免疫評分在肝癌患者中的預(yù)后研究

張浩楠，張林枝，高煒，徐彥，楊雪玲，于海鵬，邢文閣，司同國

1.天津市第一中心醫(yī)院放射科，天津影像醫(yī)學(xué)研究所，天津 300192；2.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院介入治療科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300060；3.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心介入科，北京100039

傳統(tǒng)判斷腫瘤預(yù)后常根據(jù)外科手術(shù)切除標(biāo)本行病理學(xué)檢查，采用國際通用的TNM分期，其中T分期指原發(fā)腫瘤的大小及數(shù)目，N分期指局部或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，M分期指遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。當(dāng)前關(guān)于腫瘤的研究已邁進(jìn)精準(zhǔn)檢測與免疫治療時(shí)代。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是涉及多基因、多階段的序貫過程，且與腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞與相關(guān)分泌的細(xì)胞因子、炎性因子等作用密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，即使同處TNM早期的患者，經(jīng)手術(shù)達(dá)到R0切除，沒有任何遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，其術(shù)后的生存周期卻可以明顯不同[1,2]，提示TNM分期雖在一定程度上反應(yīng)患者的預(yù)后，但因未能對腫瘤中心（tumor center，TC）與侵襲性周緣（invasive margin，IM）免疫細(xì)胞浸潤的狀態(tài)作出評估，對免疫治療有效患者的類群揭示意義不足。

原發(fā)性肝癌的腫瘤異質(zhì)性很強(qiáng)，即使適合外科切除的術(shù)后早期復(fù)發(fā)率仍然高達(dá)52.3%，大部分患者因早期復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，僅有極少部分患者可以獲得較長的生存。原因在于既往研究僅關(guān)注腫瘤本身的生物學(xué)行為及狀態(tài)，但對腫瘤生長的土壤-腫瘤微環(huán)境的免疫學(xué)狀態(tài)未予重視。因此明確患者預(yù)后差異的不同免疫學(xué)背景是極為重要的。有學(xué)者提出運(yùn)用免疫評分（immunoscore）作為TNM分期的輔助評分系統(tǒng)（TNM-I）對結(jié)腸癌患者進(jìn)行生存預(yù)測得到較好的預(yù)測價(jià)值，然而有關(guān)免疫評分的報(bào)道目前集中于結(jié)腸癌，還需要在更多類型實(shí)體腫瘤中得到驗(yàn)證[3,4]。已有報(bào)道提及疾病進(jìn)程中CD8+T對于腫瘤細(xì)胞殺傷的重要性，這其中以來自外周血的數(shù)據(jù)居多，肝癌組織局部的免疫狀態(tài)與預(yù)后關(guān)系研究較少[5,6]。肝癌中CD3+T、CD8+T細(xì)胞浸潤密度和患者的生存預(yù)后報(bào)道較少，也并沒有統(tǒng)一的定論。本文回顧性收集61例病理學(xué)確診為原發(fā)性肝癌的手術(shù)蠟塊，通過免疫組化進(jìn)行CD3+T、CD8+T細(xì)胞染色，分析PD-L1、免疫評分與臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2015年12月天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院收治的住院患者，經(jīng)手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌標(biāo)本61例。所有病例術(shù)前未接受放化療及新輔助治療，術(shù)后大標(biāo)本的病理診斷為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌，另外設(shè)置15例癌旁組織為對照。其中男性53例，女性8例，男女比例約為6.6：1。年齡36～73歲，中位年齡（55.7±8.4）歲。單發(fā)腫瘤43例（70.5%），多發(fā)腫瘤18例（29.5%）。根據(jù)AJCC/UICC 2010年第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]，Ⅰ期35例（57.4%）、Ⅱ期14例（23%）、Ⅲ期12例（19.6%）。按照組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)[8]，中分化38例（62.3%）、低分化23例（37.7%）。腫瘤大小≤2 cm者3例（4.9%）、2～5 cm者29例（47.5%）、＞5 cm者29例（47.5%）。有脈管瘤栓者41例（67.2%）、無脈管瘤栓者20例（23.8%）。所有病例臨床資料完整且隨訪時(shí)間超過5年，末次隨訪日期為2018年5月；隨訪期間發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移19例（31.1%）、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移42例（68.9%）。上述肝癌組織標(biāo)本由外科手術(shù)獲取，且每位患者術(shù)前已知曉并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 記錄臨床特征 所有61例病例以電話、門診影像學(xué)復(fù)查的方式進(jìn)行隨訪。收集臨床病理特征信息諸如：年齡、性別、腫瘤大小，單發(fā)或多發(fā)腫瘤、術(shù)前AFP、T分期、總分期、腫瘤分化程度、肝炎病史、肝硬化病史、有無發(fā)生肝內(nèi)復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并記錄轉(zhuǎn)移位置、有無脈管侵犯、無瘤生存期、總生存期（表1）。

