基于植物廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)探究小米粥中酚類(lèi)化合物組成及其抗氧化性

康子悅，沈 蒙，葛云飛，王 娟，全志剛，肖金玲，王維浩,2，曹龍奎,2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

小米（Setaria italicaBeauv.），原名粟，在世界谷物產(chǎn)量中排名第6，我國(guó)黃河中上游為主要栽培區(qū)[1]?！侗静菥V目》中記載，小米“治反胃熱痢，煮粥食，益丹田，補(bǔ)虛損，開(kāi)腸胃”。中醫(yī)亦講小米“和胃溫中”，認(rèn)為小米粥具有清熱解渴、健胃除濕、補(bǔ)虛損和健胃消食等功效。

多酚類(lèi)化合物具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老、預(yù)防或減少疾病的發(fā)生等作用，是世界上最廣泛的膳食補(bǔ)充劑之一。多酚類(lèi)化合物是小米中最主要的功能性成分之一，同樣具有上述功能特性[2-3]。小米中含有游離和共軛形式的酚酸，包括羥基苯甲酸和羥基肉桂酸的衍生物；還含有黃酮類(lèi)化合物，包括黃酮、黃烷酮、異黃酮等。此外，部分小米中還含有少量的單寧類(lèi)物質(zhì)[4-5]。小米粥作為家庭常吃的一種粥品，具有開(kāi)腸胃、反胃熱痢、健胃消食等養(yǎng)胃功能。而多酚類(lèi)化合物作為一種功能因子存在于小米粥中，不僅具有抗氧化、抗腫瘤等作用，還具有修復(fù)胃黏膜損傷、提高胃腸動(dòng)力和預(yù)防胃腸道疾病等功能，因此酚類(lèi)化合物可能是小米粥養(yǎng)胃的功能因子之一。

現(xiàn)階段，對(duì)于小米和小米粥中酚類(lèi)化合物的研究停留在提取工藝、抗氧化能力測(cè)定及加工對(duì)總多酚或幾種酚類(lèi)物質(zhì)的影響階段。魏春紅等[6]采用酶法輔助提取小米多酚，結(jié)果表明液料比14∶1 （mL/g）、雙酶添加量0.9%、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度40 ℃為最佳提取工藝。延莎等[7]測(cè)定不同米色的小米多酚類(lèi)化合物的抗氧化能力，結(jié)果表明晉谷21抗氧化能力最強(qiáng)。張玲艷等[8]探究蒸煮對(duì)小米多酚及抗氧化活性的影響，結(jié)果表明煮小米中總多酚的保留率較高。Geetha等[9]采用酶法-超聲法協(xié)同萃取小米糠中多酚類(lèi)化合物，該方法的提取率是常規(guī)法的2 倍，且抗氧化能力也隨之提高。Hithamani等[10]提取的小米多酚總量為10.2 mg/g，發(fā)芽或壓力蒸煮后多酚含量下降了50%，而開(kāi)鍋蒸煮后其多酚含量?jī)H下降12%～19%。Taylor等[11]分析了脫皮、蒸煮、發(fā)芽后小米中多酚類(lèi)化合物的變化，結(jié)果表明食品加工會(huì)降低多酚類(lèi)化合物的含量。其中熱處理影響復(fù)雜，可能是在此過(guò)程中發(fā)生結(jié)合酚的釋放和多酚的解聚。

