基于兩種棘球蚴絳蟲感染的小鼠肝組織病灶早期鈣化比較

高風(fēng)亦，邢稚坤，譚小武，俞曉凡，楊海成，趙雪源，廖原，陳雪玲，吳向未*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，新疆 石河子 832008；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 石河子 832008)

棘球蚴病是由寄生于人和動物體內(nèi)的棘球蚴引起的人畜共患病，俗稱“棘球蚴病”[1]。我國包蟲病類型主要可以分為泡型包蟲病和囊型包蟲病二種，分別由多房棘球絳蟲(泡狀棘球蚴)和細粒棘球絳蟲(細粒棘球蚴)寄生于人體內(nèi)部器官所致[2]。棘球蚴病感染人體后可寄生于人體各個臟器,以肝、肺為主，其他腦、腎、骨等臟器也有寄生。該病在我國的分布區(qū)域以西部牧區(qū)為主，新疆是高發(fā)地區(qū)之一，主要與放牧?xí)r接觸羊、犬有關(guān)，患病人數(shù)居全球首位，是我西部農(nóng)牧區(qū)群眾致病負擔(dān)的主要原因之一[3]。針對該疾病的發(fā)病機制，既往研究發(fā)現(xiàn)，泡狀棘球蚴病灶外周無完整纖維包膜，呈類似于惡性腫瘤的浸潤性生長；細粒棘球蚴病灶外周存在有纖維包膜，主要通過壓迫周圍組織、器官，從而引起組織細胞萎縮、壞死[4]。目前臨床診斷包蟲病以CT等影像學(xué)研究為主，結(jié)果提示疾病進展中，棘球蚴組織病灶周圍伴有大量的鈣化，鈣化反映了包蟲病的病理轉(zhuǎn)歸[5]。鈣化作為一種與肉芽腫反應(yīng)相關(guān)的慢性病理現(xiàn)象，是機體針對自身的一種保護[6]。目前我國針對肝棘球蚴病的治療首選根治性手術(shù)治療，但泡狀棘球蚴有類癌樣轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生較大范圍擴散，手術(shù)效果較差[7-8]。以往對包蟲病鈣化的研究大多集中在一種包蟲病上，且研究對象往往處于病變中晚期。通過比較兩種包蟲病不同時期的鈣化情況，可以明確其發(fā)病機制，進一步闡明兩種包蟲病早期疾病進展的差異，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

分別用等量的兩種不同棘球蚴原頭節(jié)種植于哺乳動物肝臟，構(gòu)建肝棘球蚴病感染模型，模擬寄生蟲體內(nèi)感染過程，比較不同類型棘球蚴病變病灶的鈣化情況。

1.2 材料

1.2.1 實驗動物

60只雌性C57BL/6 N小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，6～8周齡，體質(zhì)量(16±2)g，動物質(zhì)量合格證號：SCXK(京)2016-0006；20只子午沙鼠購于新疆維吾爾自治區(qū)疾控中心，雌性，8-12周齡，體質(zhì)量(32±2)g，動物質(zhì)量合格證號：SCXK(新) 2016-002；囊型肝包蟲病羊肝購于新疆沙灣縣屠宰場。

1.2.2 實驗試劑

DMEM/L(美國GIBCO公司)；RPMI-1640(美國GIBCO公司)；蘇木素染色液(北京九州柏林生物科技公司)；伊紅染液、茜素紅鈣鹽染色液(北京索萊寶)；兔多克隆抗體BMP-2(美國Abcam公司，ab14933)；兔二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司，PV-6001，ZLI-9018)；粘附載玻片(江蘇世泰實驗器材公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 棘球蚴原頭節(jié)的提取