表1 肝癌隊(duì)列臨床特征%（n）Tab.1 Clinical characteristics of patients with hepatocellular carcinoma%（n）

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法采用免疫組織化學(xué)三步法進(jìn)行染色。將標(biāo)本蠟塊制備成5μm切片，經(jīng)脫蠟梯度酒精復(fù)水后，置于pH 9.0的EDTA緩沖液中，用高壓鍋加熱至噴氣后開始計(jì)時(shí)150 s，滴加鼠抗人CD3、CD8單克隆抗體工作液（購自北京中杉生物技術(shù)有限公司），兔抗人PD-L1抗體（克隆號E1L3N，購自cell signaling technology，按1：400稀釋），4℃冰箱孵育過夜，次日室溫下與二抗結(jié)合反應(yīng)30 min，洗片后滴加三抗經(jīng)DAB顯色及蘇木精復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明后封片，鏡下拍照。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判讀 為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性，切片均由2名資深病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立評估。PD-L1陽性表達(dá)判斷用半定量積分法，結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比來評定，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽性顯色。先在低倍鏡下觀察完整切片，選取具有代表性視野后分別在腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（×400），染色強(qiáng)度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞密度：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分。兩項(xiàng)得分乘積≥3分為陽性表達(dá)。CD3+T、CD8+T陽性結(jié)果判讀采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法。先用低倍鏡觀察整張切片，分別尋找具有代表性的腫瘤中心及侵襲性邊緣陽性淋巴細(xì)胞密度較高處，在其中隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)CD3+T、CD8+T陽性淋巴細(xì)胞數(shù)，并求其在不同區(qū)域內(nèi)的平均值作為該例CD3+T、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)。以所有切片CD3+T、CD8+T陽性細(xì)胞數(shù)的均數(shù)為基準(zhǔn)，大于該值即為陽性表達(dá)記為1分，低于該值即為陰性表達(dá)記為0分。將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的免疫浸潤細(xì)胞分別評分并計(jì)入總分，可以得到I0、I1、I2、I3、I4 5個(gè)不同免疫評分值。I0～I(xiàn)2定義為低免疫評分，I3～I(xiàn)4為高免疫評分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。性資料不同組間比較采用卡方檢驗(yàn)及Fisher精確概率法，生存率的組間比較采用Kaplan-Meier生存曲線法及Log-rank檢驗(yàn)，以P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD3+T、CD8+T分布與表達(dá)

CD3+T、CD8+T主要定位于腫瘤侵襲性邊緣的間質(zhì)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜（圖1，2）。CD3+T、CD8+T淋巴細(xì)胞的分布模式分為3種：⑴免疫炎型：腫瘤中心與侵襲性邊緣均可見大量免疫淋巴細(xì)胞浸潤，該分布模式的免疫評分為I3～I(xiàn)4；⑵免疫豁免型：CD3+T、CD8+T淋巴細(xì)胞大量浸潤于侵襲性邊緣的周圍而難以進(jìn)入腫瘤中心，其免疫評分為I1～I(xiàn)2；⑶免疫荒漠型：腫瘤中心與侵襲性邊緣幾乎不見免疫淋巴細(xì)胞浸潤，該模式的免疫評分為I0。本隊(duì)列中免疫評分較高的表達(dá)率為26.2%（16/61），免疫評分較低的表達(dá)率為73.8%（45/61）。

