慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鲋笜?biāo)的變化及其意義

張舒婷，姚青青，李宜珊，施熠煒

（1. 山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，太原 030001；2. 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，太原 030001）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種慢性肺循環(huán)疾病，由多種內(nèi)外因素引起肺血管結(jié)構(gòu)和（或）功能改變，使肺血管阻力進(jìn)行性升高，最終肺動(dòng)脈壓增高。PH 中有一類(lèi)低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH），此類(lèi)患者的5 年生存率僅為20%～36%，并且隨著病情進(jìn)展，死亡率明顯升高[1-2]。因此，盡早發(fā)現(xiàn)和治療HPH 對(duì)于延緩病程，降低病死率極其重要。動(dòng)脈血?dú)夥治鲎鳛橐环N常用檢測(cè)方法，可以同時(shí)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)動(dòng)脈血中血?dú)狻㈦娊赓|(zhì)及代謝物等的變化，對(duì)于疾病的及時(shí)診療具有重要意義[3]，但是目前關(guān)于動(dòng)脈血?dú)夥治鲈贖 P H 中的作用相關(guān)研究還比較少。因此，本研究首先構(gòu)建HPH 整體動(dòng)物模型，然后進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?，通過(guò)觀(guān)察動(dòng)脈血?dú)夥治鲋笜?biāo)的變化，探討動(dòng)脈血?dú)夥治鲋笜?biāo)在HPH 形成和發(fā)展中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的構(gòu)建和分組

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠36 只，8 周齡，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心[SCXK(晉)2015-0001]。將大鼠在通風(fēng)良好，環(huán)境安靜，溫度（24 ±2）℃的室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，每日光照12 h，自由飲食[SYXK(晉)2015-0001]。隨后將大鼠分為常氧對(duì)照組和低氧1 d、3 d、7 d、14 d 和21 d 組，其中常氧對(duì)照組大鼠在設(shè)施內(nèi)正常飼養(yǎng)（O2體積分?jǐn)?shù)為21%），其余5 個(gè)低氧組大鼠按經(jīng)典低氧艙造模方法放置在O2體積分?jǐn)?shù)為10%的低氧艙（長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司，CJDO2 245）內(nèi)分別飼養(yǎng)1 d、3 d、7 d、14 d 和21 d。低氧艙內(nèi)放有鈉石灰和氯化鈣，可吸收二氧化碳（CO2）和水蒸氣。每日打開(kāi)艙門(mén)30 min清理低氧艙，并補(bǔ)充水和食物。本研究嚴(yán)格遵循科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的要求，在符合動(dòng)物福利倫理的條件下進(jìn)行。

1.2 測(cè)定大鼠右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)和右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）

低氧造模結(jié)束后，取出大鼠，按體質(zhì)量向腹腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛（4 mL/kg）進(jìn)行麻醉并固定。逐層暴露右頸外靜脈，將PE-50 聚乙烯導(dǎo)管（美國(guó)Scientific Commodities Inc公司產(chǎn)品）一端經(jīng)右頸外靜脈插入右心室（right ventricular，RV），另一端連接PowerLab 多導(dǎo)生理記錄儀（澳大利亞ADInstruments 公司產(chǎn)品），采用右心導(dǎo)管法[4]測(cè)量RVSP。測(cè)定完成后，分離出心臟RV、左心室（left ventricular，LV）+室間隔（septum，S），分別稱(chēng)取質(zhì)量，并計(jì)算二者比值，以此評(píng)價(jià)右心室肥厚的程度，RVHI=RV/（LV+S）×100%。

1.3 肺組織Masson 染色及觀(guān)察

收集大鼠的右下肺，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甲醛溶液固定3 d，然后以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液脫水，二甲苯透明后，液體石蠟進(jìn)行包埋，用切片機(jī)沿肺門(mén)紋理橫切，制作厚度約5μm 的肺組織切片，進(jìn)行Masson 染色，顯微鏡下觀(guān)察肺動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)的病理學(xué)變化。

1.4 動(dòng)脈血?dú)夥治龅臏y(cè)定

剖腹后，采用肝素抗凝針經(jīng)腹主動(dòng)脈取血2 mL，注意排出針管內(nèi)的氣泡和隔絕空氣，使用ABL800 血?dú)夥治鰞x（丹麥Radiometer 公司產(chǎn)品）在15 min 內(nèi)進(jìn)行動(dòng)脈血檢測(cè)，測(cè)定指標(biāo)包括血液酸堿度即p H 值、動(dòng)脈血二氧化碳分壓（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、動(dòng)脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）、動(dòng)脈血氧飽和度（arterial oxygen saturation，SaO2）、碳酸氫鹽（HCO3－）、鈉離子（N a+）、鉀離子（K+）、鈣離子（Ca2+）、血細(xì)胞比容（hematocrit，Hct）和血紅蛋白（hemoglobin，Hb）含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠RVSP 和RVHI 的變化

