實驗材料檢測在SPF 級實驗小鼠質量控制中的應用

陳國元，康 康，李曉嫻，紀文韜，張金梅，馮延花，田倩瑩，吳寶金

（中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心動物實驗技術平臺，上海 200031）

屏障設施作為SPF 級實驗動物飼養(yǎng)繁殖和動物實驗的主要場地，其日常運行的有效管理十分重要。屏障設施管理除了控制溫度、濕度、光照及噪音等環(huán)境條件，最重要的目標就是將病原微生物和寄生蟲等威脅動物健康的致病因子屏蔽在外[1]。屏障設施除了對標準中規(guī)定的各項參數(shù)進行控制外，還必須考慮其他因素對屏障內實驗動物質量的影響，其中威脅最大的是實驗過程中使用的各種各樣的實驗材料，尤其是那些在屏障外制備的、不允許經高壓滅菌的生物活性物質和試劑。

自2013 年中國科學院生物化學與細胞生物學研究所（現(xiàn)分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心）的2 400 m2動物屏障設施啟用至今，設施內飼養(yǎng)的實驗小鼠始終保持SPF 級。在實際工作中，本單位重視對帶入設施內實驗材料的管理，進行了連續(xù)5 年的大規(guī)模檢控工作，共檢測了一萬多份實驗材料樣品。現(xiàn)將本單位實驗材料檢控的措施和結果整理成文，以期對動物實驗設施的有效管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品的獲取

本研究涉及的檢測樣品僅為2015—2019 年實驗人員帶入本單位屏障設施的動物實驗材料。根據(jù)本單位對屏障設施管理的規(guī)章制度要求，每一位實驗人員在完成動物實驗后將實驗試劑或材料留樣送檢，溶液類樣品體積要求盡量超過100 μL。針對溶液類樣品和特殊飼料等非細胞類樣品，檢測其是否含帶細菌；針對細胞類樣品，則檢測其有無支原體。

1.2 菌落檢測方法

吸取100 μL 溶液類樣品，涂布于直徑9 cm無抗L B 平皿（上海科瑪嘉微生物技術有限公司）；送樣體積少于100 μL 時，使用無菌水補充體積至略超過100 μL，然后吸取100 μL 涂布于無抗LB 平皿。特殊飼料等固體樣品，則取小塊樣品無菌操作搗碎后，使用200 μL 無菌水浸泡，室溫稍微靜置，再吸取100 μL 上清液涂布于無抗平皿。平皿在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 以上，檢查有無菌落和菌落數(shù)量等。

1.3 支原體檢測方法

吸取細胞類樣品培養(yǎng)液上清1 000 μL，置于1.5 mL 的EP 管中，不足體積則用無菌水補足至1 000 μL。100 ℃加熱EP 管10 min，然后以12 000 r/min 離心10 min。只移取上清液100 μL至新的EP 管，該上清液作為后續(xù)PCR 檢測的樣品。上清液樣品于－20 ℃可保存1 周，于4 ℃只可保存1 d。

使用PCR 法檢測上清液樣品。PCR反應體系（共20μL）：2μL 待檢測上清樣品，10μL 2×EX Taq mix，0.5 μL 正向引物（序列：5'-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3'），0.5 μL 反向引物（序列：5'-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3'），7 μL 無菌去離子水。PCR 反應條件：94 ℃ 2 min，37 個循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s），72 ℃10 min。PCR產物使用含EB 的2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為10 μL/孔。使用上海天能公司生產的Tanon 凝膠成像儀對電泳膠拍照記錄，支原體陽性條帶在270 bp 附近。

1.4 細菌鑒定方法

對非細胞類實驗材料進行細菌檢測時，如果涂布的LB 平皿出現(xiàn)陽性菌落，則從平皿中隨機挑取菌落，用三線法劃線接種到營養(yǎng)瓊脂LB平板上，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。再從該平皿挑取單克隆菌落，利用試劑盒（康為世紀生物技術有限公司）提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用細菌通用引物進行PCR 擴增，正向引物序列為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物序列為5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，引物序列位于細菌16S 核糖體RNA對應的DNA 編碼區(qū)內。P C R 反應體系（共20μL）：2μL 樣品，10 μL 2×EX Taq mix，0.5 μL 正向引物，0.5 μL 反向引物，7 μL 無菌去離子水。PCR 反應條件：94 ℃ 8 min，30 個循環(huán)（94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s），72 ℃ 5 min。PCR 產物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果經BLAST比對后確定細菌種類。BLAST 使用的網站地址為https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