圖1 免疫炎型淋巴細(xì)胞浸潤A、B：不同放大背景中觀察腫瘤中心可見大量淋巴細(xì)胞浸潤C(jī)、D：不同放大背景中觀察腫瘤侵襲性周緣可見大量淋巴細(xì)胞浸潤Fig.1 Representative images of tumorinfiltrating lymphocytes(TILs)in immune-hot patternA、B:Observation of a large number of TILs in the tumor center in different magnification；C and D:Observation of a large number of TILs in the invasive margin in different magnification

將免疫評分與患者臨床特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫評分與患者年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、脈管癌栓等臨床因素?zé)o相關(guān)性（P＞0.05）。免疫評分與血清AFP增高（P＜0.05）及肝內(nèi)復(fù)發(fā)（P＜0.05）具有相關(guān)性。免疫評分較低的患者更易出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)，預(yù)后更差，詳見表2。

表2 免疫評分與HCC患者臨床特征分析%（n）Tab.2 Clinical characteristics and immunoscore analysis of HCC%（n）

2.3 免疫評分與患者生存之間的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示，免疫評分較高患者（I3～I(xiàn)4）生存期顯著高于免疫評分較低的患者（I0～I(xiàn)2），χ2=11.39，P＜0.01。免疫評分較高患者（I3～I(xiàn)4）無復(fù)發(fā)生存期同樣顯著高于免疫評分較低的患者（I0～I(xiàn)2），χ2=14.78，P＜0.01，見圖3。

2.4 PD-L1在肝癌及癌旁的表達(dá)

為保證實(shí)驗(yàn)染色的準(zhǔn)確性，設(shè)置胎盤組織陽性對照及癌旁陰性對照同批進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)（圖4）。PD-L1陽性染色細(xì)胞主要定位于腫瘤中心的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜（圖5）。肝癌組織中PD-L1蛋白的陽性表達(dá)率為44.3%（27/61），其癌旁組織很少表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.313，P＜0.01，表3）。

2.5 PD-L1表達(dá)與患者生存之間的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線顯示，PD-L1陽性患者的總生存期低于PD-L1陰性患者（χ2=5.598，P＜0.05）。PD-L1陽性患者無復(fù)發(fā)生存期顯著低于PD-L1陰性患者（χ2=10.90，P＜0.01），見圖6。

2.6 PD-L1的表達(dá)與免疫評分的相關(guān)性

將免疫評分與PD-L1表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析相關(guān)性，PD-L1表達(dá)較高的患者免疫評分較低，而免疫評分較高的患者中PD-L1表達(dá)量較低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2=12.703，P＜0.01,見表4。

3 討論

目前有很多預(yù)后評價(jià)方式用來對肝癌患者進(jìn)行分層管理與治療，其中包括TNM分期，BCLC分期，ECOG評分等。正如先前的研究報(bào)道血清AFP、血管浸潤、腫瘤分期均可預(yù)測患者的復(fù)發(fā)與預(yù)后，然而以上評分系統(tǒng)及血清標(biāo)志物提供患者有限的預(yù)后信息[9～11]。它們未能揭示肝癌中心及其所處微環(huán)境的免疫學(xué)狀態(tài)，對于腫瘤免疫異質(zhì)性的解釋也不充足，已落后于免疫治療的新時(shí)代。

圖2 免疫豁免型與免疫荒漠淋巴細(xì)胞浸潤A、B：免疫豁免型,在不同放大背景中腫瘤中心無免疫細(xì)胞浸潤，而侵襲性周緣中可見淋巴細(xì)胞浸潤C(jī)、D：免疫荒漠型,腫瘤中心與侵襲性周緣中均無淋巴細(xì)胞浸潤Fig.2 Representative images of tumor-infiltrating lymphocytes(TILs)in immune-limited and immune-cold patternA,B:immune-limited,no immune cell infiltration in the tumor center in different enlargement,and tumor-infiltrating lymphocytes can be seen in the invasive margin；C and D:Immune-cold,no tumor-infiltrating lymphocytes in tumor center and invasive margin