目前，小米經(jīng)過(guò)煮制后酚類(lèi)化合物含量和抗氧化能力變化的趨勢(shì)鮮見(jiàn)報(bào)道，在此過(guò)程中，保持高含量或在體內(nèi)具有重要作用的多酚類(lèi)化合物種類(lèi)也鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用定性準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好的植物廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)探究小米粥中酚類(lèi)化合物的組成，并分析差異組分，以期為人們提供簡(jiǎn)便且更為合理的小米粥煮制方式，更為進(jìn)一步探究小米粥中酚類(lèi)化合物對(duì)胃的保護(hù)機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)功能性食品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米（品種為東方亮，產(chǎn)地為山西省，粒徑均勻，顏色金黃，有光澤，無(wú)霉?fàn)€碎米） 市售；石油醚、丙酮、乙酸乙酯（均為分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；沒(méi)食子酸（標(biāo)準(zhǔn)品）、無(wú)水碳酸鈉、Folin-Ciocalteu上海市麥克林生化科技有限公司；總抗氧化試劑盒 南京建成生物工程研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 梯希愛(ài)（上海）化學(xué)工業(yè)發(fā)展有限公司；甲醇、乙腈 美國(guó)Honeywell公司；甲酸 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-10A高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；Specord 210 plu紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 德國(guó)耶拿儀器有限公司；DGG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；AR2140電子天平、DSC1型差示掃描量熱儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TD5A-WS臺(tái)式離心機(jī) 湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；1290超高效液相色譜儀、6490 Series三重四極桿質(zhì)譜儀 安捷倫科技有限公司；Triple TOF 6600高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX公司；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mmh 100 mm，18 μm） 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米粥最佳煮制工藝優(yōu)化

1.3.1.1 單因素試驗(yàn)

以小米粥多酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行3因素4水平的單因素試驗(yàn)，料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），煮制時(shí)間15、18、21、24 min，煮制功率500、700、900、1 100 W，以此優(yōu)化小米粥煮制工藝。在選擇不同因素時(shí)，其他固定條件分別為料液比1∶20（g/mL）、煮制時(shí)間15 min、煮制功率500 W。

1.3.1.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素4水平正交試驗(yàn)，確定小米粥最佳煮制工藝參數(shù)，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 小米粥煮制工藝正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.1.3 小米粥淀粉糊化度的測(cè)定

取1 粒煮后的小米粥，平鋪于坩堝底部，擦拭坩堝邊緣。蓋上坩堝蓋密封，并采用壓樣器對(duì)坩堝進(jìn)行壓制，保證坩堝不偏且密封良好。于4 ℃冰箱中靜置12 h后放入差示掃描量熱儀中。取5 mg生小米粉（60 目）加入7 μL去離子水，平鋪于坩堝底部，其余操作同上。差示掃描量熱儀測(cè)定參數(shù)：氮?dú)饬髁繛?50 mL/min；壓力為0.1 MPa；升溫速率為5 ℃/min；從20 ℃升溫至100 ℃，利用電腦程序記錄差示掃描量熱曲線，并進(jìn)行對(duì)比分析[12]。

1.3.1.4 小米粥品質(zhì)的感官評(píng)定

取一定質(zhì)量的小米粥成品，由10 名專(zhuān)業(yè)人員組成評(píng)定小組，分別從小米粥的香味、口感、色澤、籽粒體態(tài)、米湯組織形態(tài)5 個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，10 名評(píng)定人員評(píng)定結(jié)果的平均值為最終評(píng)定結(jié)果，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示[13]。

表2 小米粥感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of millet porridge

1.3.2 小米粥總多酚的提取

小米粥冷凍干燥后使用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60 目篩。稱(chēng)取2 g原料加入25 mL 70%乙醇溶液超聲提取25 min后，4 000 r/min離心10 min。提取2 次后合并上清液，用于測(cè)定總多酚含量。

1.3.3 小米和小米粥游離酚的提取

采用Anoma[14]和Irakli[15]等的方法稍作修改。小米粥冷凍干燥后使用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎。稱(chēng)取2 g原料加入25 mL 70%丙酮溶液，超聲提取25 min后4 000 r/min離心10 min。提取2 次后合并上清液，冷藏備用。殘?jiān)糜诮Y(jié)合酚的提取。生小米采用同樣的方法提取游離酚作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 生小米和小米粥結(jié)合酚的提取

