無(wú)乳鏈球菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)

路 璐 ， 祝 宇 ， 顏興瓊 ， 龔 蕾 ， 孫衛(wèi)星 ， 楊金朋 ， 曲偉杰

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 云南昆明650201)

無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae，GBS)，又稱B群鏈球菌，它是一種具有高度傳染性的專性乳腺寄生菌。在我國(guó)，因無(wú)乳鏈球菌引起的奶牛乳房炎發(fā)病率高達(dá)20%～40%，在德國(guó)[1]和巴西[2]等地也可達(dá)到11%～60%?？梢?，無(wú)乳鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，應(yīng)引起科研人員的高度重視。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究均表明，抗生素在臨床上的廣泛使用導(dǎo)致致病菌的耐藥性問題越來(lái)越嚴(yán)重，尤其是多重耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生給奶牛乳房炎的臨床治療帶來(lái)了很大困難。因此，及時(shí)準(zhǔn)確的掌握致病菌的耐藥情況是目前防治奶牛乳房炎的關(guān)鍵，這對(duì)于指導(dǎo)臨床合理使用抗生素、防治無(wú)乳鏈球菌性乳房炎有著極其重要的意義。本試驗(yàn)對(duì)15株無(wú)乳鏈球菌臨床分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并檢測(cè)其攜帶的主要耐藥基因，旨在了解本地區(qū)的無(wú)乳鏈球菌的耐藥情況，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 采自昆明某地區(qū)的71份隱性乳房炎(經(jīng)蘭州乳房炎檢測(cè)法LMT檢測(cè)體細(xì)胞數(shù)>50萬(wàn)/mL)病牛乳樣。

1.2 質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌 ATCC25923，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室凍存；GBS標(biāo)準(zhǔn)株，購(gòu)自廣東微生物菌種保藏中心。

1.3 培養(yǎng)基和主要試劑 5%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基；革蘭染色試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；鏈球菌屬生化編碼鑒定管，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和Gold view核酸染料，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2×RapidTaqMaster Mix，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自北京沃比森科技有限公司；DL-2 000 DNA Marker，購(gòu)自TaKaRa(大連)公司。

1.4 主要儀器設(shè)備 所用儀器包括超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、氣浴恒溫振蕩器、微量移液器、離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析儀等。

1.5 病原菌的分離培養(yǎng)及鑒定

1.5.1 菌株的分離及生化鑒定 用無(wú)菌棉拭子輕輕蘸取采集的乳樣在5%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并挑取疑似菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。于血平板上挑取疑似菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色、鏡檢，觀察其菌體形態(tài)。挑取革蘭染色陽(yáng)性的疑似鏈球菌的菌落接種血平板進(jìn)行純培養(yǎng)后進(jìn)行觸酶試驗(yàn)、CAMP檢測(cè)和生化鑒定。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定 參考GenBank公布的無(wú)乳鏈球菌菌16S rDNA和特異性cfb基因序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，采用PCR擴(kuò)增法對(duì)疑似菌株進(jìn)行鑒定，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物信息見表1。PCR 陽(yáng)性產(chǎn)物直接送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的紙片擴(kuò)散法Kirby-Bauer(K-B)，測(cè)定無(wú)乳鏈球菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。取細(xì)菌純培養(yǎng)菌液0.2 mL滴入LB瓊脂培養(yǎng)基中，用三角環(huán)均涂勻后用滅菌鑷子將藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面，每個(gè)培養(yǎng)皿貼5片，輕壓使其與瓊脂表面完全接觸；將培養(yǎng)皿倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，用尺子測(cè)量每個(gè)藥敏紙片的抑菌直徑，記錄重復(fù)3次，抑菌圈直徑為3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(Nccls)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.7 青霉素及紅霉素耐藥基因的檢測(cè) 通過(guò)藥敏試驗(yàn)可知分離菌對(duì)青霉素及紅霉素高度耐藥，因此，通過(guò)GenBank和相關(guān)文獻(xiàn)資料[3-4]査閱無(wú)乳鏈球菌青霉素及紅霉素相關(guān)的耐藥基因序列，運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用PCR法擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺類耐藥基因pbp1a、pbp2b、pbp2x，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermA、ermB、mefA，PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。各耐藥基因的引物信息見表1。

