干血點采樣設備及方法在興奮劑檢查中的應用

溫洪濤，高久翔，王新宅，于 亮*

（1.中國反興奮劑中心，北京 100029；2.北京體育大學 運動人體科學學院，北京 100084）

干血點（dried blood spot，DBS）采樣法作為采集生物樣品的一種新型醫(yī)療血樣處理方式，通過將極少量血樣保存在濾紙上，干燥后用于疾病篩查和檢測研究，具有創(chuàng)傷小、取樣簡單、運輸方便、節(jié)省研究經(jīng)費、可長期穩(wěn)定保存樣本等優(yōu)勢（Li et al.，2010；Matthew et al.，2018），受到各國多領域的重點關注。目前DBS檢測方法已廣泛應用在新生兒篩查、特異性抗體檢測等領域（Mcdade et al.，2020；Thevis et al.，2020）。中國反興奮劑中心（CHINADA）與國際奧委會（IOC）、世界反興奮劑機構（WADA）、國際檢查機構（ITA）和美國反興奮劑機構（USADA）共同創(chuàng)立國際干血點項目，力爭在北京冬奧會和冬殘奧會正式實施，干血點項目成為我國首次在反興奮劑領域全方位參與的創(chuàng)新項目。為確定并推廣興奮劑檢查過程中最合適的DBS樣本采集器材，中國反興奮劑中心對不同項目運動員進行不同采血位置（指尖/上臂）的器材測試，通過確定符合“WADA干血點樣本采集技術文件-TD2021DBS”（WADA，2021）規(guī)定采血量的樣本收集方式，同時對運動員和檢查官對于不同采血位置的偏好和器材的使用感受進行分析，旨在將DBS檢查方法在反興奮劑領域進行推廣，做到從“抽檢”到“普查”，從“等候檢查”到“立行立檢”。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

考慮到運動員性別、地區(qū)、從事項目、對手指依賴程度等因素，結合現(xiàn)有測試器材，本次測試工作選擇來自12個項目，包含力量類、耐力類、技巧類等項群，覆蓋奧運會和冬奧會的大部分興奮劑高危項目，其中男運動員30名（18歲以下14人），年齡（17.43±3.65）歲，女運動員30名（18歲以下14人），年齡（17.47±4.01）歲。所有被試在進行任何研究程序之前均已簽署知情同意書，基本情況見表1。

表1 測試對象基本情況Table 1 Basic Information of Subjects

手指依賴度要求較高的項目包括滑雪、擊劍、舉重、排球、皮劃艇、拳擊、賽艇和體操，手指依賴度要求較低的項目包括滑冰、自行車、游泳、田徑（非投擲項目）。測試時間集中在10～11月，根據(jù)海拔、比賽溫度、運動基地分布等因素將測試地區(qū)選在北京、黑龍江、貴州、青海、浙江。

1.2 研究方法

1.2.1 檢查官選擇

由于國際上尚未正式開展DBS檢查，為統(tǒng)一工作標準，中國反興奮劑中心通過內(nèi)部小范圍器材測試，結合國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《WS/T 661—2020靜脈血液標本采集指南》，制定“干血點樣本采集程序”文件，并于開展測試前對中國反興奮劑中心檢察官進行實操培訓，最終選取12名具有血液采集資質(zhì)的專職檢察官進行了11次采集測試。

1.2.2 采樣器材選擇

根據(jù)WADA技術文件中對100 μL血量的采集要求，選取 Tasso、HemaXis、HemaSpot、Capitainer及金豪 5種采血器材（Tasso設備自帶內(nèi)置針頭，無對應的采血耗材），以及施萊低血量（SL）、施萊中血量（SM）、施萊高血量（SH）、BD低血量（BDL）、BD中血量（BDM）、BD高血量（BDH）6種采血針頭，測試不同型號采血針頭的最大采血量。5種采血器材的部分參數(shù)如表2所示。

表2 5種采血器材參數(shù)對比Table 2 The Parameters of 5 Blood Collection Equipments

1.2.3 采集程序及要求

由于干血點檢查為新型檢查方式，且有穿刺行為，因此，檢查官采集過程中全程佩戴手套，并且保證運動員已洗手，手部清潔。檢查官根據(jù)“干血點樣本采集程序”，使用指定的采血針頭及儲存器材進行操作，采集過程包括采血、取樣、保存、運輸、分析等（圖1）。

