海菜花種植水對2種沉水植物抗逆性的影響

楊棟林 方軼男 潘巍 侯叢林 吳荻 廖文雪

摘要?海菜花（Ottelia acuminata）作為國家Ⅱ級保護植物，是一種既可觀賞又可食用的植物。就海菜花生長過程中產(chǎn)生的次生物質(zhì)，以種植水的形式對2種沉水植物（菹草和密刺苦草）的生長過程產(chǎn)生的影響進行研究。結(jié)果表明，密刺苦草在不同濃度的海菜花種植水中過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性明顯下降，丙二醛（MDA）含量下降，總?cè)~綠素濃度亦有明顯的下降，說明密刺苦草對于海菜花種植水中的化感物質(zhì)表現(xiàn)出明顯抗性，海菜花對于密刺苦草的生長起抑制作用。菹草SOD活性出現(xiàn)了明顯下降，MDA含量呈先下降后上升的趨勢，葉綠素濃度亦是先下降后上升，但是最初呈現(xiàn)的下降趨勢均不明顯。說明海菜花的化感作用對于密刺苦草比菹草的敏感，密刺苦草更容易受到海菜花化感物質(zhì)的影響。

關(guān)鍵詞?海菜花;種植水;沉水植物;抗逆性;影響

中圖分類號?Q945?文獻標識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）01-0066-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.017

Abstract?As a secondary protected plant in China， Ottelia acuminata is an ornamental and edible plant. In this paper，the secondary substances produced during the growth of sea cauliflower were used to study the effects of planting water on the growth of two submerged plants （Vallisneria natans and Potamogeton crispus）. The results showed that the peroxidase （POD） activity， the superoxide dismutase （SOD） activity and the malondialdehyde （MDA） content in different concentrations of sea cauliflower planting water significantly decreased，the chlorophyll concentration also decreased significantly， which indicated that Vallisneria natans showed obvious resistance to allelochemicals in Ottelia acuminatea planting water， and Ottelia acuminata inhibited the growth of Vallisneria natans.The SOD activity of Potamogeton crispus showed a significant decline， the MDA content showed first decline and then upward trend， and the chlorophyll concentration also first declined and then increased， but the initial downward trend was not very obvious.It showed that the allelopathic effect of Ottelia acuminata was more sensitive to Vallisneria natans than Potamogeton crispus， which was more susceptible to the allelopathy of Ottelia acuminatea.

Key words?Ottelia acuminata;Planting water;Sediment plants;Resistance;Effect

海菜花（Ottelia acuminata），隸屬水鱉科（Hydrocharitaceae）水車前屬（Ottelia Pers.），一年生或多年生淡水湖泊特有的沉水植物[1]，既可作為觀賞景觀植物，又可作為人與一些水生動物的食物[2]，對環(huán)境要求較高，尤其是對水體污染較為敏感[3-4]，可作為水體環(huán)境指標性植物，是非常有研究價值的國家Ⅱ級保護植物[5]。

水生生態(tài)系統(tǒng)相對于陸生生態(tài)系統(tǒng)來說，表現(xiàn)得更為復(fù)雜，沉水植物的化感作用實驗室驗證和研究均較難開展試驗，所以一直沒有得到相應(yīng)的重視。而近2年來我國水體污染較為嚴重，沉水植物作為湖泊主要生產(chǎn)者，對于調(diào)節(jié)湖泊生態(tài)平衡有著重要影響[6-7]。但近年來人們大多傾向于沉水植物對藻類植物的影響進行研究，而對沉水植物之間的相互關(guān)系相關(guān)的研究較少，筆者以2種沉水植物密刺苦草（Vallisneria natans）和菹草（Potamogeton crispus）為研究對象，對沉水植物之間的相互關(guān)系進行研究，對湖泊恢復(fù)建設(shè)中使用的復(fù)合恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)沉水植物間的搭配進行探討。

