經口氣管插管激發(fā)和霧化激發(fā)建立哮喘小鼠模型的比較

胡婕，鄒文靜，王韻婷，牛超，符州，代繼宏

1.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室、兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地、兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014；2.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸中心，重慶400014

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是世界范圍內嚴重威脅公眾健康的慢性病，其發(fā)病率在發(fā)達國家高達15%～20%，在中國也有2%～4%[1]，特別是近年兒童哮喘發(fā)病率較十年前上升了43.4%[2]，提示現(xiàn)有哮喘防治措施嚴重不足，需要引起社會的廣泛關注。當前小鼠哮喘模型是全世界進行哮喘研究最廣泛的動物模型[3]，但其構建方法存在較大差異，特別在致敏原劑量、致敏后激發(fā)方式上有較大不同[4,5],對小鼠哮喘模型建立的最優(yōu)方案暫無廣泛共識。

目前哮喘模型的激發(fā)方式主要有滴鼻吸入激發(fā)和霧化吸入激發(fā)兩種[6]，但這兩種激發(fā)方式都不能完全對小鼠吸入氣管的過敏原定量，如在滴鼻激發(fā)時，因鼻腔和口腔的連接，不能夠確定藥物是否進入氣道以及進入氣道的劑量，造成同批次哮喘模型的不穩(wěn)定。若增加過敏原的滴鼻劑量和次數(shù)會提高小鼠的死亡率。在霧化激發(fā)時，國內多自制霧化盒對小鼠進行霧化[7]；霧化時，因盒內OVA濃度易波動，小鼠藥物吸入劑量不能明確，易造成哮喘建模不穩(wěn)定，造成模型數(shù)據(jù)差異偏大。故尋找一種激發(fā)方式既能精準定量定位，又能夠提高模型穩(wěn)定性是十分必要的，因此本研究嘗試在不同的致敏劑量的基礎上采用經口氣管插管（intratracheal instillation，ITI）[8]和霧化（atomizing inhalation，INH）的激發(fā)方式建立小鼠哮喘模型，從氣道炎癥、氣道高反應性（airway hyperresponsiveness，AHR）以及血清總IgE等方面比較[9,10]，探討建立一種穩(wěn)定、理想的小鼠哮喘模型。

1 材料與方法

1.1 材料

雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA，Sigma-Aldrich，U.S.A）；氫氧化鋁凝膠（Aluminum Hydroxide Gel，Alum，Sigma-Aldrich，U.S.A）；乙酰甲膽堿（methacholine，Ach，Sigma-Aldrich，U.S.A)；糖原PAS染色試劑（雷根生物技術，中國）；Masson染色試劑盒（雷根生物技術，中國）；ELISA檢測試劑盒（欣博盛生物科技，中國）；小鼠無創(chuàng)肺功能儀（EMKA，F(xiàn)rance）。

1.2 實驗動物及模型建立

1.2.1 實驗動物及分組6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，體重18～22 g，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物房，室溫22～26℃，濕度55%～60%，光照12 h/d。將小鼠隨機分為5組：對照組、20-INH組、100-INH組、20-ITI組、100-ITI組，每組6只。

1.2.2 致敏 建模哮喘組小鼠均于0、7、14 d經腹腔、大腿根部皮下各注射100μl致敏液（內含20μg OVA或100μg OVA，100μl Alum）致敏，對照組用相同的方法注射同體積的生理鹽水。

1.2.3 激發(fā) 霧化激發(fā)組（20-INH組、100-INH組）于第21～30 d置入霧化箱內，予1%OVA溶液超聲霧化吸入，每天30 min（圖1A）。經氣管給藥激發(fā)組（20-ITI組、100-ITI組）于第21 d，水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射進行麻醉后，固定于解剖臺上，用眼科鑷將小鼠的舌頭從口中輕輕牽出，用自制的插管裝置[11]在發(fā)光耳勺的引導下插入插管裝置，待小鼠呼吸平穩(wěn)后緩慢滴入50μl激發(fā)液（含50μg OVA），48 h后重復1次，共5次(圖1B)。對照組以等量生理鹽水代替OVA致敏液及激發(fā)液，其余處理同哮喘組。