圖3 肝癌患者總體生存、無復(fù)發(fā)生存與免疫評分的Kaplan-Meier曲線A：免疫評分較高患者（I3～I(xiàn)4）生存期顯著高于免疫評分較低患者（I0～I(xiàn)2）B：免疫評分較高患者（I3～I(xiàn)4）無復(fù)發(fā)生存期顯著高于免疫評分較低患者（I0～I(xiàn)2）Fig.3 Kaplan-Meier curves comparing OS and PFS in patients with different immunoscore expressionA:overall survival rate of patients with HCC with a high or low immunoscore；B:progression-free survival of patients with HCC with a high or low immunoscore

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤可作為結(jié)直腸癌的預(yù)后標(biāo)志物用于指導(dǎo)治療[3,12]。在分別評估不同腫瘤區(qū)域內(nèi)（即腫瘤中心與侵襲性邊緣）免疫細(xì)胞浸潤的類型，定位和密度-稱為“免疫評分（immunoscore）”。免疫評分不僅可揭示腫瘤所在的免疫微環(huán)境，可以獨(dú)立預(yù)測患者的總生存與無復(fù)發(fā)生存，被認(rèn)為是相對于標(biāo)準(zhǔn)TNM分期能夠更好地預(yù)測臨床結(jié)局[13,14]。免疫評分提出后有學(xué)者將其應(yīng)用HCC的探索中[15]，然而結(jié)果尚未達(dá)成一致。

圖4 PD-L1胎盤組織陽性染色及癌旁組織陰性染色A、B：胎盤組織PD-L1陽性表達(dá)C、D：癌旁組織PD-L1陰性表達(dá)Fig.4 The positive expression of PD-L1 in human placenta tissue,and the negative expression in adjacent to cancer tissueA,B are the positive expression of PD-L1 in human placenta tissue,whereas C and D are the negative expression in adjacent to cancer tissue

表3 PD-L1在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)率%Tab.3 Expression of PD-L1 in hepatocellular carcinoma and adjacent to cancer

由Sun等人[16]首次描述HCC患者腫瘤中心CD8+T細(xì)胞的預(yù)測值。其研究包括兩個(gè)獨(dú)立的患者群，隊(duì)列1包括從接受根治性切除90例患者的腫瘤樣品，隊(duì)列2包括從359名未經(jīng)治療的HCC患者的腫瘤樣品，對不同區(qū)域的CD8+T和CD3+T細(xì)胞密度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤中心與侵襲性周緣處均為高細(xì)胞密度的患者與較長的PFS和OS顯著關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)為小樣本的回顧性研究，亦發(fā)現(xiàn)對于復(fù)發(fā)性肝癌患者而言，免疫評分較高（I3～I(xiàn)4）患者的總生存期顯著高于免疫評分較低（I0～I(xiàn)2）的患者（χ2=11.39，P＜0.01）。免疫評分較高（I3～I(xiàn)4）患者的無復(fù)發(fā)生存期同樣顯著高于免疫評分較低（I0～I(xiàn)2）的患者（χ2=14.78，P＜0.01）。聯(lián)合分析顯示，患者CD3+T、CD8+T細(xì)胞在1～2個(gè)腫瘤區(qū)域（腫瘤中心或侵襲性邊緣）均為高密度可顯著降低肝癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