1?材料與方法

1.1?材料

該研究所使用的海菜花（Ottelia acuminata）、密刺苦草（Vallisneria natans）和菹草（Potamogeton crispus）均采集于廣西桂林市永?？h百壽鎮(zhèn)。選取生長健壯，根、莖、葉完好的植株用冰桶帶回實驗室，經(jīng)自來水清洗干凈，用蒸餾水進行預(yù)培養(yǎng)。

1.2?方法

1.2.1?種植水的制備。

將一定鮮重的海菜花茁壯植株種植于裝有5 L蒸餾水的大燒杯內(nèi)，在溫度為25 ℃、光暗時間比14 h∶10 h，光強4 000 lx的條件下培養(yǎng)7 d，取3 L種植水用0.45 μm的微孔濾膜過濾，并高溫滅菌處理，取得種植水的母液，設(shè)5個重復(fù)。

1.2.2?沉水植物的培養(yǎng)。

選取植株大小相似、株高10～15 cm的密刺苦草和菹草放入350 mL錐形瓶中，用陶瓷圈固定根部，每瓶1株，用蒸餾水（對照組）和海菜花種植水各300 mL進行為期7 d的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃、光暗時間比14 h∶10 h、光強3 000 lx。為避免試驗材料死亡影響試驗數(shù)據(jù)，設(shè)3個平行的對照組、6個平行的處理組。

1.2.3?過氧化物酶（POD）活性的測定。

采用愈創(chuàng)木酚法[7]來測定2種沉水植物的POD活性，在POD的催化下，過氧化氫會與愈創(chuàng)木酚起氧化反應(yīng)，生成褐色產(chǎn)物。

式中，ΔA470指反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化值;VT指提取酶液的體積;W指植物葉片凈鮮重;VS指試驗所用酶液的體積;t為測量間隔時間（間隔1 min）。

1.2.4?超氧物歧化酶（SOD）活性的測定。

采用氮藍四唑（NBT）還原法[8]測定SOD活性，SOD抑制氮藍四唑在光下的反應(yīng)。

在預(yù)冷的研缽中加入0.5 g植物葉片和1 mL磷酸緩沖液（pH=5.5），研磨成勻漿，用4 mL磷酸緩沖液分數(shù)次沖洗并放入7 mL離心管中，離心（3 600 r/min，10 min，4 ℃），上清液即為SOD粗提液。取5支試管，2支為對照管、2支為測定管、1支為黑暗對照管。往試管中依次加入1 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH=5.5）、0.2 mL 130 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液、0.2 mL 750 μmol/L NBT溶液、0.2 mL 100 μmol/L EDTA-Na2溶液、0.2 mL核黃素溶液、0.05 mL酶液和1.15 mL蒸餾水。混勻后，除黑暗對照組被置于黑暗處外，其他的試管均放在4 000 lx日光下反應(yīng)20 min（要求各管受光程度一致）。 以不進行黑暗處理得到對照管作為空白對照，在560 nm波長下對其他試管進行吸光度測定。

1.2.5?丙二醛（MDA）含量的測定。

采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[9]測定2種沉水植物的MDA含量，MDA與TBA在高溫強酸條件下發(fā)生反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物。

分別取2種供試的水生植物葉片0.5 g放入研缽中，加入5 mL 5% 三氯乙酸（TCA）溶液，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入7 mL離心管，離心（6 000 r/min，10 min，4 ℃）。取2 mL離心后的上清液放入試管中，往試管中加入2 mL 0.67%TBA，混合均勻后置于100 ℃水浴鍋中煮沸30 min，取出試管靜置冷卻后再次離心。最后分別取適量的上清液置于450、532、600 nm波長下測定吸光度。