圖1 哮喘模型造模方法A:霧化激發(fā)建立小鼠哮喘模型方法B:經口氣管插管建立小鼠哮喘模型方法Fig.1 Establishment of asthma modelA:Establishment of mouse asthma model by atomizing inhalation；B:Establishment of mouse asthma model by intratracheal instillation

1.3 指標檢測

1.3.1 氣道高反應性測定 每組取6只小鼠于末次激發(fā)后24 h內用EMKA體積描記儀檢測小鼠氣道高反應性，先測定基礎肺功能值2 min，再給予不同濃度的Ach（0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/ml）霧化3 min,休息2 min后記錄5 min，完成后收集增強的呼氣間歇（enhanced pause,Penh）數(shù)據(jù)[10]，取其平均值分析小鼠氣道高反應性。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的灌取及細胞計數(shù) 小鼠于末次激發(fā)24 h內用10%水合氯醛麻醉，取眼球血后斷頸處死，仰臥固定，充分暴露氣管和胸腔，用止血鉗鉗夾左肺肺門處，留置針插入氣管并固定，用預冷無菌PBS溶液進行右肺支氣管肺泡灌洗，共3次，每次0.5 ml,回收率在80%以上。2500 r/min，4℃離心5min，收集上清液。細胞沉渣加入1 ml PBS稀釋，充分混勻后取20μl進行細胞計數(shù)，剩余懸液，4℃，2500 r/min離心5 min，棄上清液，取細胞沉淀涂片，晾干后行瑞氏染色細胞分類計數(shù)。

1.3.3 病理染色 小鼠支氣管肺泡灌洗液灌洗后松開左側肺門處止血鉗，取出左肺放入4%的中性甲醛內固定48 h，經脫水、石蠟包埋后切成4μm薄片，黏附于載玻片上，放入60℃烘箱烘烤48 h后分別進行HE染色、PAS染色和Masson染色，光鏡下觀察肺部病理情況。

1.3.4 血清中總IgE含量檢測 將小鼠眼球血，常溫，2500 r/min離心10 min，取上清，再常溫，2500 r/min離心5 min，取上清，參照ELISA檢測試劑盒說明檢測血清中IgE含量。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用Graph Pad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)值以平均值±標準差(±s)表示，各組小鼠BALF細胞計數(shù)、肺部炎癥情況及血清IgE水平用One-way ANOVA或Turkey檢驗；組間小鼠氣道高反應性比較用Two-way ANOVA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠氣道高反應性檢測結果

隨著Ach濃度的增高，各組小鼠AHR也逐漸增加。在Ach濃度為0、3.125、6.25 mg/ml時，20-INH、100-INH、100-ITI三組的AHR與對照組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。在Ach濃度為12.5、25、50 mg/ml時，20-INH、100-INH、100-ITI三組的AHR較對照組明顯升高（12.5 mg/ml：F=2.265，P=0.002；25 mg/ml：F=30.34，P＜0.0001；50 mg/ml：F=15.57，P＜0.0001)；20-INH組、100-INH組和100-ITI組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。20-ITI組AHR與對照組相比在Ach各濃度均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組小鼠氣道高反應性*P＜0.05，n=6Fig.2 Airway hyperresponsiveness of mice for each group*P＜0.05，n=6

2.2 BALF細胞總計數(shù)及分類計數(shù)結果

20-INH組[(11.56±2.03)×105]、100-INH組[(7.45±2.49)×105]、100-ITI組[(9.47±1.79)×105]與對照組細胞總數(shù)[(2.403±0.94)×105]相比明顯增多（F=27.81，P＜0.0001）。其中20-INH組細胞總數(shù)均值最高，100-ITI組次之，兩者相比有統(tǒng)計學意義（F=5.625，P=0.015），100-INH組與100-ITI組無統(tǒng)計學差異（F=1.971，P=0.4734）。20-ITI組[(3.403±1.44)×105]細胞總數(shù)最低，與對照組無明顯差異（T=2.331,P=0.3745）(圖3A)。