免疫評分與患者臨床特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫評分與患者年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、脈管癌栓等臨床因素?zé)o相關(guān)性（P＞0.05），免疫評分與血清AFP增高（P＜0.05）及肝內(nèi)復(fù)發(fā)（P＜0.05）具有相關(guān)性。AFP增高與腫瘤進(jìn)展過程中產(chǎn)生大量內(nèi)源性抗原，在一定程度內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)，吸引淋巴細(xì)胞浸潤腫瘤內(nèi)部與侵襲性邊緣。CD3+T、CD8+T淋巴細(xì)胞的分布模式分為3種：免疫炎型、免疫豁免型和免疫荒漠型。對于免疫炎型腫瘤，無論在TC與IM中均可見到大量淋巴細(xì)胞浸潤，可以在最大范圍限制腫瘤生長，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。而免疫豁免型可以看到大量淋巴細(xì)胞僅僅聚集于腫瘤周緣，很難進(jìn)入腫瘤實(shí)質(zhì)，免疫細(xì)胞呈現(xiàn)圍而不攻的狀態(tài)，提示腫瘤內(nèi)部可能有大量免疫抑制因素的存在，通過對同一切片進(jìn)行組化染色，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)于腫瘤中心，提示腫瘤本身形成內(nèi)源性抵抗微環(huán)境限制免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤實(shí)質(zhì)，但是同樣發(fā)現(xiàn)并非所有免疫豁免型腫瘤可見到PD-L1陽性染色，提示可能還有其他免疫檢查點(diǎn)抑制通路在起作用，肝癌作為異質(zhì)性極強(qiáng)的惡性腫瘤，本身就有獨(dú)特的免疫耐受微環(huán)境，腫瘤發(fā)展過程中涉及的免疫逃逸極為復(fù)雜，其與骨髓抑制細(xì)胞（MDSC）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等聚集有關(guān)[17]。而免疫荒漠型腫瘤在TC與IM中都難以見到效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，免疫效應(yīng)細(xì)胞一片荒涼。免疫評分為I0的患者預(yù)后極差，極易出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，沒有免疫效應(yīng)細(xì)胞及分子對其進(jìn)行限制。針對免疫荒漠型腫瘤，僅僅通過解除免疫抑制的作用是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，治療策略更應(yīng)該傾向如何向腫瘤實(shí)質(zhì)與間質(zhì)中投入更多的士兵產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，可能通過介入治療的手段將更多具有殺傷活性的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行遞送，從而獲得更好的預(yù)后。

圖5 PD-L1在肝癌組織中不同陽性染色結(jié)果A、B、C：100×視野下肝癌組織分別呈弱陽性、陽性與強(qiáng)陽性表達(dá)D、E、F：200×視野下肝癌組織分別呈弱陽性、陽性與強(qiáng)陽性表達(dá)Fig.5 Expression of PD- L1 in hepatocellular carcinoma tissueA,B,C:100×view of HCC in the field of view is weak,positive and strong positive expression rate,respectively；D,E,F:200×view of HCC in the field of view is weak,positive and strong in positive expression rate,respectively

圖6 肝癌患者總體生存、無復(fù)發(fā)生存與PD-L1的Kaplan-Meier曲線A：PD-L1陽性患者總生存期低于PD-L1陰性患者B：PD-L1陽性患者無復(fù)發(fā)生存期顯著低于PD-L1陰性患者Fig.6 Kaplan-Meier curves comparing OS and PFS in patients with and without PD-L1 expressionA:overall survival rate of patients with HCC with a high or low expression of PD-L1；B:progression-free survival of patients with HCC with a high or low expression of PD-L1

表4 PD-L1的表達(dá)與免疫評分的相關(guān)性Tab.4 The relationship between the expression rate of PDL1 and immunoscore

免疫抑制分子PD-L1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)的淋巴細(xì)胞，PD-1表達(dá)在T細(xì)胞膜上的抑制性受體，與配體結(jié)合后通過進(jìn)一步信號傳導(dǎo)使CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞失活，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。腫瘤進(jìn)展中，腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)PD-L1，大量傳遞抑制信號，減少CTL的增殖與聚集，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生免疫逃逸。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌中PD-L1蛋白的陽性表達(dá)率為44.3%（27/61），其相應(yīng)癌旁組織很少表達(dá)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存曲線分析表明，PD-L1蛋白陽性表達(dá)患者的總生存率顯著低于陰性表達(dá)的患者。相關(guān)性分析結(jié)果表明PD-L1表達(dá)與免疫評分具有負(fù)相關(guān)，提示在PD-L1高表達(dá)的患者中，應(yīng)用免疫抑制劑可以提高局部免疫效應(yīng)細(xì)胞及分子的浸潤，進(jìn)而提高腫瘤的控制率。

對于多結(jié)節(jié)起源的原發(fā)性腫瘤，本實(shí)驗(yàn)探索的結(jié)果是每一個(gè)結(jié)節(jié)即使分化程度相同，但是結(jié)節(jié)彼此之間的免疫細(xì)胞浸潤程度與PD-L1表達(dá)的量均各異。本組接下來的實(shí)驗(yàn)將通過免疫組化或多色免疫熒光進(jìn)行多中心起源性肝癌免疫微環(huán)境的表征探索。