圖1 干血點采樣流程（以HemaXis DB10為例）Figure 1. Sample Collection Process of Dried Blood Spots（HemaXis DB10）

1）運動員在檢查官的指示下，從3套干血點采血套件中選擇1套，與檢查官共同確認采血套件的完整性及安全性；2）運動員和檢查官共同核對A/B采集卡、A/B采集卡密封袋以及外包裝號碼，確保所有號碼一致；3）建議運動員暖化采樣位置，例如，用溫水洗手、甩手、按摩雙手或采用外部加熱等方式；4）選擇運動員非優(yōu)勢手的無名指進行干血點樣本采集，穿刺部位應盡可能無胼胝（老繭）和傷疤；5）用干燥的無菌紗布將第1滴血擦干，采集完成后在穿刺位置放置無菌止血棉，指導運動員持續(xù)按壓30～60 s；6）運動員在檢查官的指導下，將采集卡放入密封袋并確保密封袋內(nèi)有干燥劑，運動員與檢查官需共同確認密封袋密封性完好，將密封袋放入外包裝袋中，再次確認外包裝袋密封性完好；7）注意：為盡量減少皮下出血，建議運動員在至少30 min內(nèi)不從事任何劇烈運動。

為測試采血器材在實際操作中的使用性和每種型號針頭的最大采血量，每名運動員測試3種樣本采集器材，除Tasso品牌采血設備外，其余器材分別選擇同一品牌的不同型號針頭，既測試器材，又同時測試針頭出血量。采血過程中記錄血量合格時手指的按摩次數(shù)。

1.2.4 使用體驗調(diào)查

樣本采集完成后，運動員和檢查官均需填寫體驗問卷。體驗問卷包括運動員體驗和檢查官測試體驗2部分，對每次測試進行記錄。運動員體驗問卷主要收集運動員基礎信息、興奮劑檢查經(jīng)歷、采血針頭痛感體驗、器材采集過程體驗、興奮劑檢查類型偏好和意見等方面。檢查官測試體驗主要記錄采血量、按摩手指次數(shù)、器材使用體驗、樣本采集時間、樣本采集滿意度以及意見建議等。

1.3 統(tǒng)計方法

使用IBM SPSS Statistics 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準差（M±SD）表示，差異顯著性水平P＜0.05，借助GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

2 實驗結果

2.1 采集類型偏好

在樣本采集完成后，對60名被試運動員進行樣本采集偏好調(diào)查。7人因之前未參加過興奮劑檢測故不做統(tǒng)計，53名運動員共收集159人次采集偏好結果，其中110人次將DBS采樣方式排在第1順位，99人次將血檢采樣方式排在第2順位，93人次將尿檢檢查方式排在第3順位。對運動員偏好進行量化分數(shù)統(tǒng)計，第1順位得3分，第2順位得2分，第3順位得1分。統(tǒng)計結果顯示，DBS平均得分為2.54±0.74，尿檢平均得分為1.61±0.79，血檢平均得分為1.85±0.60，運動員對這3種檢查方式的偏好具有顯著性差異（圖2）。

圖2 運動員對興奮劑檢查方式的偏好Figure 2.Athletes’Preference for Doping Control Methods

2.2 痛感及滿意度

為排除不同手指痛感反應程度不同的影響，本研究統(tǒng)一對受試者非優(yōu)勢手的無名指進行采樣，通過李克特量表量化運動員采血過程中的痛感程度（總分10）。大多數(shù)運動員認為，DBS采集過程中的痛感在2～4之間，有5次采集評分≥8分。分析運動員對不同采血器材及針頭的痛感，結果顯示（圖3），Tasso采集手臂血痛感評分為2.82±2.10。指尖血采集中，施萊品牌SL針頭痛感評分為2.77±1.76，SM針頭痛感評分為3.00±1.41，SH針頭痛感評分為2.75±1.73。BD品牌BDL針頭痛感評分為2.29±1.35，BDM針頭痛感評分為2.00±1.24，BDH針頭痛感評分為3.55±2.43。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，運動員對各針頭的疼痛感無顯著性差異。

