棘皮動物神經(jīng)肽的研究進展?

陳慕雁，鄭穎秋，叢 瀟

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學), 山東 青島 266003)

1 神經(jīng)肽介紹

神經(jīng)肽作為一種化學信號，廣泛參與、調(diào)節(jié)動物的生理過程和行為。相較于其他調(diào)節(jié)因子，神經(jīng)肽的研究起步較晚，建立在20世紀生理學、內(nèi)分泌學和生物化學領(lǐng)域的開創(chuàng)性研究基礎(chǔ)之上，并基于三個開創(chuàng)性概念：(1)肽激素是內(nèi)分泌系統(tǒng)中的化學信號；(2)肽激素的神經(jīng)分泌遵循神經(jīng)系統(tǒng)運作的一般原理；(3)神經(jīng)系統(tǒng)對肽信號能做出反應(yīng)[1]。1971年，De Wied提出了“神經(jīng)肽”一詞來描述神經(jīng)活性肽激素及其片段[2]。1975年，腦啡肽的鑒定開創(chuàng)性地將激素從內(nèi)分泌學領(lǐng)域帶入到神經(jīng)科學領(lǐng)域[3]。隨著放射性配體結(jié)合測定法和分子技術(shù)的發(fā)展，受體的鑒定使得神經(jīng)肽的作用方式得以明確，神經(jīng)肽的定義也越來越明晰，即“神經(jīng)肽是由神經(jīng)元合成分泌并釋放作用于神經(jīng)底物的小蛋白質(zhì)物質(zhì)。”此后神經(jīng)肽的研究進入新階段[1]。

作為一種內(nèi)源性肽段，神經(jīng)肽在生物體內(nèi)可作為神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)質(zhì)或神經(jīng)激素，進行細胞間信號傳導，是神經(jīng)系統(tǒng)最大、最多樣化的一類信號分子。神經(jīng)肽長度不等，通常具有3～100個氨基酸[4]，例如，促甲狀腺激素釋放激素(TRH)僅具有3個氨基酸殘基[5]，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)具有41個氨基酸殘基[6]。神經(jīng)肽都具有一些共同的特征：(1)衍生自較大的前體蛋白；(2)具有靶向調(diào)節(jié)前體蛋白分泌途徑的N-末端信號肽；(3)前體蛋白具有典型的切割位點(例如，由激素原轉(zhuǎn)化酶識別的一元或二元位點)；(4)具有對生物活性至關(guān)重要的翻譯后修飾的位點(例如，C-末端甘氨酸殘基常常是酰胺化的底物，其對于成熟蛋白質(zhì)的活性至關(guān)重要)；(5)除少數(shù)例外，神經(jīng)肽通常結(jié)合并激活屬于視紫紅質(zhì)-β，視紫紅質(zhì)-γ和胰泌素secretin型受體家族的G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)來發(fā)揮作用[1]。上述特征是發(fā)掘神經(jīng)肽在生物生命活動中的功能的基礎(chǔ)，而功能探究一直是神經(jīng)肽研究的重點。

1.1 神經(jīng)肽的功能特征

人和動物的生理活動主要具有三大調(diào)節(jié)手段，即神經(jīng)調(diào)節(jié)、體液調(diào)節(jié)和自身調(diào)節(jié)。相較于體液調(diào)節(jié)緩慢持久的特點，神經(jīng)調(diào)節(jié)過程更為短暫精準。在神經(jīng)調(diào)節(jié)過程中，大量的神經(jīng)遞質(zhì)(例如，乙酰膽堿、5-羥色胺(5-HT)等)作為信息傳遞的“信使”，參與各項生命活動。神經(jīng)肽通常與氨基酸和生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)共存于神經(jīng)末梢，按需存儲和調(diào)節(jié)釋放，但只有在強烈或長期刺激后才能釋放[7]。因此，與“快速神經(jīng)遞質(zhì)”相比，例如興奮性氨基酸和生物原胺類物質(zhì)，神經(jīng)肽的細胞響應(yīng)過程通常相對緩慢持久，這種延遲一方面是由于其儲存在密集核囊泡中，這些囊泡未處于細胞釋放位點(突觸或突觸按鈕)，需要募集后再進行釋放。此外，對釋放的神經(jīng)肽響應(yīng)較慢的另一個原因是幾乎所有神經(jīng)肽都作用于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。這些受體觸發(fā)分子內(nèi)酶促事件的細胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生細胞反應(yīng)。發(fā)生這種反應(yīng)的時間跨度(秒或更長)比神經(jīng)遞質(zhì)的時間跨度要長得多，神經(jīng)遞質(zhì)直接作用于離子通道來調(diào)節(jié)離子通量(毫秒)[1]。

神經(jīng)肽衍生自較大的前體蛋白。源自同一神經(jīng)肽前體的不同神經(jīng)肽生理活性可能相同，不同甚至相反。因此，鑒定源自同一個前體產(chǎn)生的所有肽的具體生物功能非常重要。神經(jīng)肽在同一物種中可能扮演不同的角色。例如，在紅海盤車(Asteriasrubens)中，促甲狀腺激素釋放激素(TRH)型神經(jīng)肽不僅介導幼蟲的變態(tài)附著，而且還可能參與信號傳導和加工的神經(jīng)機制[8]。同時，同一種神經(jīng)肽在不同物種中也可能具有相同的功能，例如軟體動物加利福尼亞海兔(Aplysiacalifornica)、甲殼動物小龍蝦(Orconectuslimosus)及紅海盤車中的Pedal peptide(PP)/orcokinin(OK)型神經(jīng)肽(刺激肌肉)[9-11]，軟體動物靜水椎實螺(Lymnaeastagnalis)、線形動物秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)及紅海盤車中的加壓素/催產(chǎn)素型(VP / OT)神經(jīng)肽(繁殖)[12-14]以及紅海盤車和海參(Holothuriaglaberrima、Apostichopusjaponicus)中的SALMF型(肌肉松弛劑)[15-17]等。