式中，A532、A450、A600分別表示532、450、600 nm波長下的吸光度。

1.2.6?脯氨酸含量的測定。

脯氨酸標準曲線、樣本的提取、測定和計算方法參照李合生[10]的《植物生理生化試驗原理和技術(shù)》。

1.2.7?葉綠素含量的測定。

取0.5 g洗凈的植物葉片，加入3 mL純丙酮、適量石英砂和碳酸鈣，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，用80%丙酮沖洗研缽，并將沖洗液一并轉(zhuǎn)入離心管中。以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，將上清液用80%丙酮定容至10 mL。取0.5 mL定容后的上清液，用4 mL 80%丙酮對上清液進行稀釋，以80%丙酮作為對照，分別置于663、645 nm波長下測定吸光度。

式中，A663、A645分別表示663、645 nm波長下的吸光度。

1.3?數(shù)據(jù)處理及分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理和分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?海菜花種植水對2種沉水植物POD活性的影響

POD是植物體內(nèi)重要的呼吸酶類，其活性高低與酚類物質(zhì)代謝息息相關(guān)。POD活性的高低反映植物內(nèi)在代謝的情況，并且能夠消除活性氧（ROS）和超氧陰離子自由基（O2·-）對細胞的傷害[11]。

由表1可知，相對于蒸餾水，密刺苦草在海菜花種植水中POD活性由196.357 7 U/（g·min）下降至56.432 7 U/（g·min），下降了72%，具有顯著性差異（P<0.05）。而菹草在海菜花種植水中，POD活性由169.537 1 U/（g·min）下降至86.875 4 U/（g·min），下降了49%，也具有顯著性差異（P<0.05），且密刺苦草POD活性較菹草而言下降較為顯著（P<0.05）。由此可知，海菜花種植水抑制了密刺苦草和菹草的POD活性，且密刺苦草受到的抑制作用更為嚴重。

2.2?海菜花種植水對2種沉水植物SOD活性的影響

SOD是能夠消除植物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)的一種活性物質(zhì)，它幾乎存在于所有生命物體體內(nèi)，可以將有害的超氧陰離子自由基（O2·-）轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H2O2），然后體內(nèi)的過氧化氫酶（CAT）和POD可立即將轉(zhuǎn)化的H2O2分解，生成水和氧[12]，因此，SOD在生物體內(nèi)活性的高低水平是生物體的衰老和死亡的體現(xiàn)。

由表2可知，相對于蒸餾水的對照，在海菜花種植水中，密刺苦草的SOD活性均有所下降，且下降呈顯著差異（P<0.05），說明海菜花化感作用對于密刺苦草的SOD活性有抑制作用;而在海菜花種植水中，菹草的SOD活性有輕微的下降，下降并不明顯（P>0.05），說明海菜花種植水對菹草的SOD活性也有抑制作用，但是抑制作用表現(xiàn)得不明顯。由此可見，海菜花在生長過程中產(chǎn)生的化感物質(zhì)對供試的2種沉水植物的SOD活性都產(chǎn)生有害影響，不利于密刺苦草和菹草植物中O2·-的轉(zhuǎn)換，對其生長產(chǎn)生負面影響，但是密刺苦草所受的海菜花種植水脅迫作用更為顯著。

2.3?海菜花種植水對2種沉水植物MDA含量的影響

MDA是脂類過氧化的主要產(chǎn)物，是較為常見的膜脂過氧化指標，在酸性和高溫的條件下，可以與TBA反應(yīng)，生成粉紅色或者紅色的穩(wěn)定復(fù)合物，其吸收的最大波長為532 nm[13]。植物衰老或環(huán)境改變受到脅迫時，自由基代謝失調(diào)，植物組織和器官的膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化還原反應(yīng)，從而生成MDA等物質(zhì)，導(dǎo)致其體內(nèi)MDA含量增加。