泡狀棘球絳蟲原頭節(jié)：將約200 μL泡狀棘球絳蟲原頭節(jié)懸液(約2 000個頭節(jié)，實驗室預(yù)留種鼠中提取泡球蚴原頭節(jié))腹腔注射至健康子午沙鼠體內(nèi)，將確定感染泡狀棘球蚴病5個月后的子午沙鼠作為獲取泡狀棘球絳蟲原頭節(jié)的種鼠，頸椎脫臼法處死小鼠并提取泡球蚴組織，將提取組織置于無菌盤中，將PBS漂洗3次，依次剪碎、研磨組織，過濾獲得泡球蚴原頭節(jié)，PBS漂洗20次，0.4%臺酚藍染色后顯微鏡下鑒定活力，若成活率達95%以上，分裝到5 mL無菌試管內(nèi)，并加入3 mL含10%胎牛血清的DMEM/L培養(yǎng)基培養(yǎng)，以備造模。

細粒棘球絳蟲原頭節(jié)：取囊型肝包蟲病羊肝，當(dāng)日清洗，消毒羊肝表面，無菌條件下50 mL注射器抽取包蟲囊液，用PBS反復(fù)漂洗10次，提取細粒棘球蚴原頭節(jié)并收集于無菌培養(yǎng)瓶中；隨機抽取100 mL原頭蚴，經(jīng)0.4%臺酚藍染色后顯微鏡下鑒定原頭節(jié)的活性，成活率達98%以上使用；分裝到5 mL無菌試管內(nèi)，并加入3 mLRPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，以備造模。

1.3.2 棘球蚴原頭節(jié)感染C57BL/6 N小鼠肝組織

將60只健康的6～8周齡C57BL/6 N小鼠隨機分為2組，分別命名為泡狀棘球蚴(alveolaris echinococcus，AE)組和細粒棘球蚴(cystic echinococcosis，CE)組，每組30只，每只小鼠稱重后編號記錄，配制戊巴比妥鈉麻醉劑(濃度4%)，按0.1 mL/100 g計算每只小鼠的麻醉劑量并記錄，提前4～8 h禁食水；所有小鼠腹部用碘伏消毒后，用1 mL潔凈注射器按每只小鼠麻醉劑量抽取水合氯醛，腹腔注射后將小鼠分組放置于預(yù)置鼠籠片刻，用皮鑷刺激小鼠皮膚，觀察麻醉效果，若麻醉效果欠佳，追加100 μL戊巴比妥鈉；將麻醉后小鼠置于潔凈工作臺上，仰臥位固定四肢，再次碘伏消毒腹部手術(shù)區(qū)(劍突下2×2 cm范圍)3遍，用無菌眼科剪剪開腹部皮層與肌層，切口大小約1～2 cm，暴露肝臟，用1 mL注射器抽取濃縮后棘球蚴原頭節(jié)，用針頭輕輕挑起肝臟被膜，緩慢注射棘球蚴原頭節(jié)，被膜下見一約3×3 mm白色液泡，提示注射成功；使用4-0手術(shù)縫合線單純間斷縫合切口，再次消毒切口后放入相應(yīng)鼠籠中飼養(yǎng)，每3日喂食喂水，每周更換墊料1次[9]。

1.3.3 相應(yīng)時間點提取小鼠肝組織并甲醛固定

根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，按上述方法構(gòu)建棘球蚴小鼠肝臟感染模型，感染周期至180 d后，由于小鼠肝臟被棘球蚴大量侵襲，小鼠出現(xiàn)因肝衰竭導(dǎo)致的死亡，死亡率超過50%，故觀察周期終點設(shè)為180天。故按注射后30、90、180 d時間點，排除因麻醉猝死、急性肝衰竭、劇烈過敏反應(yīng)等其它培養(yǎng)期內(nèi)不可抗拒因素導(dǎo)致的實驗小鼠死亡，每個時間點隨機選擇5只小鼠提取肝組織；將小鼠置于潔凈工作臺上，采用急性大失血法(鼠眼眶動脈剪破)放血后頸椎脫臼法處死；將已處死小鼠仰臥位固定于潔凈工作臺上，用無菌眼科剪刀沿造模時手術(shù)路徑剪開腹部皮層與肌層，切口約1～2 cm，充分暴露肝臟，可見注射棘球蚴原頭節(jié)處肝葉有囊泡形黃色病灶，用組織剪游離肝周圍結(jié)締組織后充分暴露肝臟并提起后，沿第一肝門處小心剪斷門靜脈、肝動脈及膽總管，將組織置于10 mL EP管內(nèi)并標記；用4%中性福爾馬林固定液將肝組織固定，以備石蠟塊制備。

