草魚體表粘液凝集素制備及其性質(zhì)研究

劉帥　董毓卿　岳福鵬　張樹民　李偉

摘 要：以草魚體表粘液凝集素為研究對(duì)象，經(jīng)PBS提取粗提物后，通過離子交換層析DEAE-52對(duì)該凝集素進(jìn)行初步純化，得到一種具有凝集雞血細(xì)胞的凝集素。該凝集素在20～40℃及pH 7～8條件下表現(xiàn)出較好的凝集活性，且凝集活性不依賴Ca2+的存在。依據(jù)凝血活性糖抑制試驗(yàn)結(jié)果，推測草魚體表粘液凝集素可能為半乳糖結(jié)合凝集素。

關(guān)鍵詞：草魚;體表粘液;凝集素

中圖分類號(hào) Q26;Q959.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）03-0009-03

Study on Preparation and Characterization of Lectin from Surface Mucus of Ctenopharyngodon idellus

LIU Shuai1 et al.

（1School of Agriculture， Hetao College， Bayannur 015000， China）

Abstract： The lectin from surface mucus of Ctenopharyngodon idellus was extracted by PBS and purified by ion exchange chromatography with DEAE-52 to obtain a lectin with agglutinated chicken blood cells.The lectin exhibited good agglutination activity at 20～40℃ and pH 7～8， and the agglutination activity of the lectin was independent of the presence of Ca2+. Based on the results of coagulation active sugar inhibition test， it was speculated that the mucus lectin of Ctenopharyngodon idellus might be galactose-binding lectin.

Key words： Ctenopharyngodon idellus; Surface mucus; Lectin

魚類體表粘液是由其皮膚腺細(xì)胞分泌的，含有多糖、蛋白質(zhì)和纖維類等多種物質(zhì)。多項(xiàng)研究表明，魚類體表粘液具有免疫學(xué)功能，在魚類先天性免疫中發(fā)揮著非常重要的作用[1，2]。魚類的先天免疫因子包括溶菌酶、抗菌肽、模式識(shí)別受體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、凝集素及轉(zhuǎn)鐵蛋白等[3-5]。其中，凝集素因其特異性的識(shí)別功能，近年來已逐漸成為學(xué)者的重點(diǎn)研究對(duì)象。

草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國四大淡水魚之一，營養(yǎng)豐富，價(jià)格低廉，深受消費(fèi)者青睞。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大以及水體環(huán)境污染和集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，草魚的生存環(huán)境面臨多重威脅。筆者在研究魚類免疫機(jī)制過程中，發(fā)現(xiàn)對(duì)草魚凝集素的研究大多集中在草魚血清凝集素，而對(duì)于草魚體表粘液凝集素的研究尚未見報(bào)道。為此，筆者從草魚體表粘液中發(fā)現(xiàn)一種天然凝集素，并對(duì)其部分理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以進(jìn)一步明確草魚免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料 2～3齡草魚，購于巴彥淖爾市車站市場;雞血細(xì)胞購自河南一祺生物技術(shù)有限公司。供試試劑包括：Cellulose DE 52（英國Whatman公司產(chǎn)品）;D-葡萄糖、水蘇糖、D-海藻糖、D-山梨糖醇、D-蜜三糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-甘露糖（均為RuiBio公司產(chǎn)品）;豬胃黏蛋白（合肥博美生物科技有限公司）;其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 草魚體表粘液采集 取混有體表粘液草魚鱗片，按1∶3（w∶v）分別加入TBS（pH 7.2，0.01mol/L）、PBS（pH 7.2，0.01mol/L）、生理鹽水（0.09% NaCl）及蒸餾水中，浸泡過夜。4000r/min離心15min取上清液，測定凝血活力后，凍干得到草魚粘液粗提物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 草魚體表粘液凝集素凝血活力測定 取樣品溶液25μL于96孔U型凝血板中，依次進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋，稀釋液為PBS（pH 7.2，0.01mol/L）緩沖液，然后每孔再分別加入用TBS（pH7.2，0.01mol/L）緩沖液稀釋至2%雞血細(xì)胞，靜置2h觀察凝集現(xiàn)象。凝血活力以產(chǎn)生凝集現(xiàn)象最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示（以2n表示）[6]。