采用Anoma[14]和Irakli[15]等的方法稍作修改。向上述風(fēng)干的樣品中加入20 mL 4 mol/L NaOH溶液，避光水解4 h后用濃鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至2.0。4 000 r/min離心10 min。加入25 mL正己烷去酯2 次后加入25 mL乙酸乙酯充分混合，提取2 次后合并上層提取液，冷藏備用。小米采用同樣的方法提取結(jié)合酚作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 酚類(lèi)化合物含量的測(cè)定

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用Folin-Ciocalteu法[16]。稱(chēng)取10 mg沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，蒸餾水定容至100 mL，配成0.1 mg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1 mL Folin-Ciocalteu試劑，混勻后避光靜置2 min。加入2 mL 12% Na2CO3溶液，定容至100 mL。避光靜置2 h后于波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光度，做3 組平行。以沒(méi)食子酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.2 樣品酚類(lèi)化合物測(cè)定

1 mL提取液置于100 mL容量瓶中，加入1 mL Folin-Ciocalteu試劑，搖勻后避光靜置2 min。加入2 mL 12%的Na2CO3溶液，蒸餾水定容至刻度。避光靜置2 h后，于波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光度，做3 組平行。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量濃度（μg/mL，以沒(méi)食子酸計(jì)），含量按照式（1）計(jì)算[17]：

式中：M為多酚含量/（mg/g）；C為沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為提取液體積/mL；N為稀釋濃度；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.6 小米粥中游離酚和結(jié)合酚抗氧化能力檢測(cè)

1.3.6.1 總抗氧化能力檢測(cè)

采用總抗氧化能力試劑盒測(cè)定。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3 次。于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定OD值，總抗氧化能力按式（2）計(jì)算[17-18]：

式中：T為總抗氧化能力/（U/mL）；OD測(cè)量為樣品管中待測(cè)樣品光密度；OD對(duì)照為對(duì)照管中待測(cè)樣品光密度；V反為反應(yīng)液總體積/mL；V取為樣品取樣量/mL；A為樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力檢測(cè)

準(zhǔn)確稱(chēng)取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，無(wú)水乙醇定容至250 mL。樣品管中加入3 mL提取液和3 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液；本底管中加入3 mL提取液、3 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液和3 mL無(wú)水乙醇；空白管中加入3 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液和3 mL無(wú)水乙醇，做3 組平行。靜置70 min后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，清除率按式（3）計(jì)算[17-18]：

式中：S為DPPH自由基清除率/%；Ai為樣品吸光度；Aj為本底吸光度；A0為空白吸光度。

1.3.7 小米粥中游離酚和結(jié)合酚組分的鑒定

吸取6 mL提取液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL甲醇溶劑復(fù)溶。將混合樣品（QC）和樣品（生小米游離酚、小米粥游離酚、生小米結(jié)合酚、小米粥結(jié)合酚）置于4 ℃、13 000 r/min離心15 min。取上清液于進(jìn)樣瓶中。通過(guò)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)分析[19-21]。

儀器分析條件：Agilent液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器。色譜柱：HSS T3色譜柱（2.1 mmh 100 mm，1.8 μm）。色譜條件：流動(dòng)相A為0.1%甲酸、流動(dòng)相B為100%乙腈；梯度洗脫條件：0 m i n，9 8% A、2% B；0～10 min，98%～40% A、2%～60% B；10～12 min，40%～2% A、60%～98% B；12～13 min，2% A、98% B；13～13.1 min，2%～98% A、98%～2% B；13.1～15 min，98% A、2% B。流速400 μL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜條件：進(jìn)樣口溫度650 ℃；離子源溫度650 ℃；檢測(cè)范圍m/z5～1 250。

1.4 數(shù)據(jù)分析

煮制工藝、酚類(lèi)化合物含量及抗氧化水平測(cè)定使用Excel 2010進(jìn)行分析，每組數(shù)據(jù)進(jìn)行3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，用SPSS軟件進(jìn)行方差分析；利用MAPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行總峰面積歸一化處理；使用MEV4.9.0軟件繪制差異組分層次聚類(lèi)分析熱力圖；使用R語(yǔ)言進(jìn)行KEGG Passway富集分析并繪制代謝差異圖；使用SIMCA軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米粥煮制工藝的優(yōu)化