1.3.4 肝組織石蠟包埋及制片

每個時間點取出5個小鼠肝組織，福爾馬林固定24 h的肝組織，修剪成大小約1 cm×0.5 cm×0.1 cm的方形組織塊；將組織塊置于1/2石蠟+1/2二甲苯的混合物中，40 ℃恒溫箱過夜；次日提升恒溫箱溫度至60 ℃，換純蠟3次，每次1～2 h，將盛有組織的石蠟?zāi)＞咧糜?5 ℃～60 ℃燙板上，倒入材料并擺好，輕輕置于冷水盆中，待石蠟全部凝固后取出晾干；將包埋好的石蠟塊修塊后固定于切片機上切片，切片厚度5 μm，將切片在漂片機中展開，并將切片撈于粘附載玻片上，編號，65 ℃干烤1 h，將制作好的石蠟切片收入儲片盒中，備后續(xù)染色用。

1.3.5 組織切片H-E染色

按編號選擇時間點30、90、180 d小鼠肝組織切片，置于切片架上，60 ℃干燥箱烤片2 h，待石蠟融化后將切片按二甲苯-無水乙醇-95%乙醇-85%乙醇-75%乙醇的梯度酒精脫蠟，其中二甲苯脫蠟5分鐘，乙醇2～3 min；將脫蠟后切片用去離子水快速泡洗1遍，放入蘇木精染液中染色5 min后，酸水及氨水中分色各數(shù)秒鐘，流水沖洗1 h后入去離子水片刻，再入75%與95%乙醇中脫水各10 min后，酒精伊紅染色液染色2～3 min；染色后切片按梯度酒精透明，中性樹膠蓋玻片封固，貼好標簽。

1.3.6 組織切片茜素紅染色

按編號選擇時間點30、90、180 d小鼠肝組織切片，置于切片架上，60 ℃干燥箱烤片2 h，待石蠟充分融化后將切片按二甲苯-無水乙醇-95%乙醇-85%乙醇-75%乙醇的梯度酒精脫蠟，其中二甲苯脫蠟5 min，乙醇2～3 min；將脫蠟后切片用去離子水快速泡洗一遍后豎立放置，徹底風(fēng)干；切片用茜素紅染液滴染20 min，雙蒸水沖洗3次；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，貼好標簽。

1.3.7 組織切片免疫組化染色

按編號選擇時間點30、90、180 d小鼠肝組織切片，置于切片架上，60 ℃干燥箱烤片2 h，待石蠟融化后將切片按二甲苯-無水乙醇-95%乙醇-85%乙醇-75%乙醇的梯度酒精脫蠟，其中二甲苯脫蠟5 min，乙醇2～3 min；切片豎立放入EDTA裂解液中，高壓鍋內(nèi)高壓5 min(溫度121 ℃)抗原修復(fù)后，切片置于涼水槽中室溫晾干，自來水洗3遍后，胰酶消化3 min；1%PBS緩沖液洗滌3遍(每遍5 min)，甩干，擦水，油筆畫圈，滴加適量內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min后，1%PBS緩沖液沖洗5 min×3次，加50 μL BMP-2兔多克隆抗體，4 ℃冰箱過夜；第二天37 ℃溫箱復(fù)溫30 min后，1%PBS緩沖液洗滌5 min×3次，滴加100 μL增強酶標山羊抗兔IgG聚合物，室溫孵育1 h，1%PBS緩沖液沖洗5 min×3次；加入數(shù)滴新鮮配制的1∶100DAB顯色液，室溫孵育5～8 min，自來水終止顯色；蘇木素染色3～5 min，鹽酸酒精分化3 s，自來水沖洗5 min×3次，梯度酒精1 min晾干后，中性樹膠封片，貼好標簽。

