卵巢上皮性癌細(xì)胞中miR-338-3p過表達(dá)對MACC1表達(dá)及細(xì)胞遷移和侵襲的影響

張瑞濤，李 松，史惠蓉，馮 巍，劉哲穎，姬鵬程

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052 2)南陽市中心醫(yī)院婦科 河南南陽 473000

腫瘤細(xì)胞的廣泛侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致卵巢上皮性癌患者預(yù)后不良和生存期較短的首要原因，但其侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍不清楚[1]。越來越多的研究[2-3]顯示，微小RNA參與調(diào)節(jié)大多數(shù)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，與惡性腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、腫瘤微環(huán)境、血管生成等侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)過程關(guān)系密切。本課題組的前期研究結(jié)果[4]顯示，微小RNA-338-3p(microRNA-338-3p，miR-338-3p)在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)明顯低于正常卵巢組織，且與患者的預(yù)后不良相關(guān)，并利用生物信息數(shù)據(jù)庫檢索預(yù)測發(fā)現(xiàn)MET 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(MACC1)可能是miR-338-3p的下游靶基因。MACC1既往稱為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1，與多種人類惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；本課題組前期研究結(jié)果[5-6]表明MACC1異常表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。目前，有關(guān)miR-338-3p與卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系的報(bào)道較少，為此，作者進(jìn)行了以下研究，擬探討卵巢上皮性癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-338-3p對MACC1表達(dá)及細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料人上皮性卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3和OVCAR-8購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)，RPMI 1640完全培養(yǎng)基購自美國HyClone公司。Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，SYBR Green PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司，pMIR-GLOTM雙熒光素miRNA靶向表達(dá)載體購自美國Promega公司，Transwell和基質(zhì)膠購自美國BD公司，miR-338-3p過表達(dá)慢病毒載體(pLenti-Ⅲ-miR-338-3p-GFP)和MACC1過表達(dá)慢病毒載體(pLenti-GIII-MACC1-CMV)由廣州RiboBio公司構(gòu)建。兔抗人MACC1、Wnt3a、p-LRP6、LRP6多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，鼠抗人GAPDH單克隆抗體、WB及IP蛋白裂解液、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒、Wnt/β-catenin 通路抑制劑IWP-2購自上海碧云天生物科技公司。

1.2miR-338-3p與MACC1靶向關(guān)系的預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證利用在線醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫dbDEMC檢索miR-338-3p在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)，TargetScan Human數(shù)據(jù)庫檢索預(yù)測miR-338-3p調(diào)節(jié)的下游靶基因。由廣州RiboBio科技公司設(shè)計(jì)合成可與miR-338-3p結(jié)合的野生型MACC1基因3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(untranslated region，UTR)序列和突變型序列，并插入pMIR-GLOTM雙熒光素miRNA靶向表達(dá)載體。分別將1×104個(gè)OVCAR-3和OVCAR-8細(xì)胞加入96孔板中，設(shè)置3孔重復(fù)，參照說明書將野生型和突變型MACC1 3’UTR載體分別與miR-338-3p過表達(dá)慢病毒載體共轉(zhuǎn)染OVCAR-3和OVCAR-8細(xì)胞，孵育48 h后收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測試劑盒說明書操作測定熒光值，以海腎熒光素酶活性為對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)OVCAR-3、OVCAR-8細(xì)胞。將miR-338-3p和MACC1過表達(dá)慢病毒載體分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染OVCAR-3、OVCAR-8細(xì)胞，并以陰性對照慢病毒載體轉(zhuǎn)染為對照，經(jīng)5 mg/L嘌呤霉素篩選72 h后傳代培養(yǎng)，至對數(shù)生長期收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)基預(yù)處理24 h，將含有3×105個(gè)細(xì)胞的300 μL無血清培養(yǎng)基分別加入Transwell小室(侵襲實(shí)驗(yàn)需提前2 h預(yù)鋪100 μL基質(zhì)膠)，插入含有700 μL完全培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)16 h(遷移實(shí)驗(yàn))或36 h(侵襲實(shí)驗(yàn))，取出小室，無水甲醇固定20 min，結(jié)晶紫(遷移實(shí)驗(yàn))或蘇木精-伊紅(侵襲實(shí)驗(yàn))染色15 min，PBS溶液漂洗后擦去小室上層膜表面細(xì)胞，倒置顯微鏡下放大100倍計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)小室下層膜表面的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5各組細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)的qRT-PCR檢測Trizol提取細(xì)胞總RNA，參照TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。RT-PCR所用引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，miR-338-3p上游引物5’-AACCGGTCCAG CATCAGTGATT-3’，下游引物5’-CAGTGCAGGGTC CGAGGT-3’(74 bp)；U6上游引物5’-CTCGCTTCG GCAGCACA-3’，下游引物5’- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(70 bp)。參照SYBR Green PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL，含cDNA 模板 2 μL、SYBR Premix EX Taq酶Ⅱ 10 μL、上下游引物各0.8 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、核糖核酸游離水6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，共40 個(gè)循環(huán)。將U6設(shè)為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-338-3p相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6各組細(xì)胞中MACC1、Wnt3a、p-LRP6、LRP6蛋白表達(dá)的Western blot檢測提取細(xì)胞樣本總蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)進(jìn)行蛋白定量。分別取50 μg總蛋白進(jìn)行100 g/L SDS-PAGE電泳，恒壓20V半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，含50 g/L脫脂奶粉、體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫20枸櫞酸鹽緩沖液室溫封閉2 h，按說明書濃度分別用一抗(MACC1、Wnt3a、p-LRP6、LRP6)4 ℃孵育過夜，二抗IgG(按1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h。ECL發(fā)光試劑盒顯色后曝光，Image J軟件分析特異性目的條帶的灰度值，將GAPDH設(shè)為內(nèi)參照，分別計(jì)算其相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將經(jīng)典Wnt/β-catenin通路抑制劑IWP-2(30 μmol/L)處理24 h的卵巢癌細(xì)胞作為陽性對照，進(jìn)一步觀察了miR-338-3p和MACC1過表達(dá)對經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 7.0軟件分析數(shù)據(jù)，多組數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析和(或)非參數(shù)檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè))。