表1 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)乳鏈球菌的分離與鑒定

2.1.1 細(xì)菌的形態(tài)及染色特性 在5%血平板上可見到菌落呈灰白色、半透明、表面光滑、圓形隆起的小菌落，呈β溶血；挑取疑似單菌落涂片鏡檢，結(jié)果顯示為革蘭陽(yáng)性菌，呈鏈狀排列；觸酶試驗(yàn)為陰性。將鏡檢形態(tài)均符合鏈球菌特性，且觸酶試驗(yàn)為陰性的細(xì)菌，判定為鏈球菌屬細(xì)菌。本試驗(yàn)從71份隱性乳房炎乳樣中分離到鏈球菌36株。

2.1.2 CAMP及生化試驗(yàn)結(jié)果 CAMP檢測(cè)可觀察到部分血平板上金黃色葡萄球菌和分離菌劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣的β溶血區(qū)，結(jié)果顯示呈陽(yáng)性。

鏈球菌分離株的3次生化試驗(yàn)結(jié)果比較穩(wěn)定，其結(jié)果顯示，有部分分離株均能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、蕈糖，馬尿酸鈉陽(yáng)性，七葉苷、甘露醇、山梨醇呈陰性，水解精氨酸呈陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，PYR試驗(yàn)陰性。與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》相對(duì)照，鑒定出無(wú)乳鏈球菌15株，所占比例為41.7%。

2.1.3 PCR鑒定結(jié)果 對(duì)臨床分離的36株疑似鏈球菌進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，有15株分離菌通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像系統(tǒng)可看到在1 500 bp處出現(xiàn)明亮的條帶；其特異性引物則在903 bp處出現(xiàn)明亮的條帶，兩種引物均與預(yù)期條帶一致(圖1、2)。在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST程序比對(duì)分析，結(jié)果顯示與無(wú)乳鏈球菌的同源性均在99%以上。該結(jié)果與上述生化鑒定結(jié)果一致。

圖1 15株無(wú)乳鏈球菌通用引物PCR產(chǎn)物電泳圖

M：DL-2 000 Marker；W：陽(yáng)性對(duì)照； 1～15：PCR產(chǎn)物； 16：陰性對(duì)照

圖2 15株無(wú)乳鏈球菌特異性引物PCR產(chǎn)物電泳圖

M：DL-2 000 Marker；W：陽(yáng)性對(duì)照； 1-15：PCR產(chǎn)物； 16：陰性對(duì)照

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 分別對(duì)15株奶牛乳房炎源無(wú)乳鏈球菌臨床分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。該試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)無(wú)乳鏈球菌對(duì)目前臨床上使用的大部分抗生素比較敏感，如對(duì)頭孢類抗生素、四環(huán)素類、喹諾酮類及慶大霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾敏中度或高度敏感，可供臨床參考；但也有部分菌株對(duì)一些藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，如對(duì)青霉素、紅霉素、林可霉素、克林霉素、萬(wàn)古霉素、氨芐西林、新生霉素、磺胺異惡唑的耐藥率均較高，耐藥率依次分別為100%、93.3%、93.3%、93.3%、93.3%、80%、80%、53.3%，尤其是對(duì)青霉素嚴(yán)重耐藥，其耐藥率達(dá)到100%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

15株無(wú)乳鏈球菌分離株，表現(xiàn)出不同的耐藥類型，其中最少的是3耐(1株)，最多可達(dá)到15耐(1株)。大部分菌株表現(xiàn)出7種或8種耐藥表型，其中7耐有5株，占33.3%；8耐有4株，占26.7%。在分離的15株無(wú)乳鏈球菌中，共出現(xiàn)10種耐藥譜。該結(jié)果表明，奶牛場(chǎng)長(zhǎng)期頻繁大量使用青霉素、紅霉素等藥物，并且不按照相關(guān)用藥規(guī)定使用，濫用抗生素，導(dǎo)致如此高的多重耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生，這種現(xiàn)象應(yīng)引起高度的重視。15株無(wú)乳鏈球菌分離株的相關(guān)耐藥譜及耐藥類型見表3。

