工業(yè)分枝桿菌植物甾醇轉(zhuǎn)化途徑及菌種改造研究進展

李 欣， 成細瑤， 彭 飛， 陳 甜， 黃永棋， 蘇正定

工業(yè)發(fā)酵教育部重點實驗室和湖北省工業(yè)微生物重點實驗室;湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068

甾類化合物在結(jié)構(gòu)上是以環(huán)戊烷多氫菲為母核，包括三個六元環(huán)、一個五元環(huán)，和一系列不同的取代基組成。取代基的種類、構(gòu)型與取代位點決定了不同甾類化合物的性質(zhì)與功能[1]。自二十世紀(jì)九十年代以來，國際市場甾體類藥物的銷售額每年以10%-15%的速度遞增，2020年全球甾體類藥物銷售額預(yù)計將達到1 500億美元(http://www.chyxx.com/industry/202005/860576.html)。目前，甾體類藥物是僅次于抗生素的第二大類化學(xué)藥。甾體類藥物的高需求促進了甾體類藥物中間體的提取與制備的發(fā)展。在微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)甾體藥物中間體的工藝技術(shù)成熟之前，以植物中薯蕷皂素作為低廉工業(yè)原料進行化學(xué)合成制備的工藝技術(shù)占據(jù)著主導(dǎo)地位。但隨著資源的限制和環(huán)保壓力，目前國際上甾體藥物的主要生產(chǎn)方式是以微生物轉(zhuǎn)化法合成起始原料，然后經(jīng)過必要的化學(xué)修飾和藥性改造。與傳統(tǒng)化學(xué)法相比，微生物轉(zhuǎn)化法具有周期短、收率高、專一化強、立體選擇性和區(qū)域選擇性好以及污染小、條件溫和等優(yōu)勢[2]。

對能夠降解甾醇的微生物的研究始于70多年前。后來，研究進一步發(fā)現(xiàn)屬于放線菌屬的微生物，如分枝桿菌、紅球菌，具有降解膽固醇的能力，并具有合成新類固醇衍生物的潛力[3]。此后，其他一些細菌，如諾卡氏菌屬、節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬、鏈霉菌屬、微桿菌屬、沙雷菌屬、無色桿菌屬、假單胞菌屬和魚精胺桿菌屬等，也被報道可部分或完全地降解膽固醇[4-9]。

甾醇代謝微生物的發(fā)現(xiàn)為甾體藥物的生產(chǎn)提供了新的思路。1952年，美國普強藥業(yè)利用黑根霉轉(zhuǎn)化孕酮，將原本復(fù)雜的化學(xué)合成簡化為3步且收率達到了90%[10]。隨后，人們又相繼發(fā)現(xiàn)某些菌株可以使甾體化合物在特定位點發(fā)生反應(yīng)，例如新月彎孢霉可以對C11位進行羥基化[11]，亞麻刺盤孢(Colletotrichumlini)ST-1 還可以羥化黃體酮(EP)生成產(chǎn)物15α-OH-EP[12]。自此，微生物轉(zhuǎn)化在甾體藥物生產(chǎn)中的巨大應(yīng)用潛力開始顯現(xiàn)出來(圖1)。

圖1 甾體化合物生物轉(zhuǎn)化位點及主要產(chǎn)物

目前，利用微生物開展甾體化合物轉(zhuǎn)化的主要反應(yīng)有母核的羥化和脫氫以及側(cè)鏈的降解等。因為微生物自身含有豐富多樣的酶系，所以轉(zhuǎn)化反應(yīng)并不總是以單一的形式發(fā)生。因此，利用一種微生物轉(zhuǎn)化多種反應(yīng)是可能的。例如新月彎孢霉除了可以使甾體化合物發(fā)生11β-羥基化反應(yīng)，將化合物S轉(zhuǎn)化為氫化可的松外，還可以使甾體化合物發(fā)生側(cè)鏈降解，將黃體酮轉(zhuǎn)化為雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)[13]。但是，甾體化合物最終會被微生物分解成二氧化碳和水，因此要對轉(zhuǎn)化反應(yīng)進行適當(dāng)?shù)目刂啤ｋS著科技的發(fā)展，改造菌株的代謝途徑成為了可能。本文對工業(yè)分枝桿菌植物甾醇轉(zhuǎn)化途徑及菌種改造的研究進展進行了綜述。