圖3 運動員對不同采血針頭的痛感評分Figure 3.Athletes’Pain Scores for Different Blood Collection Needles

通過對受試運動員采血針頭痛感與滿意度情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)（表3），運動員對各采血針痛感評價符合預期率達到77.42%。對SL、SM、SH、BDL、BDM采血針的滿意率為100%。手臂采集及高血量針頭采集指尖血的刺痛感較強，但中國運動員經(jīng)常接受生化測試，對痛感反饋一般。

表3 采血針頭痛感與滿意度情況統(tǒng)計Table 3 The Pain Feeling and Satisfaction of Blood Sampling Needles

2.3 采血量情況

將不同種類針頭采血量同WADA規(guī)定的100 μL定量采集要求相比發(fā)現(xiàn)（表4），與BDL針頭采血合格率相比，其余6組采血合格率均具有統(tǒng)計學差異（χ2=45.528，P＜0.05），但該6種針頭之間采樣合格情況無統(tǒng)計差異（P＞0.05）。

表4 不同針頭采血合格情況統(tǒng)計Table 4 The Qualifications of Different Blood Sampling Needles

進一步對采血量進行分析（圖4），SL針頭平均采集指尖血（171.77±83.01）μL，SM針頭平均采集指尖血（135.00±64.68）μL，SH針頭平均采集指尖血（167.50±87.88）μL，表明施萊品牌3種采血針的采血量并無顯著差異，均可滿足要求。BDL針頭平均采集指尖血（53.81±39.05）μL，無法滿足要求，采血量顯著低于BDM和BDH兩種型號，BDM針頭平均采集指尖血（164.81±93.49）μL，BDH針頭平均采集指尖血（220.00±101.73）μL。Tasso采集手臂血平均采血（89.85±29.45）μL。

圖4 不同采血針采血量統(tǒng)計Figure 4.The Blood Collection Volume of Different Needles

手臂血的采血量普遍低于指尖血，合格率也相對較低。指尖血收集過程中BDL針頭出血量集中在0～49 μL，無法滿足WADA要求的100 μL定量采集，其余5種針頭出血量雖會出現(xiàn)100 μL以下的情況，但發(fā)生率較低，并且平均出血量可滿足WADA要求（圖5），并且5種針頭出血量之間無顯著性差異。在滿足WADA采樣量要求的基礎上，從運動員權益角度考慮，可使用出血量較少的SM型號采血針，從檢查官采樣合格率角度考慮，可使用BD品牌的BDM和BDH型號的采血針。

圖5 不同針頭出血量分布情況Figure 5.Distribution of Blood Collection Volume of Different Needles

2.4 采血時間

本研究采血時間從拆除包裝取出采血針開始記錄，到將血液收集到過濾卡中截止。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，DBS采血平均用時（3.81±2.41）s，Tasso采集手臂血平均用時（7.90±2.19）s，手臂血采集時間顯著高于指尖血采集時間（P＜0.01）。SL針頭采集指尖血用時（2.58±0.89）s，SM針頭采集指尖血用時（3.50±1.18）s，SH 針頭采集指尖血用時（2.91±0.94）s；BDL針頭采集指尖血用時（3.10±1.04）s，BDM針頭采集指尖血用時（2.68±1.18）s，BDH針頭采集指尖血用時（2.79±1.29）s（圖6）。整體比較，指尖血采集較為方便，不同型號針頭采集指尖血的時間無明顯差異。

圖6 不同采血針采血時間比較Figure 6.The Blood Collection Time of Different Needles

2.5 采血按摩次數(shù)

為滿足采血量要求，取血時向遠端方向輕輕按摩手指近端以增加血流量（WADA，2021）。Tasso采集手臂血時，一般一次性就可以完成采集。使用不同針頭采集指尖血發(fā)現(xiàn)，施萊的SL，SM，SH采血針分別需要按摩（7.16±2.11）次、（8.10±1.74）次、（7.09±2.00）次手指，方可滿足采血量要求。BDH采血針需要按摩手指次數(shù)最少，只需（4.83±2.65）次即可滿足采血量的要求，其按摩手指次數(shù)顯著少于其他采血針。BDL采血針需按摩（8.21±1.45）次。BDM采血針需按摩手指（6.22±2.58）次，明顯少于SH和SM采血針按摩手指的次數(shù)（圖7）。從按摩次數(shù)考慮，BDM、BDH采血針更理想。