1.2 神經(jīng)肽的作用方式

神經(jīng)肽受神經(jīng)元控制，直接通過神經(jīng)受體調(diào)節(jié)介導神經(jīng)功能[1]。它們可以直接作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)，也可以作為封閉的細胞環(huán)境中的自分泌或旁分泌調(diào)節(jié)劑，或者長距離的激素。通常，神經(jīng)肽信號系統(tǒng)通過激活相應(yīng)的GPCR調(diào)節(jié)生物學功能和行為。神經(jīng)肽作用于受體的方式有兩種，一種是直接與位于突觸后神經(jīng)元的受體結(jié)合，通過調(diào)節(jié)離子通道活性，直接影響突觸后神經(jīng)元的興奮性；另一種是通過激活位于突觸前軸突末端的受體，影響小分子神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，間接影響突觸后神經(jīng)元的興奮性[18]。關(guān)于G蛋白偶聯(lián)受體，不同的G蛋白亞基(Gα，Gβ，Gγ)具有不同的功能。通常，神經(jīng)肽與受體結(jié)合后，GPCR被激活，亞基發(fā)生構(gòu)象變化，導致Gα和Gβγ亞基功能解離，從而調(diào)節(jié)下游效應(yīng)子，例如磷脂酶，AC或離子通道[19]。這些在細胞水平的作用將分別在器官系統(tǒng)或個體水平表現(xiàn)為生理活動或行為的變化。

2 棘皮動物神經(jīng)肽功能研究的意義

神經(jīng)肽是大腦和其他周圍器官中高度多樣化的信號分子，以特定的方式影響大腦和機體活動，廣泛參與調(diào)節(jié)動物生理過程和行為。例如，對溫度波動等外部環(huán)境因子的響應(yīng)[20]，對攝食、代謝、運動、繁殖等生理過程的調(diào)節(jié)等[21-23]。因此，了解特定神經(jīng)肽如何響應(yīng)環(huán)境波動以及參與動物生理功能的調(diào)節(jié)，探明神經(jīng)肽與受體之間如何相互作用有助于在細胞和個體水平更好地理解其潛在的調(diào)控機制。

棘皮動物屬于后口無脊椎動物，全世界化石種類接近13 000種[24]，現(xiàn)存有5個綱：海膽綱、海參綱、海星綱、蛇尾綱和海百合綱，分布范圍廣泛，多營底棲生活，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用[25]。在兩側(cè)對稱動物中，棘皮動物連接起原口動物與脊索動物之間進化的“橋梁”，相較于原口動物，與脊索動物親緣關(guān)系更近，因此，棘皮動物神經(jīng)肽的功能研究將為高等動物提供更多的參考。此外，棘皮動物具有獨特的生物學特征及特殊生理現(xiàn)象。例如，成體的五輻對稱、分散的神經(jīng)系統(tǒng)、特殊的水管系統(tǒng)輔助攝食、運動和其他功能[26]。有研究表明，神經(jīng)肽可能參與介導棘皮動物中幾種特殊生物學現(xiàn)象的神經(jīng)控制，包括自溶、再生[27]及其膠原組織的可變性[28-29]，這些對于我們進一步查明棘皮動物特殊生理行為分子調(diào)控機制具有重要意義。

隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組學等測序技術(shù)的發(fā)展，棘皮動物中越來越多的神經(jīng)肽得以鑒定。自2006年紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)基因組的測序以來[26]，目前已在棘皮動物4個綱的11個物種中獲得基因組序列數(shù)據(jù)，包括海膽綱(S.purpuratus,Lytechinusvariegatus,Eucidaristribuloides)、海參綱(A.japonicus,Apostichopusparvimensis,Parastichopusparvimensis,Australostichopusmollis)、海星綱(Acanthasterplanci,Patiriaminiata,Patiriellaregularis)和海蛇尾綱(Ophiothrixspiculata,Ophionereisfasciata)，而在海百合綱中尚未有相關(guān)報道[30-34]。同時，基因組、轉(zhuǎn)錄組及多肽組的多組學聯(lián)合分析，使得來自不同家族的神經(jīng)肽前體及神經(jīng)肽在棘皮動物某些代表性物種中得以鑒定(見表1)，為探明神經(jīng)肽信號系統(tǒng)如何調(diào)節(jié)動物生理和行為過程奠定了基礎(chǔ)。棘皮動物神經(jīng)肽的功能研究不僅有利于闡明其生理機制，也將為高效綠色養(yǎng)殖提供科學的理論支撐。

3 棘皮動物神經(jīng)肽研究方法進展

大多數(shù)棘皮動物(海百合綱除外)的神經(jīng)系統(tǒng)呈彌散狀，一般包含兩個部分，即外神經(jīng)系統(tǒng)和深層神經(jīng)系統(tǒng)[44]。由于其神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的獨特性及難以定位，使得其中央神經(jīng)系統(tǒng)研究遠遠落后于其他動物，同時神經(jīng)肽的高分子量，低體內(nèi)濃度，高度結(jié)構(gòu)多樣性和大量同工型，使得棘皮動物神經(jīng)肽研究存在挑戰(zhàn)。困難和方法共存，隨著組學技術(shù)和分子生物學技術(shù)的發(fā)展，棘皮動物神經(jīng)肽研究方法取得了很大進展，主要應(yīng)用于神經(jīng)肽的結(jié)構(gòu)鑒定，時空分布特征及其生理功能探究。