各哮喘組與對照組相比嗜酸性粒細胞總數(shù)明顯升高（F=23.22,P＜0.0001），其中100-ITI組升高最明顯，20-ITI升高最不明顯。20-INH組與100-INH組結果類似，無明顯統(tǒng)計學差異（F=1.5,P=0.6672）；100-ITI組嗜酸性粒細胞明顯高于20-ITI組，兩者有統(tǒng)計學差異（T=5,P=0.0005）（圖3B）。

圖3 各組BALF細胞分類計數(shù)A:與對照組相比，***P＜0.001，與100-INH組相比，#P＜0.05 B:與對照組相比，##P＜0.01，與100-ITI組相比，*P＜0.05,***P＜0.001 n=6Fig.3 Numbers of total cells and eosinophils cells in BALF of the miceA:compared with control group,***P＜0.001,#P＜0.05；B:compared with control group,##P＜0.01,compared with 100-ITI group,*P＜0.05,***P＜0.001,n=6

2.3 肺組織病理切片HE染色結果

各哮喘組小鼠氣道和血管周圍均有大量炎癥細胞浸潤，但20-ITI組較其他3組模型組氣道及血管周圍炎癥細胞浸潤程度較低。病理炎癥評分結果顯示：哮喘模型組炎癥評分均明顯高于對照組（F=98.62,P＜0.0001），20-INH、100-INH、100-ITI 3組間病理炎癥評分無明顯差異（F=3.1,P=0.07），20-IHN、100-IHN和100-ITI組均明顯高于20-ITI組（F=42.12，P＜0.0001），提示20μg OVA致敏劑量下，經口氣管插管激發(fā)建模效果稍差（圖4）。

圖4 各組小鼠肺組織HE染色A：對照組B：20-INH組C：100-INH組D：20-ITI組E：100-ITI組F：病理炎癥評分，與對照組相比，***P＜0.01，n=6Fig.4 HE staining of lung tissue in each group of miceA：control group；B：20-INH group；C：100-INH group；D：20-ITI group；E：100-ITI group；F：pathological inflammation score，compared with control group，***P＜0.01,n=6

2.4 肺組織病理切片PAS糖原染色結果

糖原PAS染色反應物質為紅色或紫紅色，代表氣道粘液的分泌。20-INH組、100-INH組、100-ITI組較對照組氣道粘液分泌明顯增多（F=54.8,P＜0.0001），其中100-ITI組氣道粘液分泌最為明顯，明顯高于其它各組（F=34.88，P＜0.0001）；20-INH組與100-INH組氣道分泌粘液無明顯差異（F=1.117,P=0.906）；20-ITI組粘液分泌量低于其他3個哮喘組（F=34.88,P＜0.0001），提示20μg OVA致敏劑量下，經口氣管插管激發(fā)建模氣道粘液分泌效果較差。此外，各組組內穩(wěn)定性比較中，100-ITI組（SD=34.39）低于20-INH組（SD=36.59）和100-INH組(SD=34.62)，該組數(shù)據(jù)離散程度最低（圖5）。

2.5 肺組織病理切片Masson染色結果

各哮喘組小鼠器官周圍無明顯膠原蛋白沉積，無明顯的纖維增生，無氣道重塑的改變，其中100-ITI組纖維增生較對照組有增多，但無統(tǒng)計學意義（F=0.25,P=0.90）（圖6）。

2.6 血清中總IgE含量檢測結果

通過ELISA檢測各組小鼠眼球血血清可知，各哮喘組血清中總IgE含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F=40.36,P＜0.0001），100-ITI組血清總IgE含量最高（F=9.85,P=0.0019），20-INH組與100-INH組相比無統(tǒng)計學差異（F=2.746,P=0.2918）；20-ITI較其它哮喘組IgE水平最低（F=20.27，P＜0.0001），提示經口氣管插管激發(fā)下，20μg致敏劑量升高哮喘模型血漿IgE效果欠佳。此外，20-ITI（SD=0.17）、100-ITI（SD=0.37）組內差異小于20-INH(SD=0.71)、100-INH(SD=0.43)，提示經口氣管插管激發(fā)引發(fā)哮喘模型的IgE水平升高更穩(wěn)定（圖7）。