圖7 不同采血針采血按摩手指次數(shù)Figure 7.Finger Massage during Blood Collection of Different Blood Collection Needles

2.6 問題分析

使用5種采血器材對手臂和指尖進行采血180次，失敗51次，總失敗率為28.3%。其中使用Tasso對運動員進行手臂采血34次，失敗12次，失敗率26.5%。使用HemaXis采集指尖血37次，失敗7次，失敗率18.9%。使用HemaS-port采集指尖血38次，失敗6次，失敗率15.8%。使用Capitainer采集指尖血34次，失敗13次，失敗率38.2%。使用金豪采集指尖血37次，失敗8次，失敗率21.6%。比較發(fā)現(xiàn)，HemaSport采集成功率最高，明顯高于Capitainer采集成功率（P=0.027）。

進一步分析失敗原因發(fā)現(xiàn)，運動員凝血過快、針頭采血量不足是采血失敗的重要原因，運動員自身血脂過高也會對采血過程造成一定影響。使用Tasso采集手臂血失敗12次，1次因運動員血脂過高，11次因采集血量不足。

使用HemaXis采血器材失敗7次，出現(xiàn)1次血脂過高、1次凝血過快和5次采血量不足情況，其中SH采血針出現(xiàn)2次血量不足，BDL采血針出現(xiàn)3次血量不足情況（圖8）。

圖8 HemaXis器材與不同采血針使用情況分析Figure 8.The Use of HemaXis Devices with Different Blood Collection Needles

使用HemaSpot采血器材失敗6次，出現(xiàn)1次凝血過快和5次采血量不足情況，其中BDL采血針出現(xiàn)4次血量不足，BDM采血針出現(xiàn)1次凝血情況（圖9）。

圖9 HemaSpot器材與不同采血針使用情況分析Figure 9.The Use of HemaSpot Devices with Different Blood Collection Needles

使用Capitainer采血器材失敗13次，出現(xiàn)3次凝血過快和10次采血量不足情況，其中SL、SM、SH采血針各出現(xiàn)2次血量不足情況，BDL采血針出現(xiàn)1次血量不足，BDM采血針出現(xiàn)2次血量不足，BDH采血針出現(xiàn)1次血量不足情況（圖10）。

圖10 Capitainer器材與不同采血針使用情況分析Figure 10.The Use of Capitainer Devices with Different Blood Collection Needles

使用金豪品牌采血器材失敗8次，出現(xiàn)1次血凝過快和7次采血量不足情況，其中SL采血針血量不足3次，SM采血針血量不足1次，BDL采血針血量不足2次，BDH采血針血量不足1次（圖11）?？傮w來看，金豪品牌采血設備搭配不同采血針均有失敗可能。

圖11 金豪器材與不同采血針使用情況分析Figure 11.The Use of Jinhao Devices with Different Blood Collection Needles

綜上，不推薦Capitainer采血器材，金豪采血器材與SM或BDM采血針搭配使用次數(shù)較少，同時與其他型號采血針搭配均有失敗可能。BDM和BDH采血針可與除Capitainer外的采血器材一起使用。建議綜合考慮不同采血器材與采血針搭配情況，HemaXis采血器材可搭配BDM或BDH采血針使用，HemaSpot采血器材可搭配SL、SM、SH、BDM、BDH采血針一起使用。

3 討論

面對即將到來的2022年北京冬奧會，WADA與世界各地的反興奮劑機構積極推進DBS技術的開展和實施（WADA，2019）。新冠肺炎疫情期間，美國反興奮劑機構通過嘗試新研發(fā)的Tasso干血點采集設備，以遠程視頻監(jiān)督的方式對運動員進行DBS試驗，以解決各地體育賽事停擺及人員流動限制造成的傳統(tǒng)興奮劑采樣工作無法開展的問題（新華社，2020）。隨著北京冬奧會的臨近，興奮劑檢查的需求大幅提升，相比傳統(tǒng)的尿檢和血液檢查，推廣更簡潔有效的采樣流程是提高興奮劑檢查效率、確保運動員純潔參賽的重要途徑。本研究通過對不同采血器械及采血針采血效果、運動員和檢查官的偏好反饋進行比較，確定最佳的采血組合器械以便在后續(xù)興奮劑采集過程中進行推廣應用。