表1 棘皮動物不同物種中已鑒定的神經(jīng)肽及其前體數(shù)目

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定研究方法

神經(jīng)肽結(jié)構(gòu)鑒定是神經(jīng)肽研究的基礎(chǔ)，包括氨基酸序列、翻譯后修飾(PTM)、折疊模式、結(jié)合位點等，這些信息有助于進一步闡明其功能和生物學機制。目前，質(zhì)譜法(Mass spectrum, MS)是肽測序和確定神經(jīng)肽PTM的普遍方法，隨著組學的發(fā)展，質(zhì)譜法對低濃度肽檢測的靈敏度不斷提高，這使得“神經(jīng)肽組”的鑒定成為可能，同時質(zhì)譜法也存在一些缺陷，例如片段讀長一般為7～23個氨基酸，對于低于7個氨基酸的多肽尚無法檢測[45]。

根據(jù)不同的肽段或組織特性，序列結(jié)構(gòu)測定方法也隨之調(diào)整。質(zhì)譜在鑒定神經(jīng)肽序列結(jié)構(gòu)時通常與其他手段聯(lián)用。例如，基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MatriX assisted laser desorption ionization mass spectrometry, MALDI-MS)、電噴霧二級質(zhì)譜(Electrospray ionization ion trap mass spectrometry, ESI-MS/MS)、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)等分別成功地在佛羅里達弓背蟻(Camponotusfloridanus)、瓢蟲科(Coccinellidae)和葬甲科(Silphidae)部分甲蟲及多棘龍蝦(Panulirusinterruptus)的神經(jīng)肽鑒定中得到應(yīng)用[46-49]。其中，和ESI相比，MALDI對有較大分子量、更強疏水性和更低等電點的肽的檢測能力更強，傳輸效率較高，但ESI離子化效率更高。液相色譜(LC)與氣相色譜(GC)相比，氣相色譜具有分離效率和檢測靈敏度都更高的特點，而液相色譜分析范圍廣，對于難分離混合物的分析具有很高的準確性，串聯(lián)質(zhì)譜則可以更好地分離分析樣品。相較于一級質(zhì)譜，二級質(zhì)譜能夠得到部分短肽的序列，具有更高的可靠性，且價格差距越來越小，是蛋白鑒定的大趨勢[50]。作為一種互補分離技術(shù)，離子遷移譜(Ion mobility spectroscopy, IMS)技術(shù)發(fā)展迅速，與MS結(jié)合使用后對肽結(jié)構(gòu)的研究更加全面[51]。在進行神經(jīng)肽鑒定時，可以參考親緣關(guān)系最近的模式生物或自身物種已有數(shù)據(jù)庫進行比對，此外，還可以利用de-novo測序等方法發(fā)掘新的神經(jīng)肽[52]。近年來，已有研究者利用UPLC-MS/MS、nano LC-ESI-MS/MS等技術(shù)在棘皮動物的紫海膽、紅海盤車、棘冠海星、刺參和黑海參(Holothurialeucospilota)等物種中成功鑒定PP/OK、VP/OT、NPS/CCAP/NG等多個神經(jīng)肽家族成員[23, 36-37, 40, 42, 53-54]。

富含二硫鍵神經(jīng)肽的鑒定一直是神經(jīng)肽鑒定的一大難題，核磁共振作為表征肽的構(gòu)象和折疊模式的關(guān)鍵技術(shù)，可通過和質(zhì)譜聯(lián)用快速鑒定微量肽樣品和表征二硫鍵[55]。結(jié)構(gòu)特征對于神經(jīng)肽與其受體之間的相互作用十分重要，通過核磁共振技術(shù)可以確定神經(jīng)肽與受體位點的關(guān)系，評估與神經(jīng)肽受體結(jié)合的激動劑和拮抗劑結(jié)構(gòu)，從而確定其構(gòu)象[56- 57]。在棘皮動物中，通過核磁共振與質(zhì)譜聯(lián)用，成功在紅海盤車中鑒定到富含二硫鍵的VP/OT型神經(jīng)肽[23]。

光譜是表征神經(jīng)肽結(jié)構(gòu)的另一手段。紅外(Infrared Spectroscopy, IR)光譜已成功用于二級結(jié)構(gòu)元素的定量估算，包括α-螺旋，β-折疊和轉(zhuǎn)角[58]。 圓二色光譜(Circular Dichroism, CD)可用于二級結(jié)構(gòu)的快速測定[59]。X射線晶體可表征神經(jīng)肽與其受體在空間的結(jié)合特征，目前已在神經(jīng)肽S和人OX2受體晶體結(jié)構(gòu)的研究中得到應(yīng)用[60]。

3.2 神經(jīng)肽及其前體定位特征研究方法

組織中的神經(jīng)肽定位可用于功能預(yù)測，為進一步功能鑒定提供基礎(chǔ)。神經(jīng)肽及其前體的定位分析通常包括兩個層面：mRNA水平和蛋白水平。

在mRNA水平，主要通過原位雜交技術(shù)(In situ hybridization, ISH)，合成靶神經(jīng)肽的探針，基于堿基互補配對原則，實現(xiàn)對神經(jīng)肽前體的組織定位，而對于胚胎細胞、棘皮動物早期幼體等，一般采用整胚原位雜交(Whole mount in situ hybridization)。此外，通過熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)可以實現(xiàn)同時對多個物種中的多靶RNA進行高靈敏度檢測[61]。探針的標記方法包括放射性和非放射性兩種，普遍采用的標記方法是地高辛標記，具有靈敏度高、特異性強、檢測方便等優(yōu)點，目前該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于棘皮動物的神經(jīng)肽前體mRNA定位[8, 62-63]。然而，在檢測低水平或單拷貝轉(zhuǎn)錄本時，豐度過低可能會造成假陰性，且RNA極易降解，對于神經(jīng)肽前體的鑒定也造成了一定的困難。在某些模式生物中，例如黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)和秀麗隱桿線蟲，由于繁殖速度快，較易實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因，可以建立啟動子報告基因代替ISH在mRNA水平進行定位，檢測更加便捷[64-66]，但目前此法尚未應(yīng)用于棘皮動物。