3 討論

過敏性哮喘是一種異質性疾病，影響了全世界數(shù)百萬人，并且每年的發(fā)病率穩(wěn)步上升[12]。哮喘的發(fā)病機制十分復雜，小鼠哮喘模型在很大程度上促進了對哮喘病理生理機制的理解[13]。目前在建立小鼠哮喘模型的方法中，多采用BALB/c和C57BL/6近交系小鼠，雞卵清蛋白和屋塵螨為過敏原，腹腔注射或滴鼻等方法進行致敏，霧化或滴鼻方法進行激發(fā)[14]。然而在現(xiàn)有建立小鼠哮喘模型的激發(fā)方式方法中，經鼻腔激發(fā)易使激發(fā)液經過口腔進入消化道，從而造成不同個體間呼吸道攝入激發(fā)量的差異和激發(fā)液的浪費；國外雖有已出現(xiàn)專門用于小鼠的霧化裝置，但價格昂貴[7]，故國內多采用自制的霧化裝置，但因霧化裝置未標準化常導致小鼠哮喘模型的不穩(wěn)定，也不能明確定位病變部位，所以需采用新的激發(fā)方式精準定位定量，提高模型的穩(wěn)定性。

圖5 各組小鼠肺組織PAS染色A:對照組B:20-INH組C:100-INH組D:20-ITI組E:100-ITI組F:IOD,與對照組相比，***P＜0.001；與100-ITI組相比，##P＜0.01,n=6Fig.5 PAS staining of lung tissue in each group of miceA：control group；B：20-INH group；C：100-INH group；D：20-ITI group；E：100-ITI group；F:IOD,compared with control group，***P＜0.01,compared with 100-ITIgroup,##P＜0.01,n=6

圖6 各組小鼠肺組織Masson染色A：對照組B：20-INH組C：100-INH組D：20-ITI組E：100-ITI組F:IOD，n=6Fig.6 Masson staining of lung tissue in each group of miceA：control group；B：20-INH group；C：100-INH group；D：20-ITIgroup；E：100-ITIgroup；F:IOD,n=6

圖7 ELISA檢測血清總IgE含量與對照組相比，***P＜0.001，*P＜0.05；與100-ITI組比較，##P＜0.01，#P＜0.05，n=6Fig.7 Total IgEin serum detected by ELISAcompared with control group，***P＜0.001，*P＜0.05；compared with 100-ITIgroup,##P＜0.01，#P＜0.05，n=6

本研究前期發(fā)現(xiàn)，經口氣管插管方法明確將藥物作用在氣管上，擴散至下氣道[15]，對哮喘病理基礎氣道炎癥的研究準確定位。類似的給藥方法已成功應用于肺纖維化模型的構建[16]，故該技術成熟可行。因此，我們采取經口氣管插管激發(fā)的方式用BALB/c雌性小鼠建立哮喘小鼠模型，與霧化激發(fā)建模進行比較，同時哮喘模型0VA致敏劑量多在10～100μg不等，其中10～20μg最常見[3]，所以我們選擇最常見劑量20μg和最大劑量100μg兩種劑量進行建模。綜上，本研究在不同致敏劑量上采用了兩種激發(fā)方式構建小鼠哮喘模型，將經口氣管插管激發(fā)建立的哮喘模型與霧化激發(fā)的哮喘模型在氣道高反應性、氣道炎癥和血清總IgE水平等方面進行比較，以期選擇出一種價格適宜，同時能減少同批次間模型差異性，提高小鼠哮喘模型穩(wěn)定性的建模方法。