3.1 對DBS檢查的反饋評價

目前DBS樣本采集有兩種方式，一是對指尖或上臂進行穿刺，采集60～100 μL血液直接制成干血點，二是采集靜脈全血樣運輸至實驗室后，再制成干血點?？紤]到采集效果和運動員體驗，本研究選擇第1種DBS采集方式。對運動員進行調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，運動員整體認為疼痛感較低，對DBS采集滿意度較高。有研究報道，在身體表面多個區(qū)域進行痛感靈敏度測試時，指尖是對疼痛最敏感的區(qū)域（Mancini et al.，2014），但在本研究中，運動員對BDM針頭采集指尖血的痛感最低，并且各種針頭采血疼痛感無明顯差異，手臂和手指間痛感無差異，可能與測試樣本數(shù)量較少，標準差較大有關，也可能與60名受試運動員中有29人未滿18歲，收樣時需教練陪同，無法真實反饋痛感有關。運動員對采血位置的偏好，暫未發(fā)現(xiàn)與性別、運動項目、區(qū)域等因素有關，對于選擇指尖血的運動員來說，僅僅是因為手部血液流動性相對較好，采集只需要幾秒鐘，操作方便。此外，相比傳統(tǒng)的尿液和靜脈血采集，美國反興奮劑機構調(diào)查14名運動員發(fā)現(xiàn)，其中13人認為DBS樣本采集器材容易操作，德國反興奮劑機構對65名運動員進行的一項研究中，81%的人對Tasso-M20器材的總體評價是“非常好”，86%的人對其評價“使用簡單”（Fedoruk，2020a），本研究中運動員也更傾向在未來興奮劑檢查時使用DBS技術，因為DBS采集過程簡單、快速、不令人生畏。另外，本研究只涉及12名檢查官參與，后續(xù)可擴大檢察官調(diào)查范圍，從運動員和檢查官角度分別對DBS技術的應用效果進行評價。

3.2 DBS采血過程分析

目前興奮劑檢測的全血、血清和尿液樣本均要在嚴格控制的條件下進行采樣、收集、轉移，并在WADA認證的反興奮劑實驗室完成檢測，以上過程需考慮樣本采集時間、成本、方式、污染和穩(wěn)定性等問題。DBS技術可較好地解決上述問題，通常大部分DBS檢查可在5 min內(nèi)完成，本研究取血過程集中在2～12 s，并且不受采樣時間、地點和人員等因素限制，為非專業(yè)人士自我取樣或大規(guī)模樣本采集提供了可能（Sikombe et al.，2019）。與傳統(tǒng)尿液檢查相比，DBS采樣過程無需提供尿液樣本，排除了尿液被污染、偽造的可能（Fedoruk et al.，2020b）。與傳統(tǒng)靜脈取血相比，DBS技術具有創(chuàng)傷小、取量少、降低接觸感染率等優(yōu)勢，此外，DBS采樣不受嚴格溫度限制，運輸方便并可以保證樣本的穩(wěn)定性。