神經(jīng)肽的蛋白定位，主要利用抗原抗體結(jié)合的原理，在合成靶神經(jīng)肽的抗體后，通過應(yīng)用放射免疫測定(Radioimmunoassay, RIA)、免疫組織化學(Immunohistochemistry, IHC)、免疫細胞化學(Immunocytochemistry, ICC)、免疫熒光(Immunofluorescence, IF)和免疫電子顯微鏡技術(shù)實現(xiàn)細胞、組織和整個生物體水平神經(jīng)肽的可視化。與傳統(tǒng)組織學方法相比，這些技術(shù)通過抗體的使用提高了反應(yīng)的特異性和敏感性。然而，由于許多無脊椎動物神經(jīng)肽基因編碼一種以上的生物活性肽，彼此之間具有很高的結(jié)構(gòu)相似性，容易導致抗體交叉反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性，而N端定向抗血清可以輕松區(qū)分具有高度相似C端基序的肽，幫助克服交叉反應(yīng)問題[67]。

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，ISH與ICC/IHC聯(lián)合使用，可以實現(xiàn)對靶神經(jīng)肽及其前體的共同定位。同時通過合成多個靶探針，或者多個靶神經(jīng)肽的抗體，利用不同的顯色標記，實現(xiàn)多個靶神經(jīng)肽及其前體的同時檢測[67]。例如，利用雙重IF染色實現(xiàn)了對紅海盤車VP/OT型神經(jīng)肽及其受體的共定位[23]；通過多重ISH，并結(jié)合IHC，可比較分析紫海膽長腕幼蟲階段9個神經(jīng)肽及其前體的表達模式[62]。

3.3 神經(jīng)肽及其前體定量分析技術(shù)研究

神經(jīng)肽的定量通常是研究生理功能的第一步。在無法確定哪些神經(jīng)肽參與生命活動調(diào)節(jié)時，通常通過改變外界因素(例如環(huán)境)，采集特定組織以定量比較，或者從動物中取出組織，在不同條件下孵育，觀察產(chǎn)生的影響。目前普遍采用免疫蛋白印跡法(Western blot)對單個蛋白質(zhì)進行半定量分析。然而，由于神經(jīng)肽通常分子量較小，難以檢測，因此此法通常用于評估神經(jīng)肽相關(guān)蛋白，神經(jīng)肽前體蛋白或神經(jīng)肽受體的表達變化，例如海星Asterinapectinifera性腺刺激物質(zhì)GSS相關(guān)的G蛋白(Gαs, Gαi, Gβ)的定量分析[68]。此外，還可以通過酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法來進行定量分析，但是檢測結(jié)果易受其他因素干擾，準確性較低。MS同樣可以應(yīng)用于整體神經(jīng)肽的定量表達模式分析，例如鹽度或溫度變化對甲殼動物北黃道蟹(Cancerborealis)、岸蟹(Carcinusmaenas)等神經(jīng)肽表達水平造成的影響[20, 69]。

實時定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù)通常用于實現(xiàn)神經(jīng)肽前體轉(zhuǎn)錄水平的定量分析，綜合分析神經(jīng)肽及其前體的表達特征。盡管更多的mRNA通常意味著基因表達增強，但蛋白質(zhì)表達水平并不總是與mRNA呈正相關(guān)，因而mRNA水平和蛋白水平的綜合分析依然是目前神經(jīng)肽定量研究中的最佳策略。在棘皮動物中，已通過ELISA及qRT-PCR技術(shù)分別對海星(Patririapectinifera，Asterinapectinifera)中的性腺刺激物質(zhì)GSS和Patiriella屬不同發(fā)育階段的Engrailed前體等進行了定量分析[70-71]。

3.4 神經(jīng)肽功能測定研究方法

神經(jīng)肽在不同組織中可能具有完全不同的功能，即使來自同一家族不同的神經(jīng)肽同工型，在同一組織也可能產(chǎn)生截然不同的效果。功能研究主要涉及宏觀(例如行為)和微觀(例如信號傳導途徑)兩個層面。在宏觀功能研究中，主要從在體和離體兩個維度來進行。通過劑量依賴性測試獲得神經(jīng)肽作用的最適濃度后，在在體或離體水平注射，觀察神經(jīng)肽對組織或者個體造成的影響。在棘皮動物中，該方法集中應(yīng)用于對肌肉剛度、行為及繁殖的影響，例如，在體或離體注射神經(jīng)肽結(jié)合電生理學的方法研究紅海盤車的PPLN1b、Luqin、VP/OT型等神經(jīng)肽在肌肉剛度、賁門胃外翻中的功能；在體及離體研究糙海參(Holothuriascabra) TRH/GnRH、刺參NGIWY等神經(jīng)肽對繁殖的誘導作用等[23,53,63,72-73]。在此過程，電生理學方法被廣泛應(yīng)用，將距離、剛度等物理信號轉(zhuǎn)化為電信號是進行功能研究的有效手段，但結(jié)果容易受到個體差異的影響，因此實驗對于樣本的數(shù)量及重復(fù)次數(shù)有一定的要求。研究發(fā)現(xiàn)電生理學與其他光學成像技術(shù)相結(jié)合，可定位神經(jīng)信號，因此將經(jīng)典電生理學的時間分辨率和光學成像的空間分辨率相結(jié)合，將有助于神經(jīng)科學領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)重大發(fā)現(xiàn)，也是未來研究探索的方向之一。