2 結(jié)果

2.1miR-338-3p與MACC1靶向關(guān)系的驗(yàn)證結(jié)果利用TargetScan Human在線數(shù)據(jù)庫檢索顯示，miR-338-3p可與MACC1基因的3’UTR靶向結(jié)合，MACC1是其下游靶基因之一，見圖1。miR-338-3p過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-338-3p表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Western blot結(jié)果顯示MACC1蛋白水平明顯下降(P<0.05)，詳見表1、圖2和表2。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，共轉(zhuǎn)染miR-338-3p過表達(dá)載體和野生型MACC1基因3’UTR載體的卵巢癌細(xì)胞相對熒光值明顯低于對照組(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染突變型MACC1基因3’UTR載體的卵巢癌細(xì)胞相對熒光值無明顯變化，詳見圖3和表3。

A：dbDEMC數(shù)據(jù)庫中miR-338-3p在卵巢上皮性癌組織的表達(dá)明顯低于正常卵巢組織中的表達(dá)；B：TargetScan Human在線數(shù)據(jù)庫檢索預(yù)測MACC1為miR-338-3p潛在的下游靶基因之一

表1 各組卵巢癌細(xì)胞中miR-338-3p的表達(dá)

圖2 各組卵巢癌細(xì)胞中MACC1蛋白的表達(dá)

表2 各組卵巢癌細(xì)胞中MACC1蛋白的表達(dá)

圖3 miR-338-3p與野生型及突變型MACC1基因3’UTR結(jié)合示意圖

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-338-3p與MACC1基因3’UTR結(jié)合情況

2.2過表達(dá)miR-338-3p和MACC1對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對照載體的卵巢癌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-338-3p過表達(dá)載體可明顯減少遷移和侵襲細(xì)胞的數(shù)量，轉(zhuǎn)染MACC1過表達(dá)載體可顯著增加遷移和侵襲細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05)。與轉(zhuǎn)染MACC1過表達(dá)載體細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染miR-338-3p和MACC1過表達(dá)載體的卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯降低(P<0.05)。見圖4、表4、表5。

表4 各組卵巢癌細(xì)胞遷移數(shù)目的變化

表5 各組卵巢癌細(xì)胞侵襲數(shù)目的變化

上兩行圖：遷移實(shí)驗(yàn)；下兩行圖：侵襲實(shí)驗(yàn)

2.3過表達(dá)miR-338-3p和MACC1對Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見圖5、表6。Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-338-3p過表達(dá)可抑制Wnt3a和p-LRP6的表達(dá)(P<0.05)；與轉(zhuǎn)染MACC1過表達(dá)的細(xì)胞相比，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-338-3p和MACC1過表達(dá)載體的卵巢癌細(xì)胞Wnt3a和p-LRP6的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，上述結(jié)果提示miR-338-3p可能通過調(diào)節(jié)MACC1抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的活性。