1.2.3 草魚體表粘液凝集素的制備 使用DEAE-52對(duì)草魚體表粘液凝集素進(jìn)行分離。將草魚粘液粗提物溶于0.01mol/L Tris-HCl，得到濃度為5mg/mL樣液，層析柱（預(yù)裝柱規(guī)格為φ16mm×300mm）上樣量為2mL，以1mL/min的速度通過自動(dòng)部分收集器對(duì)洗脫液進(jìn)行收集。采用梯度洗脫，前30管NaCl濃度為0mol/L，從第31～120管NaCl濃度為0～1mol/L，每管收集3mL，分別在280nm處測定各管吸光度值，繪制洗脫曲線，并收集具有凝血活性的組分。

1.2.4 糖抑制試驗(yàn) 分別配置濃度為0.05mg/mL的D-葡萄糖、水蘇糖、D-海藻糖、D-山梨糖醇、D-蜜三糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-甘露糖、豬胃黏蛋白溶液。參照1.2.2方法，再加入2%血細(xì)胞前，每孔加入25μL上述糖溶液，靜置2h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 pH對(duì)凝集活性的影響 將分離出草魚體表粘液凝集素凍干粉分別溶于pH 3～11的緩沖液中，測定凝血活性。其中：pH 3～5為磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液，pH 6～7為磷酸鹽緩沖液，pH 8為Tris-HCl緩沖液，pH 9～10為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH 11為氫氧化鈉溶液。

1.2.6 溫度及時(shí)間對(duì)凝集活性的影響 將分離出的草魚體表粘液凝集素置于30、40、50、60、70℃各1h，并分別在1h內(nèi)的第5、10、20、30、40、50、60min取樣，測定其凝血活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取液對(duì)草魚體表粘液凝集素提取的影響 由表1可知，生理鹽水（0.09% NaCl）和蒸餾水作為草魚體表粘液凝集素提取溶劑時(shí)，能夠溶出一定量的凝集素，但溶出量并不顯著;而PBS（pH 7.2，0.01mol/L）和TBS（pH 7.2，0.01mol/L）均能有效提高凝集素的溶出量，且PBS與其他3種提取溶劑相比，顯著提高了凝集素的溶出量，這與PBS常作為溶解蛋白質(zhì)類物質(zhì)的緩沖溶劑性質(zhì)相符。凝血活力測定實(shí)驗(yàn)中，分別采用PBS和TBS 2種緩沖液作為稀釋液，TBS緩沖液作為稀釋液時(shí)凝血活力為28，而PBS緩沖液作為稀釋液時(shí)凝血活力為26，說明TBS作為稀釋液能顯著提高凝集素的凝血活性。此外，使用胰蛋白酶處理過的血細(xì)胞與正常使用TBS處理的血細(xì)胞的凝血活力無明顯差異，并且該凝集素的凝集活性不依賴Ca2+存在，因此后續(xù)試驗(yàn)中使用的倍比稀釋液均為TBS緩沖液。

2.2 草魚體表粘液凝集素的分離 將凍干后的草魚體表粘液粗提物用PBS溶解后，過DEAE-52離子交換層析柱，測定自動(dòng)部分收集器收集各試管在280nm處的吸光度值所繪制洗脫曲線如圖1所示。由圖1可知，共得到3個(gè)吸收峰，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)第2個(gè)峰具有較好的凝血活性，其他部分凝血活性較低或無凝血活性。合并、透析、凍干具有凝血活性的蛋白峰，后期可通過體積排阻色譜及高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步純化。