1.3.8收集遴選組織切片后顯微鏡觀察并半定量檢測鈣化程度

兩種棘球蚴共遴選150張組織切片，每組75張，每個時間點25張，分別使用倒置顯微鏡觀察染色后組織切片，并拍攝圖像，將茜素紅染色切片圖像用ImageJ v1.8.0軟件進行處理，將茜素紅染色結(jié)果中的鈣化區(qū)域提取后計算面積并統(tǒng)計數(shù)值，半定量檢測鈣化程度，用Excel表格統(tǒng)計檢測結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，所有實驗結(jié)果重復(fù)3次。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各實驗組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差齊時，實驗組間比較(細粒棘球蚴組與泡狀棘球蚴組)用兩獨立樣本t檢驗。實驗組內(nèi)(3個時間節(jié)點的組織鈣化程度)的比較用方差分析。若各實驗組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布、方差齊時，采用非參數(shù)Tamhane’s T2(M)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組棘球蚴感染肝組織的H-E染色結(jié)果

通過將兩種棘球蚴感染的肝組織切片進行H-E染色比較，結(jié)果表明：在30、90、180 d 3個時間點，alveolaris echinococcus(AE，泡狀棘球蚴)組和cystic echinococcosis(CE，細粒棘球蚴)組組織切片在顯微鏡下均可見到棘球蚴感染肝組織后產(chǎn)生的囊泡樣病灶，病灶周圍有明顯的組織炎性帶，病灶內(nèi)殘余原頭節(jié)數(shù)量隨時間增加而逐漸減少，至180 d時完全消失；病灶的大小隨著時間增加而增大。其中，AE組病灶囊壁欠規(guī)整且不連續(xù)，CE組病灶囊壁較AE組更規(guī)則且相對完整(圖1)。這說明棘球蚴感染肝組織后形成了較典型的包蟲感染病灶，有形成鈣化的條件。

A組為泡狀棘球蚴肝組織；B組為細粒棘球蚴肝組織，1、2、3分別代表棘球蚴感染30、90、180 d時間點(100×)圖1 兩種棘球蚴肝組織不同時間點H-E染色

A組為泡狀棘球蚴肝組織；B組為細粒棘球蚴肝組織，1、2、3分別代表棘球蚴感染30、90、180 d時間點(100×)圖2 兩種棘球蚴組織不同時間點BMP-2免疫組化染色高表達區(qū)域

2.2 反映鈣化程度的BMP-2在棘球蚴病灶囊壁的表達情況

反映鈣化程度的BMP-2在棘球蚴病灶囊壁的表達情況,見圖2。

BMP-2是參與鈣化形成的重要因子，通過將兩種棘球蚴感染的肝組織切片進行針對BMP-2的免疫染色，結(jié)果表明：在30、90、180 d 3個時間點，AE組和CE組的囊泡樣病灶內(nèi)均可見連續(xù)或不連續(xù)的褐色沉積物，提示BMP-2的高表達。其中，30 d肝組織病灶內(nèi)的褐色沉積主要為分布于囊內(nèi)的殘余包蟲；90 d和180 d肝組織病灶內(nèi)的的褐色沉積主要分布于囊壁上(圖2)。這說明，棘球蚴感染一定時間后的肝組織病灶有鈣化，且鈣化主要分布于病灶囊壁。

