體系如下Primix Ex TaqTM10μL，ROX 0.4μL，cDNA 2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，無酶水3.6μL。反應(yīng)步驟如下：95℃，5min，以上一個循環(huán)；95℃，18s；63℃，36s；72℃，17s，以上40 個循環(huán)；一個樣品3 次重復(fù)。采用2-ΔΔCT法計算miR-34a 表達(dá)水平。以U6 為內(nèi)參基因。miR-34a 上游引物為5'-TGGCGAGTCTGAGCTGGTGT-3'，miR-34a 下游引物為5'-GAACGTCCACGCTACGATTT-3'；U6 上游引物為5'-CTCGCATTGAGCCTATAACA-3'，U6 下游引物為5'-ACGGATGCCGTACGATTACA-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.3 血清Sirt1 表達(dá)水平檢測 采用ELISA 法檢測血清Sirt1 表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；計數(shù)資料用[例（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Logistic 回歸模型進(jìn)行危險因素分析，采用ROC 曲線進(jìn)行各因子診斷價值分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PCOS 患者與健康對照組一般資料比較 觀察組與對照組年齡、收縮壓、舒張壓水平及糖尿病家族史患者比例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；觀察組BMI、FPG、空腹胰島素、HOMA-IR 水平及月經(jīng)紊亂比例明顯高于對照組（P＜0.05）。見表1。

3.2 PCOS 患者與健康對照組血清miR-34a、Sirt1表達(dá)水平比較 U6 為qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)時的內(nèi)參基因，觀察組血清miR-34a 表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.05），Sirt1 表達(dá)水平明顯低于對照組（P＜0.05）。見表2。

表1 PCOS 不孕患者與健康受試者一般資料比較

表2 PCOS 不孕患者與健康對照者血清miR-34a、Sirt1表達(dá)水平比較（）

表2 PCOS 不孕患者與健康對照者血清miR-34a、Sirt1表達(dá)水平比較（）

注：觀察組為PCOS 不孕患者；對照組為健康女性；miR-34a 為微小核糖核酸-34a；Sirt1 為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；PCOS 為多囊卵巢綜合征

3.3 PCOS 不孕患者血清 miR-34a 與Sirt1 表達(dá)水平相關(guān)性 PCOS 不孕患者血清miR-34a 與Sirt1 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.505，P=0.000）。見圖1。

圖1 PCOS 不孕患者血清miR-34a 與Sirt1 表達(dá)水平相關(guān)性注：PCOS 為多囊卵巢綜合征；miR-34a 為微小核糖核酸-34a；sirt1 為沉默信息調(diào)節(jié)因子1

3.4 影響PCOS 不孕發(fā)生危險因素分析 以本研究資料為樣本，以PCOS 不孕是否發(fā)生為因變量建立非條件Logistic 回歸模型，賦值1=PCOS 不孕發(fā)生，0=PCOS 不孕未發(fā)生。將表1-2 中P＜0.05 的指標(biāo)/因素為自變量納入Logistic 回歸模型，將BMI、FPG、空腹胰島素、HOMA-IR、miR-34a、Sirt1 水平以各自均值為界轉(zhuǎn)化為二分類變量。采用逐步向前法，行LR檢驗(yàn)。Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，高FPG、高空腹胰島素、高HOMA-IR、高miR-34a、低Sirt1 水平為影響PCOS 不孕發(fā)生的獨(dú)立危險因素（P＜0.05）。見表3。

3.5 血清miR-34a 與Sirt1 水平對PCOS 不孕診斷效能 血清miR-34a 水平預(yù)測PCOS 不孕診斷的曲線下面積為0.842，最佳截斷值為1.53，敏感度為78.50%，特異度為84.80%。血清Sirt1 水平預(yù)測PCOS 不孕診斷的曲線下面積為0.801，最佳截斷值為9.12，敏感度為81.00%，特異度為72.20%。二者聯(lián)合預(yù)測PCOS 不孕診斷的曲線下面積為0.880，敏感度為87.30%，特異度為86.10%。見圖2。