在微觀層面，通常利用干擾神經(jīng)肽前體基因的轉(zhuǎn)錄或表達過程對神經(jīng)肽及其前體的功能進行研究。基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9因使用便捷和較高的效率而廣受歡迎，脫靶現(xiàn)象是目前該技術(shù)亟待攻克的難點，而且需要成熟的細胞培養(yǎng)技術(shù)。在棘皮動物中，基因編輯技術(shù)僅在模式生物海膽中成功應(yīng)用，主要用于查明海膽胚胎發(fā)育、攝食習性、體色變化等生理過程中信號傳導通路[74-77]。對于非模式物種，siRNA(Small interfering RNA)技術(shù)是CRISPR / Cas9的有效替代方法，siRNA是干擾基因表達的短鏈RNA分子，通過復(fù)雜的遞送方法(例如轉(zhuǎn)染)，或者注射入生物體，可以誘導基因沉默，干擾神經(jīng)肽的表達。該方法操作相對簡單，但也存在很多問題，例如siRNA在生物體內(nèi)易被降解，抑制的效果不確定性等，而且siRNA只是抑制基因的表達，未完全阻止其發(fā)揮作用，對于神經(jīng)肽“高效”的作用特點，使得研究結(jié)果可能存在偏差。在棘皮動物中，已有研究者通過siRNA技術(shù)發(fā)現(xiàn)特定基因及蛋白在蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotusintermedius)脂肪酸代謝、刺參免疫防御等方面的潛在作用[78-79]。

4 參與調(diào)節(jié)棘皮動物生理功能的神經(jīng)肽

神經(jīng)肽及其關(guān)聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體的系統(tǒng)發(fā)育分布的研究表明，至少有三十個神經(jīng)肽信號系統(tǒng)的進化起源可以追溯到兩側(cè)對稱動物的共同祖先[80-81]。與其他被充分表征的模式無脊椎動物相比，如黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲和軟體動物加利福尼亞海兔，棘皮動物神經(jīng)肽信號傳導系統(tǒng)的研究仍處于起步階段。隨著神經(jīng)肽功能研究技術(shù)的不斷革新，越來越多的研究表明神經(jīng)肽可能參與介導棘皮動物特殊生理現(xiàn)象的調(diào)控，包括組織的剛度變化、個體發(fā)育及繁殖過程[8, 29, 63, 82]等。

4.1 調(diào)控肌肉剛度的神經(jīng)肽研究進展

棘皮動物具有“可變的結(jié)締組織”，使肌肉剛度迅速變化。目前尚不清楚結(jié)締組織可變性潛在的分子和細胞機制，但有證據(jù)表明神經(jīng)肽介導了棘皮動物結(jié)締組織剛度的神經(jīng)控制[28]。不同的神經(jīng)肽家族對于肌肉剛度的影響存在差異。

1991年，García-Arrarás等通過藥理學實驗發(fā)現(xiàn)CCK型神經(jīng)肽可誘導海參(Holothuriamexicana)腸道肌肉松弛，由此開啟了神經(jīng)肽對棘皮動物肌肉剛度影響的研究[83]。隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，Calcitonin(CT)型、Luqin/RYamide型及stichopin等神經(jīng)肽在不同物種的組織中都表現(xiàn)出對肌肉剛度的調(diào)控能力。例如，CT型神經(jīng)肽對海星(A.rubens和Patiriapectinifera)頂端肌肉和管足的松弛、Luqin型神經(jīng)肽對紅海盤車管足的松弛及holokinin 1、holokinin 2和stichopin對刺參體壁結(jié)締組織的收縮作用等[73, 84-85]。此外，Elphick等對刺參體壁中分離出的二十種肽序列基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫重新進行了比對分析，推測GN-19、GLRFA、SWYG型、KIamide-9等神經(jīng)肽在縱肌或腸道中起到收縮/舒張的作用[29]。

賁門胃外翻是海星攝食時的特殊行為，這一行為同樣與肌肉剛度變化密切相關(guān)。體外藥理學實驗證明，PP/OK型神經(jīng)肽可以引起海星P.pectinifera(頂端肌肉、管足、賁門胃)、A.rubens(賁門胃)和Asteriasamurensis(頂端肌肉)組織松弛，與原口動物PP/OK型神經(jīng)肽對肌肉的收縮作用形成對比[10, 86]，表明后口動物和原口動物的分化過程可能伴隨著PP/ OK型神經(jīng)肽作為肌肉活動調(diào)節(jié)因子的抑制-興奮性的轉(zhuǎn)變[53]。GnRH和CRZ型肽均可引起紅海盤車賁門胃、頂端肌肉和管足的收縮[87]，但兩種神經(jīng)肽的誘導作用似乎具有組織偏好性，例如，GnRH對賁門胃的收縮誘導比CRZ更有效，而在頂端肌肉組織中，CRZ效力更強[82]，這種偏好性的分子機理有待進一步研究。

4.2 調(diào)節(jié)繁殖行為的神經(jīng)肽研究進展

許多棘皮動物物種具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，如海膽、海參等。近年來，野生種群被過度捕撈，種群數(shù)量迅速下降，人工育種已成為種群增殖的有效途徑。然而，水產(chǎn)養(yǎng)殖中物種增殖和繁殖面臨巨大挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)誘導產(chǎn)卵的方法，如熱刺激等，對親體損害程度較大，具有很多的缺陷。生殖相關(guān)神經(jīng)肽為我們提供了新的研究視角。