本研究結果顯示，在小鼠氣道高反應性中，經口氣管插管激發(fā)與霧化激發(fā)所建模型均能明顯提高小鼠氣道高反應性，兩種方法間沒有明顯的差異，表明經口氣管插管激發(fā)的方式能夠達到霧化激發(fā)建模效果；BALF細胞總計數(shù)中，各哮喘組中除20-ITI組外BALF細胞總數(shù)升高明顯，經口氣管插管激發(fā)小鼠哮喘模型細胞總數(shù)與霧化激發(fā)哮喘模型沒有明顯差異，同時經口氣管插管激發(fā)組的數(shù)據(jù)標準差小于霧化激發(fā)組，表明經口氣管插管激發(fā)哮喘模型組內數(shù)據(jù)離散程度低于霧化激發(fā)哮喘模型組，穩(wěn)定性較好；在BALF嗜酸性粒細胞分類計數(shù)中，各哮喘組其嗜酸性粒細胞計數(shù)均高于對照組，且在100μg OVA致敏劑量下，經口氣管插管激發(fā)組中BALF嗜酸性粒細胞計數(shù)高于霧化激發(fā)方式；血清總IgE水平檢測表明，經口氣管插管激發(fā)比霧化激發(fā)建立的小鼠哮喘模型更好的提升其血清總IgE含量，同時結合BALF中嗜酸性粒細胞總數(shù)提高，表明經口氣管插管激發(fā)較霧化激發(fā)更易引起哮喘小鼠的過敏性質；肺組織病理切片HE染色結果表明，經口氣管插管激發(fā)與霧化激發(fā)均可在小鼠哮喘模型引起氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤，浸潤程度無差異，而在糖原PAS染色中，可明顯發(fā)現(xiàn)經口氣管插管激發(fā)建立的小鼠哮喘模型其氣管比霧化激發(fā)可以引起較多的粘液分泌，在Masson染色中，經口氣管插管激發(fā)小鼠哮喘模型其氣道周圍纖維增生較霧化激發(fā)有增多趨勢，但兩種激發(fā)方式與對照組無統(tǒng)計學差異；各哮喘模型組中各指標數(shù)據(jù)中的標準差SD值結果顯示，經口氣管插管激發(fā)所建哮喘模型SD值低于霧化激發(fā)所建哮喘模型，表明前者組內數(shù)據(jù)離散程度小，所建小鼠哮喘模型更穩(wěn)定。

同時，研究結果發(fā)現(xiàn)，20μg霧化激發(fā)組與20μg經口氣管插管激發(fā)組只是在激發(fā)階段給藥方式上有差異，其致敏階段給藥劑量和方式一致，但這兩組實驗結果在氣道高反應性、氣道炎癥、氣道粘液分泌和血清總IgE水平升高方面均有明顯差異，從而提示20 μg OVA致敏劑量經口氣管插管激發(fā)不能完全引發(fā)氣道哮喘炎癥。在霧化激發(fā)組中，20μg和100μg OVA組在激發(fā)階段給藥方式和劑量完全一致，僅在致敏階段藥物劑量上有所差異，但它們均能成功建立哮喘模型，并在氣道高反應性、氣道炎癥、氣道粘液分泌以及血清總IgE水平無明顯差異，提示致敏階段致敏劑量的差異對哮喘模型建立影響不大。在100μg OVA致敏劑量下，經口氣管插管激發(fā)組與霧化激發(fā)組在致敏階段途徑和劑量完全一致，僅在激發(fā)階段給藥方式有差異，但前者的嗜酸性粒細胞絕對值、血清總IgE水平、氣道粘液水平均明顯升高，提示激發(fā)階段使用經口氣管插管激發(fā)直接作用于氣道更易引發(fā)機體變態(tài)反應和氣道粘液高分泌。

綜上所述，經口氣管插管激發(fā)方式可以在100 μg OVA致敏劑量時成功的建立小鼠哮喘模型，該小鼠哮喘模型具有明顯氣道高反應性、氣道炎癥、氣道粘液高分泌和血清高IgE水平，同時與霧化激發(fā)小鼠哮喘模型相比，該模型差異性小，穩(wěn)定性更高。