相較于常氧對(duì)照組，低氧各組的RVSP 和RVHI 明顯增高（P＜0.05），并且隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)（表1）。

2.2 肺動(dòng)脈顯微結(jié)構(gòu)觀(guān)察

Masson 染色觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，常氧對(duì)照組肺動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)正常（圖1A）；低氧1、3 d 組肺動(dòng)脈變化不明顯；低氧7、14、21 d 組可見(jiàn)肺動(dòng)脈出現(xiàn)不同程度的改變，管壁增生肥厚且有大量膠原纖維沉積，管腔變窄，而且低氧時(shí)間越長(zhǎng)，這種改變?cè)矫黠@（圖1 B、C、D）。

表 1 大鼠RVSP和RVHI比較Table 1 Comparison of RVSP and RVHI in rats(± s)

表 1 大鼠RVSP和RVHI比較Table 1 Comparison of RVSP and RVHI in rats(± s)

注：RVSP 為右心室收縮壓，RVHI 為右心室肥厚指數(shù)；1 mmHg=0.133 kPa；與常氧對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

組 別 n RVSP/mmHg RVHI/%常氧對(duì)照低氧 1 d低氧3 d低氧7 d低氧14 d低氧21 d F值P值6 6 6 6 6 6 23.76±2.01 35.31±2.98*40.37±4.21*48.29±2.66*46.18±5.95*50.13±3.17*100.00±0.00 114.96±19.51*122.21±21.58*134.57±29.11*150.80±18.86*153.96±24.14*46.272 6.543<0.001 0.001

2.3 動(dòng)脈血?dú)夥治龈髦笜?biāo)水平

2.3.1 血?dú)庵笜?biāo)pH、PaCO2、PaO2、SaO2和HCO3－水平比較

與常氧對(duì)照組相比，低氧各組pH 和HCO3－水平明顯降低（P＜0.05），低氧21 d 組PaCO2明顯增高（P＜0.05），低氧14 d 組PaO2和SaO2明顯降低（P＜0.0 5）（表2）。

2.3.2 電解質(zhì)指標(biāo)Na+、K+和Ca2+水平比較

相比于常氧對(duì)照組，低氧3、7、14 和21 d組Na+水平下降明顯（P＜0.05），低氧1、3、7 和21 d 組K+水平升高明顯（P＜0.05），低氧3 d 組Ca2+水平下降明顯（P＜0.05）（表3）。

2.3.3 生化指標(biāo)Hct、Hb 水平比較

與常氧對(duì)照組比較，低氧各組（1、3、7、14、21 d）的Hct 和Hb 水平均明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0 5）（表4）。

2.4 動(dòng)脈血?dú)夥治鲋笜?biāo)與RVSP 的相關(guān)性

HPH動(dòng)脈血?dú)夥治鲋笜?biāo)中，Na+水平與RVSP呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表5，圖2），其余指標(biāo)與RVSP 的相關(guān)性并不顯著。

圖 1 大鼠肺組織Masson 染色 （×400）Figure 1 Masson staining of the lung tissue of rats (×400)

表 2 大鼠血?dú)庵笜?biāo)pH、PaCO2、PaO2、SaO2 和HCO3－水平比較Table 2 Comparison of blood gas index pH, PaCO 2, PaO2, SaO2 and HCO3－ levels in rats (± s)

表 2 大鼠血?dú)庵笜?biāo)pH、PaCO2、PaO2、SaO2 和HCO3－水平比較Table 2 Comparison of blood gas index pH, PaCO 2, PaO2, SaO2 and HCO3－ levels in rats (± s)

注：pH 為酸堿度，PaCO2 為動(dòng)脈血二氧化碳分壓，PaO2 為動(dòng)脈血氧分壓，SaO2 為動(dòng)脈血氧飽和度，HCO3－為碳酸氫鹽；與常氧對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

組 別 n pH PaCO 2/mmHg PaO2/mmHg SaO2/% HCO3－/(mmol·L－1)常氧對(duì)照低氧 1 d低氧3 d低氧7 d低氧14 d低氧21 d F值P值6 6 6 6 6 6 7.38±0 01 7.22±0.04*7.29±0.03*7.26±0.01*7.27±0.02*7.23±0.03*47.25±1.44 47.67±4.18 44.50±3.45 46.83±1.40 51.50±1.28 56.00±1.35*103.00±7.71 105.33±8.04 84.67±4.71 96.67±2.95 66.67±1.15*85.57±9.60 97.00±0.41 94.83±2.77 94.67±0.92 96.33±0.42 84.12±4.19*90.43±3.88 29.50±0.30 19.55±1.79*21.08±0.57*21.32±0.35*23.77±1.40*23.79±1.43*3.483 2.926 3.068 2.755 6.477 0.014 0.029 0.024 0.037<0.001