2 結果

2.1 樣品收集情況

從2015 年開始，根據(jù)制定的設施管理規(guī)定，要求實驗人員將帶入的實驗材料進行分樣送檢。在操作過程中，通過表格登記、傳遞倉監(jiān)控、定期回溯有無人員漏送樣品并加以提醒等措施，促使研究人員如實送檢樣品。送檢的樣品種類主要有化學和生物學試劑、麻醉劑、特殊飼料、細胞系、質粒、DNA 或RNA 等。5 年累計收檢樣品14 708 份，獸醫(yī)實驗室對所有樣品進行了檢測。表1 為2015—2019 年各種實驗材料數(shù)量（包括非細胞類樣品材料和細胞類樣品材料）、收檢樣品分類和總量統(tǒng)計結果。從表1 可以看出，隨著屏障內實驗小鼠飼養(yǎng)量和動物實驗量的逐年增加，實驗人員按照要求送檢的樣品總量也逐年遞增。

表 1 2015—2019 年收檢樣品分類和總量統(tǒng)計表Table 1 Classification and statistics for samples inspected from 2015 to 2019

2.2 非細胞類樣品菌落檢測結果

檢測結果顯示，約1/3 的樣品無菌落生長，多數(shù)送檢樣品有一定量菌落生長。經過初期的比較權衡，將單個平皿菌落總數(shù)30 個作為控制標準，超過30 個菌落的樣品判為細菌檢測不合格，并通知實驗人員處理所涉實驗的動物。從表2 列出的統(tǒng)計結果可以看到，2015 年剛開始實施實驗材料檢控時，非細胞類樣品細菌檢測陽性率比較高。細菌陽性的樣品數(shù)量和陽性率呈逐年下降趨勢，近年來處在低于1%的檢出率水平。圖1 中的LB 平皿為典型的樣品細菌檢測出現(xiàn)陽性的結果，據(jù)送樣的動物實驗人員反饋，該試劑沒有經過除菌處理。

圖 1 LB平皿培養(yǎng)結果Figure 1 Results of a sample cultured on LB plate

表 2 非細胞類樣品細菌檢測統(tǒng)計Table 2 Statistics for bacterial detection in non-cellualr material samples

表 3 細胞類樣品支原體檢測統(tǒng)計表Table 3 Statistics for mycoplasma detection in cell samples

2.3 細胞類樣品支原體檢測結果

檢測結果見表3。在2015 年送檢的細胞樣品中，支原體檢出率高達13.5%。隨著實驗人員的重視，細胞樣品的支原體檢出率逐漸降低，2019年僅為1.52%。圖2 顯示PCR 法對5 個細胞樣品的支原體檢測結果的電泳圖，其中泳道4～7 對應的4 個細胞樣品未檢測出支原體，泳道8 對應的1 個細胞樣品支原體陽性。

圖 2 細胞樣品PCR法檢測支原體電泳結果Figure 2 Results of electrophoresis of PCR products after mycoplasma detection in cell samples

2.4 實驗材料中攜帶的細菌種類鑒定

為探究實驗材料帶入細菌的類型，2019 年選取了20 份細菌檢測陽性樣品，對樣品中含有的細菌進行了鑒定。20 份樣品共隨機挑取了34 個單克隆菌落，提取相應基因組DNA，PCR 擴增后測序比對，從中鑒定出的細菌種類及數(shù)量見表4。樣品攜帶細菌以葡萄球菌屬的細菌居多；34 個單克隆菌落中，12 個為緩慢葡萄球菌，8 個為腐生葡萄球菌。

表 4 細菌類別鑒定結果Table 4 Results of identification of bacterial species

3 討論

本單位動物屏障設施現(xiàn)保養(yǎng)有13 000 籠實驗小鼠，至今持續(xù)運行已7 年多，設施內實驗小鼠質量始終符合SPF等級標準要求，這與從2015 年開始進行大規(guī)模實驗材料檢控措施有密切關系。本單位規(guī)定研究人員向屏障內傳遞實驗材料后，必須在屏障內將樣品分裝備檢，同時提供課題組、實驗人員姓名、樣品名稱、送檢日期等信息。當細菌檢測陽性或細胞支原體檢測陽性時，獸醫(yī)實驗室會通知研究人員對實驗材料制備過程進行整改，接觸過陽性實驗材料的小鼠須移出屏障設施。如果同一實驗人員帶入的實驗材料在1 年內累計出現(xiàn)3 次陽性檢測結果，則該實驗人員不能在動物屏障設施內繼續(xù)開展實驗。該措施實行5 年來，檢測的樣品總量逐年增多，但細菌和支原體陽性的樣品數(shù)量和陽性率均呈逐年下降趨勢，說明對帶入動物實驗屏障設施內實驗材料的檢控措施有助于降低實驗材料中微生物污染風險。