2.1.1 酚類(lèi)化合物含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.081 3x+0.005 8，R2＝0.998 4，具有較好的線性關(guān)系。

2.1.2 煮制時(shí)間對(duì)小米粥總多酚含量影響

如圖1所示，與生小米對(duì)比，隨著煮制時(shí)間的延長(zhǎng)，小米粥總多酚含量逐漸下降，且呈顯著性差異。小米粥各因素間也存在差異性，其中煮制15 min和煮制24 min呈現(xiàn)高度顯著差異。當(dāng)煮制時(shí)間為15 min時(shí)小米粥總多酚的含量最高。這是由于多酚類(lèi)化合物是一種熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚被氧化破壞或降解，導(dǎo)致其含量下降。這與Aguilera等[22]研究結(jié)果相符。

圖1 煮制時(shí)間對(duì)小米粥總多酚含量的影響Fig.1 Effect of cooking time on total phenolic content of millet porridge

2.1.3 煮制功率對(duì)小米粥總多酚含量影響

圖2 煮制功率對(duì)小米粥總多酚含量的影響Fig.2 Effect of cooking power on total phenolic content of millet porridge

如圖2所示，與生小米相比，隨著煮制功率的增加，小米粥總多酚的含量逐漸下降，且呈顯著差異。當(dāng)功率為500 W時(shí)小米粥總多酚的含量最高。其中，煮制功率500 W和1 100 W之間呈高度顯著差異。這是由于總多酚類(lèi)化合物熱穩(wěn)定差，隨著功率的增加，溫度也逐漸升高，導(dǎo)致總多酚含量下降。這與Gujral等[23]的研究結(jié)果相似。

2.1.4 料液比對(duì)小米粥總多酚含量影響

圖3 料液比對(duì)小米粥總多酚含量的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on total phenolic content in millet porridge

由圖3所示，與生小米相比，隨著液體用量的增加，小米粥多酚的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶25時(shí)小米粥總多酚的含量最高?？赡苁怯捎诹弦罕葹?∶25時(shí)小米保持良好的含水量，提高了總多酚的提取率。

2.1.5 煮制工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

表3 煮制工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design in terms of coded data with response

表4 傳統(tǒng)煮制萃取方差分析Table 4 Analysis of variance for the effect of cooking parameters on total phenolic content in millet porridge

根據(jù)R大小，判斷因素的主次順序?yàn)锳＜B＜C。由表3可知，最優(yōu)結(jié)果為A1B2C2，即時(shí)間15 min、料液比1∶25（g/mL）、功率700 W。由表4可知，B、C對(duì)小米粥總多酚含量影響顯著（P＜0.05）。將最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得小米粥總多酚含量平均值為1.25 mg/g，與單因素試驗(yàn)相比其損失率降低了25%。

2.1.6 小米粥淀粉糊化度的測(cè)定結(jié)果

如圖4所示，試驗(yàn)1號(hào)的煮制時(shí)間最短、煮制功率最低，若在此參數(shù)下小米粥中淀粉完全糊化，則可斷定在其他參數(shù)下煮制的小米粥也完全熟制。淀粉糊化過(guò)程代表了淀粉分子從有序到無(wú)序狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，同時(shí)也伴隨著能量的變化，因此采用差示掃描量熱儀對(duì)淀粉的糊化特性及糊化程度進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)小米粥中淀粉完全糊化時(shí)，在熱分析過(guò)程中應(yīng)沒(méi)有吸收峰，呈一條平坦的直線[13]。由圖4可知，生小米出現(xiàn)了明顯的吸熱峰，表明其中含有大量的淀粉晶體，并未完全糊化。圖中試驗(yàn)1號(hào)小米粥曲線沒(méi)有出現(xiàn)吸收峰，表明小米粥已完全熟制。