表 3 大鼠電解質(zhì)指標(biāo)Na+、K+和Ca2+水平比較Table 3 Comparison of electrolyte indicator Na+, K+ and Ca2+ levels in rats (± s)

表 3 大鼠電解質(zhì)指標(biāo)Na+、K+和Ca2+水平比較Table 3 Comparison of electrolyte indicator Na+, K+ and Ca2+ levels in rats (± s)

注：Na+為鈉離子，K+為鉀離子，Ca2+為鈣離子；與常氧對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

組 別 n Na+/(mmol·L－1) K+/(mmol·L－1) Ca2+/(mmol·L－1)常氧對(duì)照低氧 1 d低氧3 d低氧7 d低氧14 d低氧21 d F值P值6 6 6 6 6 6 133.00±0.82 130.17±0.95 129.33±0.99*129.33±0.84*128.67±1.61*129.29±0.81*5.70±0.15 8.13±0.49*8.80±0.65*8.80±0.46*6.55±0.29 7.40±0.24*1.19±0.02 1.25±0.03 1.09±0.02*1.17±0.01 1.15±0.02 1.15±0.03 1.643 7.385 5.306 0.018<0.001 0.001

表 4 生化指標(biāo)Hct、Hb水平比較Table 4 Comparison of Hct and Hb levels(± s)

表 4 生化指標(biāo)Hct、Hb水平比較Table 4 Comparison of Hct and Hb levels(± s)

注：Hct 為血細(xì)胞比容，Hb 為血紅蛋白；與常氧對(duì)照組比較，*P ＜0.0 5。

組 別 n Hct/% Hb/(g·L－1)常氧對(duì)照低氧 1 d低氧3 d低氧7 d低氧14 d低氧21 d F值P值6 6 6 6 6 6 35.50±3.01 46.00±3.21*54.33±2.17*45.17±1.35*56.67±2.12*52.67±0.88*13.15±1.12 16.88±0.99*20.10±0.81*16.68±0.50*20.97±0.78*19.50±0.33*11.804 12.253<0.001<0.001

表 5 各指標(biāo)水平與RVSP的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between index and RVSP

圖 2 大鼠 Na+與RVSP 的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis between Na+ and RVSP in rats

3 討論

HPH的病理生理基礎(chǔ)包括急性低氧性肺動(dòng)脈收縮、慢性低氧性肺動(dòng)脈重塑以及血液黏稠度增加、血栓形成等，多種因素共同作用可引起肺動(dòng)脈壓力升高，導(dǎo)致右心室肥厚，最終發(fā)展為心臟衰竭而死亡[5-6]。但是HPH 發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確。

pH、PaCO2、PaO2、SaO2和HCO3－是常用的血氧和酸堿平衡指標(biāo)。已有研究[7]表明，低氧性肺動(dòng)脈收縮、呼吸性酸中毒是形成HPH 的最常見(jiàn)原因，低氧和酸堿失衡可導(dǎo)致肺血管異常重塑，當(dāng)這兩者共同作用可使病情加重，而且HCO3－可作為PH 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)慢性低氧構(gòu)建HPH 大鼠模型，采用Masson染色觀(guān)察肺動(dòng)脈的形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與正常肺動(dòng)脈比較，低氧后的肺動(dòng)脈出現(xiàn)明顯的肺血管重塑。同時(shí)，動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組相比，低氧后大鼠pH、HCO3－水平明顯降低，PaO2和SaO2也明顯降低（低氧14 d 組），而PaCO2明顯升高（低氧2 1 d 組），與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的研究結(jié)果[8-9]相似。低氧環(huán)境下，動(dòng)物通過(guò)調(diào)動(dòng)體內(nèi)低氧代償機(jī)制維持正常的氧運(yùn)輸及利用。而在低氧14 d 時(shí)，由于無(wú)法攝取足夠O2，低氧引起的過(guò)氧化反應(yīng)增加，大鼠出現(xiàn)代償不足或失效，引起PaO2和SaO2顯著降低，導(dǎo)致低氧血癥、高碳酸血癥、代謝性酸中毒以及呼吸性酸中毒。在低氧適應(yīng)過(guò)程中，隨著大鼠體內(nèi)代償機(jī)制的恢復(fù)，攝取和利用O2能力增強(qiáng)，機(jī)體可獲得充足的O2。在低氧21 d 時(shí)，大鼠的PaO2和SaO2又升高，說(shuō)明在慢性低氧誘導(dǎo)的HPH 大鼠中，低氧和酸堿失衡參與并調(diào)控了HPH 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