由表3可知，菹草在海菜花種植水中，MDA含量由0.915 μmol/L上升至0.981 μmol/L，上升了7.2%，表現(xiàn)不顯著（P>0.05），說明菹草在海菜花種植水中脂類過氧化反應(yīng)增多，植物表現(xiàn)衰老狀態(tài)，即菹草對海菜花種植水中的化感物質(zhì)表現(xiàn)出了抗性。密刺苦草在不同的海菜花種植水中，MDA含量呈現(xiàn)下降趨勢，由0.901 μmol/L降低至0.337 μmol/L，下降趨勢明顯（P<0.05），其可能原因有：①海菜花的化感作用對密刺苦草的MDA的產(chǎn)生起抑制作用，也就是海菜花化感作用抑制了密刺苦草的膜脂質(zhì)過氧化作用;②密刺苦草對于海菜花的化感作用較為敏感，在海菜花種植水的影響下，膜脂質(zhì)過氧化作用強烈，MDA含量過高，膜脂質(zhì)和細胞受到的傷害在高濃度的海菜花次生物質(zhì)的影響中已近乎死亡。

2.4?海菜花種植水對2種沉水植物脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，研究表明，脯氨酸對于蛋白質(zhì)的折疊、成熟與變性蛋白的清除起重要作用[14]，在逆境環(huán)境中，脯氨酸含量高的植物抗逆性較強。

根據(jù)圖1的脯氨酸標準曲線可以得出線性回歸方程y=0.038 5x+0.273 5，用此方程可以計算出用海菜花種植水培養(yǎng)后2種沉水植物的脯氨酸含量（表4）。

由表4可知，密刺苦草在海菜花種植水中比在蒸餾水對照中脯氨酸含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢（P<0.05），說明密刺苦草對于海菜花化感物質(zhì)表現(xiàn)出了抗性，側(cè)面表明了密刺苦草受到海菜花脅迫作用越明顯。菹草在海菜花種植水中脯氨酸含量相對于蒸餾水（對照組），由9.950 6 μg/mL上升至10.015 6 μg/mL，且無明顯變化（P>0.05），其可能原因有：①菹草對于海菜花并沒有表現(xiàn)出相對的抗性，也就是說菹草并沒有受到海菜花次生物質(zhì)的影響;②菹草對于海菜花種植水表現(xiàn)出了抗性，只是抗性并沒有密刺苦草表現(xiàn)的明顯。

2.5?海菜花種植水對2種沉水植物葉綠素含量的影響

葉綠素（chlorophyll）是一類與光合作用（photosynthesis）有關(guān)的重要色素，葉綠素的含量是反映植物健康狀態(tài)最常用的生態(tài)指標之一[15]。

由表5可知，在一定濃度的海菜花種植水脅迫下，密刺苦草的葉綠素a與葉綠素b的濃度均表現(xiàn)出明顯的下降趨勢（P<0.05），海菜花種植水試驗組密刺苦草的葉綠素a含量比對照組（蒸餾水組）下降57.9%，葉綠素b含量比對照組下降79.2%;海菜花種植水試驗組菹草的葉綠素a含量比對照組下降7.6%，葉綠素b含量比對照組下降0.8%，下降趨勢不顯著（P>0.05）。由公式（5）得知，總?cè)~綠素含量受葉綠素a和葉綠素b的共同影響，由于密刺苦草的葉綠素a和葉綠素b含量都有所下降，所以其總?cè)~綠素含量也呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，且呈顯著差異（P<0.05）。植物體內(nèi)總?cè)~綠素含量下降表明該植物的健康狀況出現(xiàn)了問題或者植物正在衰老甚至是死亡。從這一試驗結(jié)果可知，海菜花化感物質(zhì)對密刺苦草的生長產(chǎn)生了負面的影響。菹草在海菜花種植水中葉綠素a和葉綠素b的含量亦出現(xiàn)下降趨勢，但下降的趨勢并不明顯（P>0.05），說明在同等情況下菹草的生長過程受到海菜花化感物質(zhì)的抑制影響比同一生境的密刺苦草輕。