1 甾醇代謝的分子機制

甾體化合物的降解是有氧代謝。早在20世紀(jì)八九十年代，研究人員就根據(jù)降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物來研究可能的代謝途徑。VAN DER GEIZE R團隊發(fā)現(xiàn)了紅球菌和分枝桿菌降解甾醇的關(guān)鍵基因簇，并且闡釋了一些關(guān)鍵基因的功能[14-16]。目前，典型的分枝桿菌已經(jīng)完成了全基因組測序[14, 17]。通過分析分枝桿菌基因的功能，已經(jīng)初步闡明了甾醇降解反應(yīng)的基本機制。甾醇降解的過程主要分為甾醇分子的攝取、母核的開環(huán)、開環(huán)甾醇的降解和側(cè)鏈的氧化四個步驟。

分枝桿菌中甾體的攝取與轉(zhuǎn)運影響著底物的利用水平。有研究者提出了一種靈活的多組分中間相模型(FMCM)來描述分枝桿菌對甾醇的吸收方式[18]。因為分枝桿菌的細胞外膜很厚，甾醇分子很難直接穿過。因此他們指出在分枝桿菌中應(yīng)該有特定的蛋白質(zhì)在甾醇的結(jié)合或轉(zhuǎn)運中起作用，從而促進甾醇分子的跨膜傳輸。其中，膽固醇氧化酶(ChO)是一種參與甾醇攝取的界面酶，促進了甾醇的轉(zhuǎn)運過程[18]。此外有研究表明，部分微生物的壁膜中含有能夠?qū)︾薮挤肿愚D(zhuǎn)運的蛋白Mce4(Mammalian cell entry 4)。例如在分枝桿菌、諾卡氏菌、紅球菌和部分鏈霉菌中均有發(fā)現(xiàn)存在Mce4攝取甾醇的機制[19]。

甾醇的初步氧化是在膽固醇氧化酶和3β-羥基脫氫酶(3β-HSD)兩個關(guān)鍵酶的作用下開啟的。MycobacteriumneoaurmATCC 25795有兩種ChO同工酶(ChoM1和ChoM2)。當(dāng)缺失ChoM2時，菌株基本失去了氧化甾醇3β-羥基的能力[20]。但近年來，有研究小組提出在M.smegmatismc2155 和M. sp. VKM Ac-1815D等菌中普遍存在的ChoD不是甾醇氧化為甾酮的關(guān)鍵酶，因為ChoD失活的突變體菌株仍然保留了轉(zhuǎn)化甾醇為甾酮的能力[21, 22]。3β-Hsd反應(yīng)時需要NAD或NADP作為輔酶，目前發(fā)現(xiàn)該酶在M.tuberculosis與M.smegmatismc2155兩種菌株中是氧化甾醇的關(guān)鍵酶[22, 23]。近期，我們在M.neoaurumHGMS2 菌種中發(fā)現(xiàn)，敲除ChoM1,ChoM2和HSD對膽固醇降解沒有明顯影響(數(shù)據(jù)發(fā)表中)。在放線菌中甾醇的側(cè)鏈降解和母核氧化是相對獨立的過程，甚至在同一種菌中這兩個過程的順序也是不同的[24,25]。甾醇母核氧化分為兩種，分別是羥化反應(yīng)和脫氫反應(yīng)。其中，以羥化反應(yīng)為主。細胞色素P450依賴性單加氧酶是甾醇羥化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，以游離或者膜結(jié)合形式存在。這種酶可以在底物分子中增加一個氧原子，另一個氧原子則用于氧化還原型輔酶Ⅰ(NADH)或還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，反應(yīng)如下：RH + NADPH + O2→ ROH + NADP++ OH-[26]。3-甾酮-9α-羥化酶(KSH)也是參與母核氧化的關(guān)鍵酶。KSH由兩部分組成，分別為末端加氧酶KshA和鐵硫還原酶KshB。此外KSH還需要輔酶NADH與FAD參與反應(yīng)。KSH的主要功能是催化甾體母核B環(huán)，在C9位引入羥基。3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KstD)催化甾體分子母核A上1，2位的脫氫反應(yīng)，與上述的KSH共同作用下，會引起母核B環(huán)的裂解。大多數(shù)KstD偏好4-烯-3-酮結(jié)構(gòu)的底物，而KstDH37Rv最適底物是具有3-酮-(5α)-甾體結(jié)構(gòu)[27]。研究者推測M.tuberculosis在降解甾體過程中與另一類3-甾酮-Δ4-(5α)-脫氫酶協(xié)同作用，經(jīng)歷了5α-睪酮，5α-AD，1-(5α)-AD，ADD等中間代謝物后才解體[27]。