2.3 糖和糖蛋白對(duì)草魚體表粘液凝集素活性的影響 能夠以非共價(jià)鍵與糖或糖蛋白特異性結(jié)合，無論是單糖、寡糖還是多糖都可能對(duì)凝集素的凝集活性產(chǎn)生抑制作用，因此研究凝集素的糖抑制性非常必要[7]。由表2可知，草魚體表粘液凝集素的凝血活性受到D-蜜三糖、D-半乳糖和豬胃黏蛋白的抑制，其最小抑制濃度分別為3.13、0.39、0.39μg/mL。蜜三糖是由半乳糖、果糖和葡萄糖結(jié)合而成，說明草魚體表粘液凝集素可能為半乳糖結(jié)合凝集素;而豬胃黏蛋白對(duì)草魚體表粘液凝集素的凝血活性也有很強(qiáng)的抑制作用，說明豬胃黏蛋白上的糖鏈結(jié)構(gòu)與草魚體表粘液凝集素結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域高度互補(bǔ)。

2.4 pH對(duì)草魚體表粘液凝集素活性的影響 不同pH對(duì)草魚體表粘液凝集素凝血活力影響的試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可知，pH在3～4時(shí)，草魚體表粘液凝集素?zé)o凝血活力;pH在5～7時(shí)，凝血活力隨pH升高而急劇增高，表明酸性條件能夠影響凝集素糖結(jié)合域（CRD）的位置，從而降低凝集素的凝血活性[8];pH在7～8時(shí)，凝集素的凝血活力達(dá)到最大（28）;pH在9～11時(shí)，凝集素凝血活性隨pH的增加而緩慢降低，表明OH-可能會(huì)改變凝集素電離狀態(tài)，從而降低了凝集素的凝血活性[9]。

2.5 溫度及時(shí)間對(duì)凝集活性的影響 不同溫度及時(shí)間對(duì)草魚體表粘液凝集素活性的影響試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。由表4可知，草魚體表粘液凝集素在常溫下（24℃）和30℃時(shí)，凝血活力最高（28），且隨時(shí)間增加，凝血活力變化明顯。當(dāng)溫度升高后，凝集素的凝血活力隨溫度及時(shí)間的增加而明顯降低。在40℃熱處理?xiàng)l件下，30min后，凝集素的凝血活力下降了25%;在50℃熱處理?xiàng)l件下，20min內(nèi)凝集素的凝血活力顯著下降，到30min時(shí)凝集素開始失活;在60℃熱處理?xiàng)l件下，5min后凝集素開始失活;而70℃時(shí)凝集素完全失活。由此可見，凝集素的凝血活性與處理溫度和時(shí)間不具有線性關(guān)系，而是會(huì)在溫度或時(shí)間超過某一值時(shí)突然下降。

3 結(jié)論與討論

魚類凝集素是魚類先天免疫的重要組成部分，在魚體免疫方面發(fā)揮著重要作用。魚類的先天免疫因子包括溶菌酶、抗菌肽、模式識(shí)別受體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、凝集素及轉(zhuǎn)鐵蛋白等。其中，凝集素因其特異性的識(shí)別功能，近年來逐漸成為學(xué)者們的重點(diǎn)研究對(duì)象。

本研究以草魚體表粘液凝集素為研究對(duì)象，經(jīng)PBS提取粗提物后，通過離子交換層析DEAE-52對(duì)該凝集素進(jìn)行初步純化，得到一種具有凝集雞血細(xì)胞的凝集素。該凝集素在20～40℃及pH 7～8條件下表現(xiàn)出較好的凝集活性，且該凝集素的凝集活性不依賴Ca2+的存在。依據(jù)凝血活性糖抑制試驗(yàn)結(jié)果，推測草魚體表粘液凝集素可能為半乳糖結(jié)合凝集素。

魚類凝集素成員種類繁多，幾乎具有復(fù)雜的凝集素家族所有組成成分，各類凝集素還具有多種亞型，在魚體免疫方面發(fā)揮著重要作用。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，不斷有新的魚類凝集素被發(fā)現(xiàn)，但其作用的分子機(jī)制尚不十分清楚。因此，魚類凝集素的深入研究，對(duì)提高魚類免疫及魚病防控等方面具有重要的指導(dǎo)意義。

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（責(zé)編：徐世紅）

基金項(xiàng)目：2017年河套學(xué)院自然科學(xué)研究一般項(xiàng)目（HYZQ201716）。

作者簡介：劉帥（1982—），男，內(nèi)蒙古巴彥淖爾人，講師，從事食品生物活性物質(zhì)研究工作。? 收稿日期：2021-01-03