肺血管細(xì)胞的鈉、鉀和鈣離子通道與低氧誘發(fā)肺動(dòng)脈收縮和重塑有關(guān)[10]。低氧可以直接抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）的電壓依賴(lài)性鉀通道表達(dá)，使K+外流減少，細(xì)胞膜發(fā)生去極化，引起鈣通道開(kāi)放Ca2+發(fā)生內(nèi)流，PASMCs 出現(xiàn)低氧性收縮和增殖。Na+/H+交換體是一種離子交換蛋白，可在轉(zhuǎn)運(yùn)一個(gè)Na+至細(xì)胞內(nèi)的同時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)一個(gè)H+到細(xì)胞外。低氧也可以通過(guò)激活PASMCs的Na+/H+交換體，使細(xì)胞內(nèi)pH 升高，從而降低電壓依賴(lài)性鉀通道活性，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，引起PASMCs 收縮和異常增殖[11-12]。在本實(shí)驗(yàn)中，低氧誘發(fā)大鼠肺動(dòng)脈收縮和重塑的同時(shí)，動(dòng)脈血中Na+、K+、Ca2+水平也發(fā)生改變，Na+水平（除低氧1 d 組）和Ca2+水平（低氧3 d 組）明顯降低，而K+濃度（除低氧14 d 組）明顯升高，并且在不同低氧時(shí)間具有波動(dòng)性，可能是在血液標(biāo)本采集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中血細(xì)胞隨機(jī)破壞發(fā)生溶血所致。在慢性低氧過(guò)程中，大鼠處于缺氧狀態(tài)，電解質(zhì)改變受低氧影響較大，并且隨著機(jī)體酸堿狀況的變化而變化。上述對(duì)不同低氧時(shí)間血氧和酸堿平衡指標(biāo)的研究結(jié)果提示，Na+、K+、Ca2+水平的改變可作為HPH 大鼠血液酸堿失衡的參考指標(biāo)之一，進(jìn)一步說(shuō)明這3 種電解質(zhì)的改變與HPH 的形成密切相關(guān)；并且通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Na+水平與RVSP 呈顯著負(fù)相關(guān)，Na+可間接評(píng)價(jià)HPH 病情嚴(yán)重程度。

Hct 是反映血液黏稠度最可靠的指標(biāo)，血液黏稠度越高，Hct 值越大，可用于預(yù)測(cè)HPH 病情嚴(yán)重程度[13-14]。另外，Hb 已被證實(shí)是形成HPH的重要因素[15]。低氧可以刺激腎臟產(chǎn)生和釋放促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）增多，促使骨髓生成紅細(xì)胞和Hb 增多，從而提高機(jī)體的血氧容量和血氧含量以維持正常的生理功能，并且紅細(xì)胞數(shù)量增多到一定程度后可反饋性抑制EPO 的生成，以抑制紅細(xì)胞數(shù)量的進(jìn)一步增加，Hb 升高達(dá)最高值后可保持相對(duì)穩(wěn)定[16]。本研究結(jié)果顯示，相比于常氧對(duì)照組，低氧后的Hct 和Hb水平均顯著增高，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，為適應(yīng)低氧環(huán)境，大鼠紅細(xì)胞數(shù)量和Hb 含量增高，Hct也隨之升高。PaO2和SaO2在低氧14 d 時(shí)最低，說(shuō)明大鼠無(wú)法攝取足夠O2，機(jī)體處于缺氧狀態(tài)；而Hct 和Hb 在低氧14 d 時(shí)最高，說(shuō)明大鼠調(diào)動(dòng)低氧代償機(jī)制，通過(guò)增加紅細(xì)胞Hb，提高攜氧能力以適應(yīng)低氧環(huán)境。但是，Hct 升高表示肺動(dòng)脈中的血液黏稠度增加，血液瘀滯，并且呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，加大血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致肺循環(huán)阻力增大，加之僅低氧本身就可以使肺動(dòng)脈發(fā)生收縮和異常重塑[17]，這幾個(gè)因素的同時(shí)出現(xiàn)更容易誘發(fā)HPH，并加重HPH 病情。

綜上，HPH 的病理生理過(guò)程涉及多個(gè)因素，可能與低氧、酸堿平衡紊亂、電解質(zhì)改變以及血液系統(tǒng)異常等有關(guān)。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)變化對(duì)于疾病的監(jiān)控以及評(píng)估HPH的嚴(yán)重程度具有重要的預(yù)警作用。臨床醫(yī)師可根據(jù)動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果盡早進(jìn)行干預(yù)治療及判斷預(yù)后，以有效降低HPH 患者的死亡率。