海星Asteriasforbesi的橈神經(jīng)提取物注入該物種后會誘發(fā)配子脫落，這是有關(guān)無脊椎動物的促性腺激素物質(zhì)的首個報道[88]，這種活性物質(zhì)被稱為性腺刺激物質(zhì)(GSS)，并在生化上被描述為肽激素[89]。Cochran和Engelmann從海膽橈神經(jīng)中分離出一種5.6 kDa的熱穩(wěn)定多肽——RNF，可誘導雄性和雌性紫海膽產(chǎn)卵排精[90-91]。同樣有研究發(fā)現(xiàn)海參的橈神經(jīng)粗提物(RNE)和從海膽(e.g.,Echinometramathaei,Stomopneustesvariolaris,Paracentrotuslividus)的卵子提取物中富集的MIF(成熟誘導因子)可以刺激眾多海參物種(H.leucospilota，Holothuriapervicax,Holothuriamoebi,Holothuriapardalis,A.japonicus,H.scabra)卵母細胞的成熟[92-94]，但橈神經(jīng)提取物的具體成分尚未確定。直到2009年，在海星P.pectini-fera中鑒定出一種蛋白，屬于松弛素型(Relaxin)肽家族，GSS由此被命名為松弛素樣性腺刺激肽(Relaxin-like gonad-stimulating)或RGP[95]。目前，幾種神經(jīng)肽被驗證具有刺激卵母細胞成熟的功能，包括GSS、RGP、cubifrin(NGIWYamide, NGLWYamide)和QGLFSGVamide。

在海星[89, 96-97]和海參[93, 98]中，卵母細胞的成熟可由GSS直接刺激。例如，GSS誘導的紅海盤車卵母細胞成熟和產(chǎn)卵[96]，而SALMFamide型神經(jīng)肽可以抑制A.pectinifera性腺刺激物質(zhì)GSS的釋放[97]。源自A.rubens和P.pectinifera的RGP均可誘導紅海盤車卵巢片段中卵母細胞的成熟和排卵，但AruRGP比PpeRGP效力更強[96]。在另一海星物種——棘冠海星中，體外重組的RGP能夠有效誘導卵母細胞成熟和排卵，由于未成熟的性腺缺乏具有活性的Gαs，RGP僅對處于成熟末期(卵母細胞直徑> 150 μm)的卵母細胞的性腺有效[99]。

Cubifrin-I(NGIWYamide)及衍生物 Cubifrin-L(NGLWYamide)可在體外誘導刺參卵母細胞成熟，促進產(chǎn)卵過程[72, 100-101]。但該肽并非是所有海參物種卵母細胞成熟的“通用誘導劑”，在黑海參中則未發(fā)現(xiàn)其誘導作用[102]。最近的研究顯示卵巢壁對于GVBD和卵母細胞成熟十分必要[72]。QGLFSGVamide在濃度大于1 μmol/L時可以誘導刺參生發(fā)泡破裂，然而，由于該肽的效力低，因此不建議將該肽作為卵母細胞成熟的主要調(diào)節(jié)劑[72]。Chaiyamoon等向糙海參注射短的TRH/GnRH樣肽，同樣可顯著加速性腺發(fā)育，并刺激配子發(fā)生[63]。

值得注意的是，有些神經(jīng)肽雖然尚未在棘皮動物中進行表征，但已在其他動物中被證明可以調(diào)控兩側(cè)對稱動物繁殖進程，例如，Kisspeptin型、GnRH/CRZ型神經(jīng)肽，這將是未來神經(jīng)肽參與棘皮動物繁殖調(diào)控研究的重點。

4.3 參與生長過程的(攝食、變態(tài)前附著)神經(jīng)肽研究進展

動物的生長特征是科學投喂、敵害生物防治、高效養(yǎng)殖過程中十分重要的參考依據(jù)，易受遺傳、環(huán)境等多種因素的影響。目前關(guān)于棘皮動物生長過程的神經(jīng)調(diào)節(jié)機制研究尚少。研究表明海膽中insulin(IL)-relaxin家族成員SpILP1和SpILP2(Insulin-like peptide)，可能參與攝食行為的調(diào)控，其中SpILP1 神經(jīng)肽及其前體蛋白的表達與投喂方式密切相關(guān)[103]。此外，對促甲狀腺素釋放激素(Thyrotropin-releasing hormone, TRH)及促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin-releasing hormone, CRH)型神經(jīng)肽前體在紅海盤車幼蟲體內(nèi)定位的研究揭示了TRH及CRH在海星變態(tài)前附著過程中具有潛在作用[8]。

4.4 同時調(diào)控多種生理進程的神經(jīng)肽研究進展

神經(jīng)肽作為生物體內(nèi)最大、最多樣化的一類信息分子，通常一種神經(jīng)肽可同時調(diào)控多種生理進程。

作為棘皮動物中研究最為充分的神經(jīng)肽之一，SALMFamide神經(jīng)肽不僅可以誘導紅海盤車、黑海參和刺參多種組織(管足、肌肉、腸道)的松弛[15-17]，還可以誘導海星賁門胃的外翻，參與攝食調(diào)節(jié)[16-17]，并能夠抑制Asterinapectinifera性腺刺激物質(zhì)GSS的釋放[97]。

兩側(cè)對稱動物進化過程中高度保守的VP/OT型神經(jīng)肽除去可以引發(fā)棘皮動物海星(A.rubens)賁門胃、頂端肌肉及海膽(S.purpuratus)管足、食道和肌肉組織的劑量依賴性收縮[23, 104]，該神經(jīng)肽還參與了棘皮動物的攝食行為的調(diào)節(jié)。此外，通過對VP/OT型神經(jīng)肽前體的原位雜交定位，發(fā)現(xiàn)其在紅海盤車幼蟲的變態(tài)前附著過程具有潛在作用[8]。

