動(dòng)物源食品中氨曲南殘留檢測方法的建立

閻玉林，王世永，陳 玲，李桂華，章安源，李冬曉，張?zhí)K蘇

(1.青島譜尼測試有限公司，山東青島 266100；2.福州市海洋與漁業(yè)技術(shù)中心，福州 350007；3.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250010；4.山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南 250010)

氨曲南(aztreonam)是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素，常作為氨基糖苷類藥物的替代品，用于治療腎功能損害患者的需氧革蘭氏陰性菌感染；也可在密切觀察情況下用于對(duì)青霉素、頭孢菌素過敏的患者[1-3]。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《2018年獸醫(yī)工作要點(diǎn)》的要求，獸用抗生素的監(jiān)控將越來越嚴(yán)格。從耐藥性上考慮，將氨曲南列為12類不宜被批準(zhǔn)使用的獸藥抗生素。

目前，國內(nèi)外關(guān)于氨曲南檢測的研究主要集中在兩方面，一是對(duì)于氨曲南原藥及其副產(chǎn)物的研究[4-7]；二是研究氨曲南在人體血液和尿等組織中的代謝規(guī)律[8-10]。而動(dòng)物源食品中氨曲南的測定鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)針對(duì)動(dòng)物源食品基質(zhì)復(fù)雜，樣品前處理繁復(fù)、不易檢測等問題，采用磷酸鹽緩沖溶液提取，固相萃取柱凈化樣品，建立了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定動(dòng)物源食品中的氨曲南殘留量的方法，有效解決了動(dòng)物源食品中氨曲南不易測定的難題，彌補(bǔ)了該項(xiàng)工作的空白。方法的建立將對(duì)打擊違法濫用藥物，保障動(dòng)物源性食品質(zhì)量安全具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 Waters Xevo TQ-S micro液質(zhì)聯(lián)用儀(Waters公司)；JY3002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；XW-80A旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；IKA T18 basic組織勻漿機(jī)(德國IKA)。

氨曲南，批號(hào)130507-201303，純度96.9%，購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、甲酸(純度98%，北京百靈威科技有限公司)；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉(分析純，青島合力興化玻有限公司)；一級(jí)水(電阻率≥18 MΩ·cm)；固相萃取柱：SBEQ-CA6685 CNW Poly-Sery HLB Pro SPE，(200 mg，6 mL)(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，0.22 μm疏水型PTFE聚四氟乙烯微孔濾膜(天津領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備股份有限公司)，高純氮、高純氬(純度均為99.999%，青島長松氣體有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取適量氨曲南標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000 μg/mL)，避光儲(chǔ)存于冰箱中(-18 ℃)備用，有效期3個(gè)月。

1.3 儀器條件 Agilent SB-AQ(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，B相：甲醇，梯度洗脫條件：20% B保持0.5 min，在1.0 min內(nèi)線性增至50% B，保持0.5 min，在0.3 min內(nèi)線性增至80% B，保持1 min，在0.5 min內(nèi)線性增至95% B，保持1 min，然后降至20% B，保持1 min; 流速: 0.35 mL/min；進(jìn)樣量:5 μL；柱溫:30 ℃。

質(zhì)譜條件：ESI源負(fù)離子模式電離；反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓：2.4 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；脫溶劑氣溫度：500 ℃：錐孔氣流速：50 L/h；二級(jí)碰撞氣：氬氣。定量離子對(duì)為m/z=434.06/95.94，定性離子對(duì)為m/z=434.06/121.81，錐孔電壓為20 V，碰撞能量分別為20 eV和30 eV。

1.4 樣品前處理 稱取(5.00±0.05)g樣品，置于50 mL玻璃離心管內(nèi)，加10 mL 0.15 mol/L磷酸二氫鈉(pH=7.0)提取液，勻漿1 min，提取15 min，8000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，剩余殘?jiān)貜?fù)提取，再加入10 mL提取液，重復(fù)提取一遍，合并提取液，作為備用液。

HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇，5 mL水和5 mL 0.15 mol/L磷酸二氫鈉(pH=7.0)活化，取10 mL備用液過固相萃取柱，用5 mL 水淋洗，然后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮吹至近干。加2 mL 0.1%甲酸甲醇/水溶液(50∶50，v/v)復(fù)溶，充分渦旋混勻，8000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性考察 質(zhì)譜定量結(jié)果的準(zhǔn)確性受基質(zhì)的影響，在沒有內(nèi)標(biāo)的情況下一般需要配制基質(zhì)標(biāo)曲，取空白樣品(檢測結(jié)果為陰性的雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉、魚肉)按照1.4進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液配制成1、2、5、10、20 ng/mL的氨曲南標(biāo)準(zhǔn)工作液, 以待測物的濃度為橫坐標(biāo), 色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.995，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1，說明在1～20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，線性良好。

表1 不同動(dòng)物組織中添加氨曲南的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的檢出限和定量限 檢出限和定量限采用空白組織(檢測結(jié)果為陰性的雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉、魚肉)中添加氨曲南的方法，按照1.4的方法處理樣品進(jìn)行測定，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到特征離子色譜峰信噪比大于或等于3(S/N≥3)的最低濃度為1.0 μg/kg，即方法的檢出限，信噪比大于或等于10(S/N≥10)且回收率和精密度較好的濃度為2.0 μg/kg，即方法的定量限。