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 采用PCR法對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥基因pbp1a、pbp2b、pbp2x，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermA、ermB、mefA進(jìn)行了檢測(cè)，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行了BLAST比對(duì)，試驗(yàn)結(jié)果顯示在β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢測(cè)中，15株無(wú)乳鏈球菌均檢出pbp1a和pbp2b基因，其檢出率均達(dá)到100%，但未檢出pbp2x；在大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因檢測(cè)中，ermB的檢出率達(dá)到100%，15株均含有ermB基因，ermA和mefA基因均未檢出。耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見圖3、4、5。

表2 15株無(wú)乳鏈球菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S：敏感，I:中介R：耐藥

表3 15株無(wú)乳鏈球菌分離株耐藥類型和耐藥譜

圖3 15株無(wú)乳鏈球菌pbp1a基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

M:DL-2 000 Marker；P:陽(yáng)性對(duì)照； 1～15：PCR產(chǎn)物； 16：陰性對(duì)照

圖4 15株無(wú)乳鏈球菌pbp2b基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

圖5 15株無(wú)乳鏈球菌ermB基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

M:DL-2 000 Marker；P:陽(yáng)性對(duì)照； 1～15：PCR產(chǎn)物； 16：陰性對(duì)照

3 討論

無(wú)乳鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，近年來(lái)，由于奶牛乳房炎的感染增多，臨床上常選擇性應(yīng)用青霉素等抗生素成為奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)常用的防治措施之一[5-7]，加之抗菌藥的不合理使用，使得細(xì)菌的耐藥性增加，常用抗菌藥物(β-內(nèi)酰胺類)的殺菌作用大大減弱。本次試驗(yàn)通過(guò)對(duì)分離的15株無(wú)乳鏈球菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果可知本地區(qū)無(wú)乳鏈球菌分離株對(duì)常用的青霉素類、紅霉素、林可胺類等抗生素存在不同程度的耐藥現(xiàn)象，尤其對(duì)青霉素完全耐藥，故臨床上不能繼續(xù)使用此類藥物來(lái)治療乳房炎，應(yīng)選擇敏感性高的藥物，如頭孢類、喹諾酮類等抗生素控制乳房炎。此外，該地區(qū)的多重耐藥現(xiàn)象也比較嚴(yán)重，其中以7耐和8耐居多，共9株，占60%，這很可能是本地區(qū)奶牛乳房炎的治療失敗原因之一。因此，在治療奶牛乳房炎時(shí)應(yīng)合理使用抗生素，定期進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，及時(shí)調(diào)整藥物使用方案。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)耐青霉素和紅霉素的分離菌進(jìn)行常見耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果顯示，15株無(wú)乳鏈球菌均檢出攜帶ermB、pbp1a和pbp2b基因，說(shuō)明在本地區(qū)導(dǎo)致無(wú)乳鏈球菌紅霉素耐藥的主要機(jī)制是ermB基因，而pbp1a和pbp2b基因是導(dǎo)致該菌青霉素耐藥的主要機(jī)制。本次試驗(yàn)結(jié)果分析可知，耐藥性菌株攜帶erm和pbp基因，其中所有分離菌均含有pbp1a和pbp2b兩種耐藥基因，與藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，均表現(xiàn)出青霉素耐藥，而大部分?jǐn)y帶ermB基因的菌株與藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符，表現(xiàn)出紅霉素耐藥，但有1株菌攜帶ermB基因卻不對(duì)紅霉素耐藥，這很可能是由于該株菌基因不表達(dá)或其表達(dá)量較低引起的。由于青霉素和紅霉素均存在多種耐藥基因，且各地區(qū)基因的分布情況差異較大，為了完全弄清楚該地區(qū)奶牛乳房炎無(wú)乳鏈球菌耐藥基因分布情況，還需要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行更廣泛更深入的探究。