NG/NPS/CCAP型神經(jīng)肽家族在棘皮動物中主要表現(xiàn)為NG肽。NG肽家族的成員會引起棘皮動物的肌肉、觸手、管足、食管、腸道等組織的收縮(例如海膽Echinusesculentus和紅海盤車 NGFFFamide、刺參 NGIWYamide)[54, 104-106]。此外，NGFFYamide還可以影響紅海盤車幼蟲口周圍的纖毛擺動，降低運動能力[8, 54]。

4.5 棘皮動物神經(jīng)肽受體的研究進展

神經(jīng)肽主要結(jié)合并激活G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)來發(fā)揮作用，GPCR包括六個家族，大多數(shù)肽受體屬于視紫紅質(zhì)rhodopsin或促胰液素secretin家族[107]。相較于脊椎動物，棘皮動物中神經(jīng)肽受體的研究起步較晚。近年來，隨著組學的發(fā)展，棘皮動物基因組、轉(zhuǎn)錄組及多肽組序列數(shù)據(jù)相繼發(fā)表，為神經(jīng)肽受體的鑒定提供了可能。目前，在紫海膽、紅海盤車、海星和刺參等物種中分別鑒定到多個GPCR(見表 2)，其中，在紫海膽中最多，為44種。當前在紅海盤車中已鑒定到與VP/OT型、NGFFF型、Luqin型以及Short Neuropeptide F/Prolactin-releasing peptide(sNPF/PrRP)等神經(jīng)肽的受體，并發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)肽結(jié)合后在肌肉剛度、攝食、運動等行為中發(fā)揮重要作用[23, 54]，sNPF/PrRP神經(jīng)肽受體的發(fā)掘?qū)⒃趧游飐NPF和脊椎動物PrRP連接起來，重建了PrRP/sNPF型神經(jīng)肽進化歷史[108]。在刺參中，同樣確認了Kisspeptin受體在介導Kisspeptin型神經(jīng)肽參與刺參的代謝和生殖過程中的關(guān)鍵作用[109]。

表2 棘皮動物神經(jīng)肽受體

5 同一神經(jīng)肽在不同棘皮動物物種中的功能比較

肽類物質(zhì)作為細胞間信號分子(神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)節(jié)劑或神經(jīng)激素)釋放，是神經(jīng)元進化的古老特性。不同物種中同一神經(jīng)肽的GPCR種類、數(shù)量等差異可能會對神經(jīng)肽的功能或效力產(chǎn)生直接影響，因此同一神經(jīng)肽在不同棘皮動物中的功能比較有助于更深刻地理解神經(jīng)肽的作用機制。

VP/OT型神經(jīng)肽家族在兩側(cè)對稱動物中十分保守，可以調(diào)節(jié)多種功能。在棘皮動物中，通過體外藥理學研究，發(fā)現(xiàn)VP/OT型神經(jīng)肽可誘導紅海盤車賁門胃、頂端肌肉的松弛，這與海膽E.esculentusVP/OT型神經(jīng)肽促進管足和食道的肌肉收縮作用相反[14, 104, 115]。NG型神經(jīng)肽NGIWYamide及其衍生物NGLWYamide可在體外誘導刺參卵母細胞成熟，而在黑海參中未發(fā)現(xiàn)誘導作用[72, 100-102]。PP/OK型神經(jīng)肽在后口和原口動物間表現(xiàn)出功能的分化[53]。PPLN神經(jīng)肽在棘皮動物中可以引起多種海星物種(P.pectinifera、A.rubens、Asteriasamurensis)的肌肉組織松弛，與其在原口動物中的肌肉收縮作用形成對比[10, 86]。

隨著神經(jīng)肽功能表征的不斷豐富和補充，神經(jīng)肽在生理調(diào)節(jié)過程中表現(xiàn)出的“物種特異性”可能會擴展到更多的神經(jīng)肽家族，那時，對于產(chǎn)生這種差異的內(nèi)在機制將初見端倪，為進一步了解神經(jīng)肽如何調(diào)節(jié)生物體生命活動提供更全面的詮釋。

6 研究展望

過去的十年，神經(jīng)肽領(lǐng)域取得了快速的發(fā)展，神經(jīng)肽對動物生理、行為的調(diào)控一直是研究的重點和熱點?；蚪M、轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)的不斷豐富促進了棘皮動物神經(jīng)肽信號系統(tǒng)的功能表征[26, 34]。系統(tǒng)發(fā)育分析揭示至少30個神經(jīng)肽信號系統(tǒng)的進化起源可以追溯到兩側(cè)對稱動物的共同祖先[81]，對于從功能保守性的角度揭示神經(jīng)肽家族的生理作用大有裨益。眾多神經(jīng)肽信號分子的表征為棘皮動物的生殖、攝食及運動等生理過程的調(diào)控機制提供了全新的視角，尤其為極具營養(yǎng)價值的海洋經(jīng)濟物種(紫海膽、刺參等)的健康養(yǎng)殖開辟了更加高效、綠色的途徑[11, 101]；然而在兩側(cè)對稱動物中，相較于某些神經(jīng)肽被充分表征的生物(如加利福尼亞海兔、秀麗隱桿線蟲等)，棘皮動物神經(jīng)肽研究仍然起步較晚，進展緩慢。因此，部分重要神經(jīng)肽功能的鑒定和受體家族的發(fā)掘，包括在棘皮動物中已被鑒定，并在其他生物中驗證具有重要或者特殊調(diào)控功能的神經(jīng)肽以及棘皮動物中特有的神經(jīng)肽，將是未來棘皮動物神經(jīng)肽研究的重點。