2.3 茜素紅染色結(jié)果

通過將兩種棘球蚴感染的肝組織切片進行茜素紅染色，結(jié)果提示：在30、90、180 d 3個時間點，AE組和CE組的肝組織病灶均可見到橘紅色顆粒樣沉積。其中，30 d組織病灶中的沉積顆粒集中在病灶囊內(nèi)，囊壁無明顯橘紅色沉積，90 d和180 d組織病灶中，橘紅色沉積呈線狀分布于囊壁上，囊內(nèi)無明顯沉積顆粒；AE組病灶囊壁上的鈣鹽沉積呈顆粒堆積狀凸入囊內(nèi)，囊壁形態(tài)不規(guī)則、不連續(xù)，CE組病灶囊壁上的鈣鹽沉積呈半透明條帶狀，囊壁形態(tài)規(guī)則、連續(xù)(圖3)。

這說明，棘球蚴感染一定時間后的肝組織病灶有鈣化且兩種棘球蚴肝病灶的鈣鹽沉積方式不同。

A組為泡狀棘球蚴肝組織；B組為細粒棘球蚴肝組織，1、2、3分別代表棘球蚴感染30、90、180 d時間點(100×)圖3 兩種棘球蚴不同時間點肝組織茜素紅染色

2.4 針對茜素紅染色和免疫組化染色結(jié)果進行半定量檢測和統(tǒng)計學(xué)分析

為進一步比較兩種棘球蚴肝組織病灶鈣化程度的不同，使用ImageJ v1.8.0軟件和SPSS 20.0分別統(tǒng)計和分析鈣化面積，結(jié)果顯示：在30、90、180 d 3個時間點，兩種棘球蚴肝組織病灶的整體鈣化程度均隨時間增加而增大，其中，在30、90、180 d 3個時間點，AE組的鈣化面積均小于CE組(P<0.05)(圖4)。這說明，在棘球蚴原頭節(jié)感染肝組織的整個周期內(nèi)，棘球蚴感染的肝組織病灶鈣化程度隨時間增加而增大，其中，細粒棘球蚴感染的肝組織病灶鈣化程度較泡狀棘球蚴感染的肝組織病灶鈣化程度高。

圖4 根據(jù)兩種染色半定量檢測結(jié)果的差異性比較

3 討論

肝包蟲作為一種寄生蟲疾病，其病灶特點與其他寄生蟲病類似，病理過程可簡單分為增殖、纖維化、鈣化三個階段[10]。彭心宇等[11]的研究表明，肝包蟲病灶有內(nèi)、外兩層，因這兩層均是肉芽腫反應(yīng)引起的纖維囊樣病變，內(nèi)層是蟲體在進入肝組織后引起其周圍組織發(fā)生局部肉芽腫反應(yīng)后不斷生長的蟲體導(dǎo)致該肉芽腫組織隨之受壓、膨大并逐漸增厚形成，而外層則是由于內(nèi)層纖維囊壁膨脹擠壓囊周Glisson系統(tǒng)和肝靜脈系統(tǒng)，導(dǎo)致局部肝組織營養(yǎng)不良性壞死，導(dǎo)致組織纖維化,形成的另一層纖維囊壁，兩者形成機制不同。而機體為了限制包蟲囊性病灶的進一步擴大，使病灶周圍出現(xiàn)營養(yǎng)不良性鈣化，屬于病理性異位鈣鹽沉積，是一種機體的自我保護反應(yīng)。當(dāng)完整的鈣化囊壁形成，病變局限于鈣化囊壁內(nèi)而無法發(fā)展，提示病變自愈[12]。兩種棘球蚴在機體中侵襲方式的不同使兩者的鈣化出現(xiàn)差異進而產(chǎn)生不同的病理轉(zhuǎn)歸[13]。本實驗中，通過觀察組織切片化學(xué)染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)炎性肉芽腫反應(yīng)演變的鈣化主要集中于內(nèi)囊壁，而外周有明顯的擠壓壞死的肝細胞，這進一步驗證了肝棘球蚴病的病變機制。