3?結(jié)論

通過對經(jīng)海菜花種植水培養(yǎng)的2種水生植物（密刺苦草和菹草）葉片中POD活性、SOD活性、MDA含量、脯氨酸含量和葉綠素含量等指標的測定，發(fā)現(xiàn)密刺苦草在海菜花種植水中POD和SOD活性有明顯的下降，MDA含量明顯下降，總?cè)~綠素含量亦有明顯的下降。綜上所述，海菜花生長過程中產(chǎn)生的化感物質(zhì)對密刺苦草的生長產(chǎn)生了抑制作用，并且密刺苦草對于海菜花化感作用反應(yīng)較為敏感。而菹草在上述的所有試驗中，POD活性在海菜花種植水中變化并不明顯，SOD活性有輕微下降，MDA含量呈增高，葉綠素含量表現(xiàn)下降趨勢。由此可見，密刺苦草和菹草在海菜花種植水的培養(yǎng)過程中，也就是在正常的水域環(huán)境中，均受到海菜花分泌的化感物質(zhì)的抑制作用，表現(xiàn)出了對海菜花化感物質(zhì)的抗性，但這2種沉水植物中，密刺苦草所受的化感作用表現(xiàn)較為敏感，表現(xiàn)的抗逆性較差。

在利用水生植物進行水體污染治理中，應(yīng)當選擇合適且合理的沉水植物搭配，從該試驗得出的結(jié)果可以看出，海菜花與密刺苦草、菹草間存在競爭關(guān)系，密刺苦草與菹草對于海菜花化感物質(zhì)表現(xiàn)出抗性，且密刺苦草抗性表現(xiàn)十分明顯。所以在水體修復(fù)工程中對于沉水植物的選擇，海菜花與密刺苦草不應(yīng)一起使用，否則密刺苦草有可能在修復(fù)過程中被海菜花所抑制，達不到修復(fù)預(yù)期試驗效果。

參考文獻

[1]中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志：第4卷[M].北京：科學(xué)出版社，1998：757-761.

[2]蔣柱檀，李恒，刀志靈，等.云南傳統(tǒng)食用植物海菜花（Ottelia acuminata）的民族植物學(xué)研究[J].內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)漢文版），2010，39（2）：163-168.

[3]翟書華，楊曉虹.不同激素處理對海菜花種子萌發(fā)特性的影響[J].種子，2017，36（8）：72-74.

[4]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1993：18.

[5]汪松，解焱.中國物種紅色名錄[M].北京：高等教育出版社，2004.

[6]陳鋒，孟永杰，帥海威，等.植物化感物質(zhì)對種子萌發(fā)的影響及其生態(tài)學(xué)意義[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，25（1）：36-46.

[7]肖溪，樓莉萍，李華，等.沉水植物化感作用控藻能力評述[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2009，20（3）：705-712.

[8]CRAMER G R，ABDEL-BASSET R，SEEMANN J R.Salinity-calcium interactions on root growth and osmotic adjustment of two corn cultivars differing in Salt Tolerance [J].Journal of plant nutrition，1990，13（11）：1453-1462.

[9]王學(xué)奎，黃見良.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].3版.北京：高等教育出版社，2015.

[10]李合生.植物生理生化試驗原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2000.

[11]羅龍海，范三紅，張美祥，等.小麥種子過氧化物酶的純化及其部分酶學(xué)性質(zhì)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2008，16（1）：181-182.

[12]朱秀敏.超氧化物歧化酶的生理活性[J].當代醫(yī)學(xué)，2011，17（15）：26-27.

[13]張秋萍，吳霞紅，鄭劍恒，等.生物樣本中丙二醛測定方法的研究進展[J].理化檢驗-化學(xué)分冊，2016，52（8）：979-985.

[14]王寶增.脯氨酸與植物的抗逆性[J].生物學(xué)教學(xué)，2011（11）：4-5.

[15]馬宗琪，崔靜，王秀，等.樹木葉片葉綠素含量三種測定方法的比較[J].林業(yè)科技，2016，41（5）：42-45.