目前已開發(fā)出幾種DBS采樣設備，如HemaXis?、hemaPEN?采血裝置和VAMS?采血技術，在無需點樣的條件下直接采集指尖血形成DBS。本研究根據(jù)目前國內(nèi)器材現(xiàn)有情況，通過篩選5種采血設備和6種采樣針頭進行組合比較，以便確定最佳DBS取樣組合，為后續(xù)推廣DBS采樣技術做準備。TASSO上臂血采集裝置雖然能通過完全集成的設備實現(xiàn)更加一致、安全和快速地形成4個20 μL DBS樣本（Fedoruk et al.，2020b），但無法滿足WADA定量采集100 μL血液的要求。指尖血采集時，BDL采血針無法取血100 μL，但BD品牌的中、高血量針頭取血合格率高于施萊品牌的3種針頭。在與5種采血裝置配合使用過程中發(fā)現(xiàn)，Capitainer裝置失敗率最高，13次失敗中10次因采血量不足，但僅3次與BDL針頭搭配所致，進一步分析原因，推測可能與該器材對血液樣本質(zhì)量、點樣溫度的要求高，同時血液自身黏度導致血液在濾紙上擴散程度不同，引起血細胞比容效應依賴性偏差等（Lange et al.，2020）。HemaXis、HemaSpot、金豪 3 種裝置中 HemaSpot失敗率最低。故后續(xù)使用DBS技術進行興奮劑采樣時，暫推薦指尖血采集，以BD品牌中、高血量采血針為主，優(yōu)先考慮與HemaSpot裝置一起使用，不推薦使用Capitainer裝置。

3.3 DBS失敗情況分析

傳統(tǒng)靜脈血采集是將醫(yī)療器械介入到人體內(nèi)，對血管進行直接干預和操作，對運動員造成一定傷害，操作人員的規(guī)范性將直接影響采集血液的質(zhì)量及實驗室生化檢測結果。國外因實驗室前操作不當引起的血液標本不合格率為 46%～68%（Lippi et al.，2013），國內(nèi)為 35%～75%（容桂榮等，2008）。2010年WHO報告最常見的3種不合格血液標本類型為溶血、污染和標簽錯誤（World Health Organization，2010），我國不合格血液標本類型主要為溶血、標本凝塊和血液標本量不合格（高立卉等，2015）。DBS采樣操作簡便，能有效降低因操作不當引起樣本不合格的風險。本研究中180次DBS采樣的失敗率為28.3%，失敗情況集中在采血量不足和血液凝固兩方面，低于傳統(tǒng)靜脈取血的不合格率，其中采集指尖血失敗率為25%（26次血量不足、8次凝血或血脂高），與前期丹麥反興奮劑機構調(diào)查報告中28%失敗率接近，但本研究在統(tǒng)計采血失敗率時僅為樣本采集階段，在實驗室檢測階段的情況并未考慮，后續(xù)隨著研究的推進，可結合采樣和檢測階段的結果綜合考察不同品牌、型號采血器材的搭配使用情況。通常在指尖血采血過程中為保證獲得足夠的血量，在對手指進行輕微按摩時經(jīng)常伴有“擠”手指的被動情況，這可能是由于未對手指進行預熱，手指末梢血液循環(huán)不暢，血液在血點HF濾紙上凝結或在手指上凝結，導致采集的血液量不足，提示在針頭采集血液后可通過移液槍將血液轉移到采樣卡（Loria et al.，2020），同時注意保證吸血裝置距離采樣卡若干毫米，以便血樣碰觸到卡時會迅速均勻分散開（Edelbroek et al.，2009）。美國等國家逐漸推廣的Tasso裝置在本研究中采集手臂血的失敗率為35.3%（11次血量不足、1次血脂高），遠高于丹麥反興奮劑機構調(diào)查報告中的6%。因運動項目對手指依賴度的需求及運動員個人喜好不同等原因，應排除器材自身結構、故障、操作等因素，后續(xù)進一步具體分析血量不足的原因，降低失敗率并進行應用推廣。

4 結論與展望

4.1 結論

1）DBS技術采集血樣時建議使用耗時更短、合格率更高的指尖血采集形式。

2）采血針推薦使用BD品牌的中、高血量型號，相比施萊品牌，BD品牌采血針采血量略高，合格率更高。

3）結合目前器材、運動員偏好、疼痛感、采血合格率、采血時間等角度綜合考慮，不推薦Capitainer采血器材，HemaXis采血器材可搭配BDM或BDH采血針使用，HemaSpot采血器材不與BDL采血針一起使用。

4.2 展望

在一線或國家隊運動員間開展干血點檢測（試點），對計劃參加北京冬奧會和冬殘奧會的運動員開展檢查，擴大測試范圍，針對本次測試的不足，調(diào)整測試方案和測試問卷，結合器材研發(fā)進展，全面系統(tǒng)開展干血點檢查工作。