微生物對甾醇的側(cè)鏈降解反應(yīng)是一類具有重要生理意義的反應(yīng)，其地位僅次于甾醇的羥化。甾醇分子側(cè)鏈降解的過程類似于脂肪的β氧化，反應(yīng)的復(fù)雜性由側(cè)鏈的長短決定。以膽固醇生成產(chǎn)物AD為例，過程中涉及了20多種酶的催化。研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)鏈降解開始于以細胞色素P450加氧酶催化C26位的末端氧化，再經(jīng)過?；鵆oA鏈接酶(FadD)催化末端酰基化，之后會進入微生物的脂肪酸β-氧化過程[28]。雖然在任何一種降解甾醇的細菌中，膽固醇的分解代謝還沒有完全闡明，但可以通過結(jié)合不同物種的生化和遺傳學(xué)研究來推測出較為完整的膽固醇代謝途徑[29]。

2 甾醇代謝途徑的基因改造

2.1 底物的攝取和轉(zhuǎn)運的強化

一般認(rèn)為生物接觸是微生物攝取環(huán)境中的甾醇的主要方式。微生物中甾醇降解基因簇中的Mce4轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對甾醇的主動攝取有影響。在R.jostiiRHA1中，當(dāng)Mce4部分或整體缺失時，缺陷型菌株不再利用膽固醇、β-谷甾醇等底物來生長。但是，如果以AD或者黃體酮為底物時，Mce4缺陷型菌株的生長不受影響[14, 30]。

分枝桿菌含有一層非常厚且疏水的細胞包膜，其細胞壁結(jié)構(gòu)也很復(fù)雜，由peptidoglycan (PG), arabinogalactan和mycolic acids組成(圖2)。因此，分枝桿菌的細胞外膜形成了一個屏障，阻止外源甾醇進入細胞，但其良好的疏水性可以溶解和存儲甾醇。WEI等[31]通過對kasB這一非必需基因進行了修飾。kasB基因的缺失降低了細胞壁的緊密性，從而使細胞通透性增加，增強了甾醇的轉(zhuǎn)運。對于另一種物質(zhì)PG，在以往的研究中，萬古霉素和甘氨酸是在革蘭氏陽性菌生長過程中作用于PG生物合成的兩種有效抑制劑。經(jīng)萬古霉素和甘氨酸處理后，增強了分枝桿菌轉(zhuǎn)化膽固醇的活性。這些研究表明，PG的合成可能成為分枝桿菌基因工程改造的一個潛在靶點，通過改變細胞壁的特性來提高分枝桿菌甾醇的轉(zhuǎn)化率。在分枝桿菌中，有兩種特征性的B類青霉素結(jié)合蛋白(PBPA和PBPB)，它們在調(diào)節(jié)PG的生物合成從而在促進細胞分裂和形狀維持方面發(fā)揮著重要的作用。SUN等[32]對pbpA和pbpB基因進行修飾，發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩者任意一個基因失活時，細胞轉(zhuǎn)化甾醇的能力降低。相反，增強pbpB基因的表達可以促進甾醇的轉(zhuǎn)化。還有研究報道表明，編碼海藻糖單肌酸轉(zhuǎn)運體基因mmpL3的失活，使M.neoaurum中植物甾醇的消耗量增加了15.6%[33]。

圖2 分枝桿菌細胞壁結(jié)構(gòu)及膽固醇分解途徑

2.2 母核3-位羥基氧化反應(yīng)

甾醇母核反應(yīng)的第一步是由ChO和3β-HSD開啟的。ChOs在催化甾醇的過程中，通常結(jié)合到細胞膜表面，從細胞膜接觸底物[34]。與膽固醇、植物甾醇不同，膽固酮等這類甾體化合物不會結(jié)合在細胞膜中[35]。所以，甾醇經(jīng)ChO氧化后，經(jīng)從細胞膜上釋放出來，進入細胞質(zhì)。這就意味著ChO的氧化過程可以促進分枝桿菌吸收環(huán)境中甾醇。因此，過表達產(chǎn)AD的分枝桿菌NwIB-R10中的ChO可以將AD的產(chǎn)量從1.08 g/L提高到了1.65 g/L[20]。當(dāng)敲除M.neoaurmATCC 25 795中的ChOM1或者ChOM2，缺陷菌株的甾醇攝取與代謝速率都明顯降低。這表明甾醇氧化為甾酮是代謝途徑中關(guān)鍵的限速步驟，提高該步驟酶的活性可以增強甾醇吸收，進一步提高分枝桿菌的轉(zhuǎn)化率。