2.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度 在空白雞肉樣品(檢測結(jié)果為陰性的樣品)中添加2.0、4.0、10.0 μg/kg的氨曲南進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，各添加水平進(jìn)行6個(gè)樣品的平行試驗(yàn)，測得氨曲南的準(zhǔn)確度和精密度，空白雞肉樣品添加氨曲南后得到的特征離子質(zhì)量色譜圖如圖1所示。本方法同時(shí)考察了雞蛋、雞肝、豬肉、魚肉等動(dòng)物性食品中氨曲南適用性，數(shù)據(jù)顯示本方法在空白加標(biāo)樣品中的回收率為70 %～110 %，批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均未超過10 %，說明重現(xiàn)性良好，該方法比較穩(wěn)定，數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 方法的準(zhǔn)確度和精密度(n=6)

圖1 空白雞肉中添加2.0 μg/kg氨曲南的特征離子質(zhì)量色譜圖

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化 試驗(yàn)考察了5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈，5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇，0.1%甲酸水溶液-甲醇，0.1%甲酸水溶液-乙腈和水-甲醇等5種流動(dòng)相體系對(duì)分析效果的影響。當(dāng)采用0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物色譜峰對(duì)稱性好，響應(yīng)強(qiáng)度高，保留時(shí)間和色譜峰面積重復(fù)性好，因此選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相。氨曲南標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖見圖2。

圖2 氨曲南的總離子流圖

3.2 提取條件的選擇 參考文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于β-內(nèi)酰胺類抗生素的實(shí)驗(yàn)條件[11-15]，通常采用乙腈、乙腈/水溶液(15∶2，v/v)、乙腈/水溶液(80∶20，v/v)、0.15mol/L磷酸二氫鈉(pH=8.5)、0.15mol/L磷酸二氫鈉(pH=7.0)和0.15mol/L磷酸二氫鈉(pH=5.0)，經(jīng)過陰性樣品添加，通過回收率來選擇最佳的提取條件。結(jié)果顯示，含乙腈的提取液回收率均低于10%，分析原因可能是氨曲南微溶于乙腈溶液導(dǎo)致；另外一個(gè)原因是采用含乙腈的提取液整個(gè)過程繁瑣，容易導(dǎo)致目標(biāo)化合物降解或損失。β-內(nèi)酰胺類抗生素以磷酸鹽緩沖液作為提取液的檢測方法，大都選擇pH保持在8.0～9.0，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氨曲南在中性條件下穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.15mol/L磷酸二氫鈉(pH=7.0)作為提取液。

實(shí)驗(yàn)也考察了提取液用量、提取方法和提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響，經(jīng)過優(yōu)化，當(dāng)稱樣量為5.00 g時(shí)，用10 mL 0.15 mol/L磷酸二氫鈉(pH=7.0)，提取兩次為最佳，平均回收率可以達(dá)到80%左右。同時(shí)考慮提取液用量過大，會(huì)增加后續(xù)凈化濃縮等步驟的難度，且不利于環(huán)保。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室常用的提取方法，超聲提取和震蕩提取對(duì)于氨曲南的回收率基本相同，不同提取方法對(duì)回收率的影響不大。

3.3 固相萃取柱的選擇 實(shí)驗(yàn)主要是針對(duì)動(dòng)物源食品，基質(zhì)復(fù)雜，而且是采用磷酸鹽緩沖溶液提取，為了達(dá)到更好的富集和凈化效果，因此需要增加凈化處理步驟。實(shí)驗(yàn)主要考察了常用的MAX，C18和HLB三種不同極性的固相萃取柱。配制濃度為10 ng/mL的氨曲南磷酸鹽緩沖溶液，通過直接過固相萃取柱凈化的方式考察其回收率。結(jié)果顯示：MAX和C18固相萃取柱對(duì)氨曲南不保留，回收率接近為0，而HLB固相萃取柱的凈化效果好，平均回收率在80%左右，因此實(shí)驗(yàn)選擇HLB固相萃取柱對(duì)樣品做進(jìn)一步的凈化處理。

3.4 定容液的確定 實(shí)驗(yàn)對(duì)比了水，甲醇，乙腈，乙腈/水溶液(50∶50，v/v)，乙腈/水溶液(20∶80，v/v)，甲醇/水溶液(50∶50，v/v)和0.1%甲酸甲醇/水溶液(50∶50，v/v)等7種不同的定容液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，含乙腈的定容液氨曲南出兩個(gè)峰，峰型差，因此不建議使用含乙腈的溶液作為定容液。當(dāng)采用0.1%甲酸甲醇/水溶液(50∶50，v/v)作為定容液時(shí)，氨曲南的響應(yīng)最高，因此本實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸甲醇/水溶液(50∶50，v/v)作為定容液。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 基質(zhì)效應(yīng)是影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素，實(shí)驗(yàn)通過比較溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的影響。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：將1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.2)用0.1%甲酸甲醇/水溶液(50∶50，v/v)稀釋至5 ng/mL，得溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取(5.00±0.05)g空白組織(雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉和魚肉)各5份，按1.4項(xiàng)方法處理后獲得相應(yīng)組織空白基質(zhì)溶液，取適量標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液將其稀釋至5 ng/mL，得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將5 ng/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3項(xiàng)的儀器條件進(jìn)樣測試，所得峰面積均值和RSD如表3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同動(dòng)物源組織的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，均存在不同程度的基質(zhì)抑制作用，因此本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量校正。

表3 不同動(dòng)物組織中檢測氨曲南的基質(zhì)效應(yīng)研究

3.6 結(jié)論 試驗(yàn)采用磷酸鹽緩沖溶液作為提取液, 經(jīng)過固相萃取柱凈化, 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測, 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。該方法樣品前處理簡單、耗時(shí)短、有機(jī)溶劑用量少, 而且測試數(shù)據(jù)重復(fù)性好, 回收率高, 精密度和準(zhǔn)確度均能滿足食品理化分析的要求, 適用于雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉和魚肉等動(dòng)物源性食品中氨曲南的日常檢測，也可為其它動(dòng)物組織中氨曲南的測定提供參考。