近年來，針對肝泡狀棘球蚴病和肝細粒棘球蚴病等病灶鈣化特點的研究以針對某一種棘球蚴病的影像學(xué)研究為主[14]。這類研究的對象往往為病程較長患者，病灶性質(zhì)趨于穩(wěn)定，無法觀察該疾病早期病變的病灶特點，且影像學(xué)檢查相較于組織學(xué)，雖然在臨床診斷上有方便、快捷的特點，但對于病灶的病理特點和病灶的組織學(xué)細節(jié)無法直接觀察，不易獲得周期完整的病理演變進程[15-16]。因此，基于本課題組既往研究，作者以哺乳動物體內(nèi)實驗?zāi)M兩種棘球蚴感染肝組織后，較為完整的觀察兩種肝棘球蚴病早期病變過程中病灶的鈣化特點及差異。主要通過按30 d、90 d、180 d 3個時間點分別進行病變肝組織化學(xué)染色，并選擇骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)作為免疫組化染色對象，以明確鈣化的分布情況及程度。BMP-2是一種骨誘導(dǎo)性生長因子，于1965年首次發(fā)現(xiàn)，是迄今為止已知的最強的骨誘導(dǎo)因子之一[17-18]。既往研究表明包蟲病囊腫囊壁細胞具有成骨潛能，BMP-2促進囊壁細胞的礦化和成骨成熟[19]，且BMP-2已被證實具有參與和調(diào)控間充質(zhì)干細胞成骨分化和骨組織形成的能力[20-21]。通過對組織切片進行免疫組化染色，尋找BMP-2高表達的區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP-2在內(nèi)囊壁高表達，驗證了肝棘球蚴病灶的鈣化主要在內(nèi)囊壁，同時也說明肝棘球蚴病內(nèi)層病灶以炎性肉芽腫性炎癥為主要病變表現(xiàn)；兩種棘球蚴感染病灶的大小和鈣化程度均隨著時間增加而增大,細粒棘球蚴囊壁鈣化灶呈單一蛋殼樣或條帶狀，主要集中分布于包蟲的內(nèi)層囊壁，而泡狀棘球蚴囊壁鈣化灶為侵襲性多發(fā)病灶，呈點狀或團塊狀，無法形成完整的鈣化囊壁，且實驗過程的前中期細粒棘球蚴感染病灶的鈣化程度較泡狀棘球蚴感染病灶鈣化程度高，這說明相較于泡狀棘球蚴，細粒棘球蚴相對完整的病灶形態(tài)更易形成大量鈣化，以盡快達到機體自我保護狀態(tài)。

本實驗旨在研究兩種肝棘球蚴病變早期病灶的鈣化特點及差異，實驗周期為0～180 d，因?qū)嶒炦^程中發(fā)現(xiàn)泡狀棘球蚴病灶鈣化程度的增加并非線性增長，故選擇30、90、180 d 3個鈣化程度最明顯的節(jié)點進行整體統(tǒng)計分析，相應(yīng)時間節(jié)點之間的具體病理變化未做進一步研究，且模型培養(yǎng)180 d后因小鼠肝臟機械性損傷導(dǎo)致的死亡率較高，無法進行后續(xù)觀察研究，故觀察周期局限為180 d。

綜上所述，在小鼠肝棘球蚴病病變早期，兩種棘球蚴感染的肝組織病灶均可形成囊壁鈣化，主要為內(nèi)囊鈣化，肝細粒棘球蚴病灶鈣化程度較肝泡狀棘球蚴病灶鈣化程度更高，更易形成完整的鈣化囊壁以達成穩(wěn)定病灶，這種差異也間接反映了兩種棘球蚴在體內(nèi)侵襲方式和轉(zhuǎn)歸的不同。通過觀察比較兩種肝棘球蚴感染病灶早期的各階段變化差異，發(fā)現(xiàn)病變過程中的鈣化特點，為后續(xù)該種疾病針對鈣化的相關(guān)組織學(xué)研究提供研究基礎(chǔ)，也可以為兩種肝棘球蚴病的早期臨床診療方式提供更多組織學(xué)依據(jù)和借鑒意義。