在做細胞培養(yǎng)時，實驗人員會時刻注意無菌操作，但在做動物實驗時往往疏于對材料的除菌處理，容易出現(xiàn)細菌或支原體污染。通過規(guī)則制定和配套檢控措施，能使實驗人員意識到控制實驗材料中微生物的重要性并加以重視，可有效降低實驗動物被污染的概率。一般實驗材料可以通過高溫消毒或濾膜過濾處理，一些不耐高溫高壓的材料可通過輻照除菌。實踐中，須督促實驗人員每次送檢帶入的實驗材料樣品。收到樣品后須及時檢測，如不能及時檢測，需將樣品放置4 ℃冰箱保藏，但不宜超過1 d，以防樣品中細菌傳代增量。

支原體是清潔級實驗小鼠也必須排除的病原體，支原體的感染會嚴重影響動物健康和實驗數(shù)據(jù)[2]。支原體污染是細胞培養(yǎng)中經常遇到的難題，本設施要求實驗人員對其細胞培養(yǎng)液進行自檢，支原體陰性的細胞方可帶入屏障設施。一旦發(fā)現(xiàn)有支原體陽性材料做過的動物實驗，相關小鼠須移出屏障設施。考慮到動物實驗的連續(xù)性，本單位在實踐中設有一個小型設施，用于接納可能被污染的實驗動物，避免造成支原體在控制嚴格的大型設施內傳播。這樣可以降低出現(xiàn)陽性結果后對實驗的影響，讓大部分實驗人員能夠做到切實配合送檢，既能保護大型屏障設施內的動物，也不會引起動物實驗人員的抵觸。另外，當細胞出現(xiàn)支原體污染，實驗人員往往會使用一些抗支原體的藥物加在培養(yǎng)液中進行控制，經過一段時間的藥物使用，細胞中的支原體會大幅減少，但是這樣的細胞系往往在停藥一段時間后又能被檢測到支原體。

為了探究收檢的實驗材料所攜帶的細菌類別，本單位通過測序鑒定到12 種細菌。其中鏈球菌是SPF 級實驗小鼠需排除的微生物，其余11種細菌未列入檢測排除項。這11 種細菌中，也有一些可影響人類或實驗動物健康，應加以關注。比如檢出次數(shù)最多的緩慢葡萄球菌曾被認為不具有致病性，但越來越多的資料表明它是人類或許多動物不可忽視的致病菌，對于免疫力低下的人群或動物可導致嚴重的后果，并能引起實驗小鼠的慢性死亡[3]；木糖葡萄球菌廣泛分散于自然界，以往認為是非致病菌，但此菌引起的感染時有報道[4]；產酸克雷伯菌雖未像肺炎克雷伯菌那樣須在SPF 級實驗小鼠中排除，但該菌同樣是重要的條件致病菌，主要寄生在人和動物的呼吸道和腸道，而實驗小鼠也對該菌易感[5]。由此可見實驗材料中攜帶微生物的種類非常多樣，因此一定要預先無菌處理，將其對實驗小鼠的危害降到最低。后續(xù)本單位將繼續(xù)檢控實驗材料，當出現(xiàn)陽性結果時，進一步探究不同實驗材料中容易攜帶的微生物種類，以便進一步探討其對實驗動物健康可能產生的影響。

總之，用于動物實驗的實驗材料都將與實驗動物直接接觸，其攜帶微生物的污染勢必影響實驗動物的健康，進而影響動物實驗數(shù)據(jù)的可靠性，還可能造成動物發(fā)病，并在屏障設施內傳播，所以對動物實驗材料進行檢控也就顯得必要和重要。本單位持續(xù)多年對實驗材料檢控的做法，有效保障了SPF 級實驗小鼠質量和設施安全，這一經驗對類似動物實驗屏障設施的運行管理具有參考意義。