1：陰性對照組；2：IWP-2組；3：miR-338-3p過表達(dá)組；4：MACC1過表達(dá)組；5：MACC1過表達(dá)+IWP-2組；6：miR-338-3p過表達(dá)+MACC1過表達(dá)組

表6 各組卵巢癌細(xì)胞中經(jīng)典Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是人類惡性腫瘤細(xì)胞重要的生物學(xué)特點(diǎn)之一，在多數(shù)卵巢癌患者尤其是晚期卵巢癌患者中表現(xiàn)尤為明顯[7]。半個(gè)世紀(jì)以來，關(guān)于卵巢癌發(fā)生發(fā)展的研究取得了長足進(jìn)步，但其侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。研究[8-13]表明，miR-338-3p在胃癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肝癌、乳腺癌和食管癌等惡性腫瘤組織中低表達(dá)，并與患者預(yù)后不良相關(guān)；上調(diào)上述腫瘤細(xì)胞中miR-338-3p的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究[5-6]結(jié)果顯示卵巢上皮性癌組織中miR-338-3p的表達(dá)明顯低于正常卵巢組織中的表達(dá)，本次研究中經(jīng)在線數(shù)據(jù)庫dbDEMC檢索予以證實(shí)，提示miR-338-3p可能在卵巢癌發(fā)病過程中扮演抑癌基因的作用。

有研究[14]證實(shí)，miRNAs主要通過靶向結(jié)合下游靶基因的3’R，抑制基因表達(dá)或誘導(dǎo)基因降解，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理和病理過程。為了探討miR-338-3p參與卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，本研究利用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan Human檢索顯示MACC1是miR-338-3p的下游靶基因之一，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)在卵巢癌細(xì)胞中miR-338-3p可與MACC1基因3’UTR靶向結(jié)合，Western blot結(jié)果提示在卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-338-3p后可使MACC1表達(dá)降低。上述結(jié)果提示在卵巢癌細(xì)胞中miR-338-3p可靶向結(jié)合MACC1基因的3’UTR，進(jìn)而調(diào)節(jié)MACC1的表達(dá)，該結(jié)果與胃癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、黑色素瘤和宮頸癌細(xì)胞等研究中的相關(guān)報(bào)道一致[15-19]。

為了進(jìn)一步探討miR-338-3p對MACC1表達(dá)及卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本研究分別將陰性對照病毒、miR-338-3p過表達(dá)病毒、MACC1過表達(dá)病毒及miR-338-3p過表達(dá)病毒聯(lián)合MACC1過表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染卵巢癌OVCAR-3和OVCAR-8細(xì)胞。OVCAR-3和OVCAR-8均為卵巢上皮性癌細(xì)胞株，生物學(xué)特性均為貼壁生長，均為卵巢癌細(xì)胞體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)常用細(xì)胞株，適合模擬卵巢癌體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)病理生理過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)MACC1可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而過表達(dá)miR-338-3p可明顯抑制陰性對照組和MACC1過表達(dá)組卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示miR-338-3p可能通過調(diào)節(jié)MACC1抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，Wnt3a作為Wnt蛋白的配體是經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的主要因子，而磷酸化激活的LRP6是經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號(hào)通路活化所必需的蛋白因子[20-21]。MACC1通過調(diào)節(jié)MET基因啟動(dòng)子上游約60 bp的sp1位點(diǎn)調(diào)節(jié)控制肝細(xì)胞生長因子受體Met的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)HGF-Met信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡[22]。激活的Met可直接或間接激活β-catenin，活化的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后，誘導(dǎo)其他轉(zhuǎn)錄因子和下游基因的表達(dá)，進(jìn)而參與惡性細(xì)胞增殖和侵襲等多種生物學(xué)過程[23-24]。本研究利用Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制劑IWP-2作為陽性對照，Western blot分析顯示，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MACC1可增加卵巢癌細(xì)胞中Wnt3a和p-LRP6的表達(dá)，而過表達(dá)miR-338-3p可明顯抑制陰性對照組和MACC1過表達(dá)組卵巢癌細(xì)胞中MACC1、Wnt3a和p-LRP6的表達(dá)，提示在卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)的miR-338-3p可能通過下調(diào)MACC1，從而抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin 通路活性參與卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，本研究結(jié)果顯示miR-338-3p可能通過調(diào)節(jié)MACC1和經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究探討的miR-338-3p/MACC1軸在卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，有助于完善卵巢癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，也可為阻斷卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供潛在的靶點(diǎn)。