表3 影響PCOS 不孕發(fā)生危險因素分析

圖2 血清miR-34a 與Sirt1 表達(dá)水平對PCOS 不孕診斷效能注：PCOS 為多囊卵巢綜合征；miR-34a 為微小核糖核酸-34a；sirt1 為沉默信息調(diào)節(jié)因子1

4 討論

微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）是一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA[9]。白愛紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS 患者血清miR-21 表達(dá)水平明顯升高，可能作為PCOS 診斷標(biāo)志物。Wang 等[11]研究報道，miR-27a-3p 在PCOS 患者卵巢樣本中表達(dá)顯著升高，與卵巢顆粒細(xì)胞增殖和患者胰島素功能有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，觀察組miR-34a 表達(dá)水平明顯高于對照組，提示PCOS 不孕患者血清miR-34a 表達(dá)水平升高可能與PCOS 發(fā)生有關(guān)。Guo 等[12]研究表明，子癇前期患者胎盤組織中miR-34a 表達(dá)水平明顯高于正常胎盤組織，可誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。提示miR-34a 可能通過影響患者卵巢顆粒細(xì)胞增殖、胰島素功能、血糖代謝、炎癥反應(yīng)等促進(jìn)PCOS 不孕癥發(fā)生。

Sirt1 是一種NAD+依賴蛋白去?；割悾哂懈叨缺Ｊ匦訹13]。Sirt1 與機(jī)體生理功能和代謝密切相關(guān)，具有修復(fù)DNA 損傷、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激等作用，能參與疾病進(jìn)展[14]。研究表明，男性不育患者精液Sirt1 表達(dá)顯著降低，與精子濃度、活性有關(guān)[15]。Ma 等[16]研究證實(shí)，Sirt1 信號與卵巢生理和病理有關(guān)，上調(diào)Sirt1 信號可增加卵泡、黃體，減少卵泡雌激素，降低卵巢功能不全發(fā)生率。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清Sirt1 表達(dá)水平明顯低于對照組，提示Sirt1 水平降低可能影響PCOS 不孕發(fā)生。Yousefi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，切除卵巢的糖尿病大鼠胰腺組織中Sirt1 表達(dá)增加可抑制胰腺炎癥反應(yīng)和組織損傷。本研究結(jié)果顯示，血清Sirt1 下調(diào)可能引起卵泡、黃體、性激素水平異常改變和炎癥反應(yīng)增加，影響卵巢功能，進(jìn)而誘導(dǎo)PCOS 不孕發(fā)生。

Jiao 等[18]研究報道，miR-34a 可通過調(diào)控Sirt1表達(dá)，誘導(dǎo)睪丸凋亡細(xì)胞死亡，導(dǎo)致糖尿病引起的男性不育發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，PCOS 不孕患者血清miR-34a 與Sirt1 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示血清miR-34a 與Sirt1 可能存在相互作用，共同影響PCOS 不孕發(fā)生發(fā)展，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究觀察組BMI、FPG、空腹胰島素、HOMA-IR 水平及月經(jīng)紊亂比例明顯高于對照組，與胡靜和張瓊[19]研究結(jié)果相似。高FPG、高空腹胰島素、高HOMA-IR、高miR-34a、低Sirt1 水平為影響PCOS 不孕發(fā)生的獨(dú)立危險因素，進(jìn)一步提示血清miR-34a、Sirt1 水平異常可能增加PCOS 不孕發(fā)生風(fēng)險。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清miR-34a、Sirt1 水平聯(lián)合預(yù)測PCOS 不孕診斷的曲線下面積為0.880，敏感度為87.30%，特異度為86.10%。提示二者聯(lián)合檢測對PCOS 不孕診斷價值較高，可能作為生物標(biāo)志物，為該疾病臨床診斷和治療提供一定理論依據(jù)。

綜上所述，PCOS 不孕患者血清miR-34a 表達(dá)水平明顯升高，Sirt1 表達(dá)水平明顯降低，二者可能相互作用，共同參與PCOS 不孕癥發(fā)生。但由于本研究僅從表達(dá)層面進(jìn)行分析，二者在PCOS 不孕癥中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。