2.3 側(cè)鏈降解

來源于紅球菌的?；鵆oA連接酶FadD19能夠催化膽固醇與膽甾-4烯-3酮的C26末端羧基產(chǎn)物的酯化反應(yīng)。WILBRINK[36]等人的研究表明，F(xiàn)adD19經(jīng)敲除后發(fā)現(xiàn)，對微生物代謝膽固醇沒有影響，而β-谷甾醇的代謝明顯受到抑制，表明FadD19僅能催化C24位末端羧基產(chǎn)物的酯化反應(yīng)。最后一輪β氧化中酶的反應(yīng)效率會影響C19代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[15]，所以對側(cè)鏈降解的酶促反應(yīng)研究也很重要。THOMAS等[37]敲除了基因簇中的igr操縱子，推測出催化最后一輪β氧化的脫氫、水合和硫解反應(yīng)的酶，包括FadE2-29、Rv3541-42c、Ltp2。GRIFFIN等[38]采用高密度誘變和深度測序相結(jié)合的方法，對不同條件下復(fù)雜突變庫的組成進行了表征，發(fā)現(xiàn)分枝桿菌參與側(cè)鏈代謝的基因，包括ltp2、fadE29、fadE28、fadA5、fadE30、fadE32、fadE33、fadE34和hsd4B。除了將脂肪酸支鏈完全降解產(chǎn)生4-AD之外，目前還發(fā)現(xiàn)支鏈降解途徑有其他的分支，例如發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)物HBC的積累。因此對甾醇支鏈降解機制的深入研究是非常必要的。

2.4 母核降解機制—9,10-甾體中間體途徑

除了ChO之外，KstD和KSH是母核代謝中另外兩種重要的酶。然而，當(dāng)這兩種酶同時存在時，會導(dǎo)致甾體母核B環(huán)的裂解。以往的研究表明，加入抑制劑(如8-羥基喹啉)可以防止甾體母核的斷裂[39]，但抑制劑對側(cè)鏈降解的相關(guān)酶也會有一定的影響。另外，利用誘變技術(shù)產(chǎn)生突變體，也可以使甾醇不被完全降解。例如李瑩等[40]通過紫外誘變與激光誘變相結(jié)合的方式處理一株產(chǎn)AD的分枝桿菌，結(jié)果AD的收率提高了116%，且沒有ADD產(chǎn)生。BRZOSTEK等[41]確定KsdD-1是恥垢分枝桿菌的主要KsdD，在膽固醇降解過程中，KsdD-1的破壞導(dǎo)致AD或9-0H-AD的積累。WEI等[42]人對一株產(chǎn)AD和ADD混合物的M.neoaurumNwIB-01進行了基因改造。他們發(fā)現(xiàn)敲除KstD基因可以富集中間體AD；相反，強化KstD的表達則可以富集中間體ADD。從而，大大降低了后續(xù)產(chǎn)物分離純化的難度。

3 討論與展望

目前為止，通過對微生物代謝甾醇途徑的關(guān)鍵基因進行改造，已經(jīng)實現(xiàn)了不同甾體藥物中間體的積累。但是所得到的中間體多是C19類化合物，C21以及C22類中間體的積累還需要更深入的研究。由于對甾醇側(cè)鏈降解所涉及的酶沒有全面的了解，目前甾醇的側(cè)鏈降解反應(yīng)只能在微生物的全細胞內(nèi)進行，還不能實現(xiàn)純酶催化。分枝桿菌細胞膜的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，盡管細胞膜缺陷的分枝桿菌細胞表現(xiàn)出更強的甾醇轉(zhuǎn)化活性，但由于細胞生長受損，整體生產(chǎn)力并沒有顯著的提高。因此，細胞壁性質(zhì)與甾醇代謝能力之間的關(guān)系還需要進一步的研究[32]。ChO與甾醇攝取運輸機制的相關(guān)性一直是研究的主要內(nèi)容之一。李園園等研究者[43]從分枝桿菌中鑒定相關(guān)的基因并敲除后，發(fā)現(xiàn)甾醇的代謝途徑并不受影響，或許有其他關(guān)鍵基因沒有并發(fā)現(xiàn)。因此，關(guān)于ChO在分枝桿菌攝取甾醇的過程中所起的作用仍然不是很清楚[20, 21]。雖然一些典型的分枝桿菌已經(jīng)完成了全基因組測序，甾醇代謝的基本途徑已經(jīng)被初步推斷出來，但參與甾醇代謝的相關(guān)酶系還需要更多的研究來進一步鑒定。近年來，甾體藥物的微生物發(fā)酵工藝已經(jīng)不斷地改進，應(yīng)用了很多對甾醇代謝微生物分子改造方面的成果。相信，隨著微生物代謝甾醇的機制及其功能簇基因不斷被揭示，微生物轉(zhuǎn)化法在甾體藥物的生產(chǎn)中將發(fā)揮越來越重要的作用。