6.1 KPP型神經(jīng)肽(Kisspeptin-type neuropeptide)

2001年孤兒受體GPR54的內(nèi)源性配體被鑒定，其衍生自轉(zhuǎn)移抑制蛋白KiSS-1，具有C端RFamide基序，被稱為Kisspeptin[116]。棘皮動物紫海膽、紅海盤車、刺參與脊椎動物斑馬魚(Daniorerio)、海七鰓鰻(Petromyzonmarinus)、智人(Homosapiens)等物種的Kisspeptin型神經(jīng)肽都具有預(yù)測的C末端LxF-NH2基序，而這一特征在半索動物囊舌蟲(Saccoglossuskowalevskii)與頭索動物文昌魚(Branchiostomafloridae)中丟失，而在所有物種中C末端都發(fā)生了酰胺化，對該肽的生物活性十分關(guān)鍵[117-118]。kisspeptin信號系統(tǒng)生理作用的研究表明，其在調(diào)節(jié)哺乳動物(如綿羊、豬、大鼠等)的生殖過程和魚類(如青鳉(Oryziaslatipes) 、軍曹魚(Rachycentroncanadum)等)早期發(fā)育中具有古老的作用，主要表現(xiàn)為對性腺發(fā)育的促進作用、神經(jīng)肽及受體突變導致的性腺功能減退等方面[119-124]。同時還發(fā)現(xiàn)Kisspeptin是HPG軸重要物質(zhì)GnRH分泌的有效刺激物[117]。例如斑馬魚(Daniorerio)tachykinins家族成員可以與Kisspeptin相互作用以控制GnRH的釋放，從而調(diào)節(jié)繁殖過程，但這種相互作用的內(nèi)在機制仍然未知[121]。此外，Kisspeptin可以受胰高血糖素的調(diào)控從而抑制胰島素的分泌[125]。Yap等研究發(fā)現(xiàn)kisspeptin和生物的晝夜節(jié)律有明確的聯(lián)系[126]，從而暗示該神經(jīng)肽可能參與能量平衡和代謝過程。目前該神經(jīng)肽已在棘皮動物的紫海膽、紅海盤車、刺參及三個海蛇尾物種(Ophionotusvictoriae、Amphiurafiliformis、Ophiopsilaaranea)中得以鑒定[35,37-38,41,43]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在海參物種——刺參A.japonicus中Kisspeptin型神經(jīng)肽可參與刺參的代謝和生殖過程[109]。作為多種生理角色的調(diào)節(jié)者，Kisspeptin在棘皮動物中的功能表征令人期待。

6.2 PDF型神經(jīng)肽(Pigment-dispersing factor-type neuropeptide)

PDF型神經(jīng)肽首先在甲殼動物北極甜蝦(Pandalusborealis)中被發(fā)現(xiàn)[127]。在目前已被鑒定的棘皮動物中，PDF型神經(jīng)肽具有兩種亞型，其中紅海盤車、刺參中只有一個亞型C末端發(fā)生了酰胺化，紫海膽中兩個亞型C末端均具有該現(xiàn)象，當前這兩種神經(jīng)肽的活性及功能差異還不明晰[37, 41, 80]。值得注意的是，目前僅在刺參A.japonicus中發(fā)現(xiàn)PDF型神經(jīng)肽衍生自兩個神經(jīng)肽前體，且其mRNA具有可變剪切現(xiàn)象，而剪切位點位于非活性片段中[37]。因此，關(guān)于刺參中兩種PDF型前體同工型發(fā)生的功能意義及特殊的可變剪切模式對于深入理解神經(jīng)肽結(jié)構(gòu)進化意義匪淺。與之相對應(yīng)，在所有非棘皮動物中，例如秀麗隱桿線蟲(C.elegans)、霸王蓮花青螺(Lottiagigantea)、環(huán)節(jié)動物海蠕蟲(Capitellateleta)、黑腹果蠅(D.melanogaster)及水熊蟲(Hypsibiusdujardini)等，通常僅具有一種PDF型神經(jīng)肽，并且C末端均發(fā)生了酰胺化修飾[128-131]。

PDF型神經(jīng)肽已在眾多節(jié)肢動物和其他原口無脊椎動物(包括線型動物和冠輪動物)中得到了表征[127-132]。PDF型肽在原口動物中具有多種生理功能，包括調(diào)節(jié)色素遷移，運動的晝夜節(jié)律，產(chǎn)卵和攝食行為[127-129, 132]。棘皮動物中PDF型神經(jīng)肽已在紫海膽、紅海盤車、刺參及三個海蛇尾物種(O.victoriae、A.filiformis、O.aranea)中被鑒定，但其生理作用尚未在棘皮動物中報道[35, 37-43]。

另有一些神經(jīng)肽，例如SALMFamide型神經(jīng)肽，目前僅在棘皮動物中被鑒定，這類物種或者門類特異性以及在序列上與其他物種具有較大差異的神經(jīng)肽，是否會由序列特異性體現(xiàn)為個體功能或行為的特異性，將為棘皮動物生理調(diào)控機制帶來重大見解?；谫|(zhì)譜和生物信息學鑒定的某些神經(jīng)肽，在棘皮動物中序列十分保守，例如np8、np9、np11、np15、np17、np18、np20、np21、np23和np25，已在多種棘皮動物物種中被發(fā)現(xiàn)，但目前尚未在任何物種中進行功能表征[35,37,38-43]。如何通過功能鑒定和受體發(fā)掘來建立更好的系統(tǒng)發(fā)育體系使之與現(xiàn)有神經(jīng)肽家族建立聯(lián)系，是深入理解兩側(cè)對稱動物神經(jīng)肽信號系統(tǒng)的進化歷程亟待解決的關(guān)鍵問題，將為兩側(cè)對稱動物神經(jīng)肽生理行為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要的節(jié)點。在后基因組時代，棘皮動物特殊的進化地位、成體的五輻對稱、膠原組織的可變性及特殊生理現(xiàn)象也將為兩側(cè)對稱動物神經(jīng)肽功能調(diào)控版圖提供獨特視角。