圖4 生小米及小米粥的差示掃描量熱曲線Fig.4 DSC curves of raw millet and millet porridge

2.1.7 小米粥品質(zhì)的感官評(píng)定

根據(jù)表2制訂的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)表3中16 個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果如表5所示。

表5 小米粥感官評(píng)定Table 5 Results of sensory evaluation of millet porridge

由表5可知，試驗(yàn)15組感官評(píng)定的結(jié)果最佳，其次為試驗(yàn)2組和試驗(yàn)11組。感官評(píng)定的結(jié)果表明，當(dāng)水用量過(guò)高時(shí)，小米粥的香味呈下降趨勢(shì)；當(dāng)煮制功率過(guò)高時(shí)，其口感呈下降趨勢(shì)；從表5可得出，烹飪小米粥時(shí)，煮制功率不易過(guò)大，同時(shí)煮制時(shí)間可以略微延長(zhǎng)，也就是常說(shuō)的“小火慢熬”，在此條件下，小米粥的風(fēng)味物質(zhì)不僅可以較好的溶出，且米粒的口感軟硬適中。結(jié)合表3中總多酚含量，選取試驗(yàn)2組為最佳煮制工藝，也將采用試驗(yàn)2組的煮制工藝參數(shù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 小米粥游離酚和結(jié)合酚的測(cè)定結(jié)果

圖5 小米粥游離酚和結(jié)合酚含量Fig.5 Free and bound phenolic contents of millet porridge

由圖5可知，小米粥中游離酚損失率較高，差異顯著，結(jié)合酚含量變化不顯著。小米粥中游離酚和結(jié)合酚含量分別減少了53%和10%，這是由于游離酚不與大分子物質(zhì)結(jié)合，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，而結(jié)合酚通過(guò)碳碳雙鍵、酯鍵或與細(xì)胞壁中木聚糖側(cè)鏈上一些糖殘基、結(jié)構(gòu)蛋白、纖維素和果膠等大分子結(jié)合，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被破壞，所以游離酚損失率高于結(jié)合酚，這與Chandrasekara等[24]的研究結(jié)果一致。食物中的結(jié)合酚在胃和小腸進(jìn)行消化，再由結(jié)腸中微生物菌群發(fā)酵后釋放，所以結(jié)合酚在體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用[25]。小米粥中結(jié)合酚含量下降不顯著，說(shuō)明小米經(jīng)過(guò)煮制后結(jié)合酚在體內(nèi)仍起到不可或缺的作用。

2.3 小米粥中游離酚和結(jié)合酚抗氧化能力

由表6所示，小米粥游離酚和結(jié)合酚DPPH自由基清除率分別為75.41%和56.54%，總抗氧化能力分別為14.72 U/mL和9.58 U/mL。與生小米游離酚相比，小米粥游離酚DPPH自由基清除率下降了2.2%，總抗氧化能力下降了1.91 U/mL。與生小米結(jié)合酚相比，小米粥結(jié)合酚DPPH自由基清除率下降了9.69%，總抗氧化能力下降了3.06 U/mL。Devi等[5]報(bào)道表明，小米DPPH自由基清除率大約為70%，與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果吻合。本實(shí)驗(yàn)使用的東方亮小米其結(jié)合酚的抗氧化能力低于游離酚的抗氧化能力。Kumari等[26]的研究表明，不同品種的小米，其游離酚和結(jié)合酚的抗氧化能力存在差異，例如：印度f(wàn)inger小米結(jié)合酚的抗氧化能力低于游離酚。Devi等[5]報(bào)道同樣證明結(jié)合酚的抗氧化能力低于游離酚，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相同。小米粥中游離酚抗氧化能力變化不顯著的原因可能是熱處理引發(fā)的美拉德反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致新的物質(zhì)形成，具有還原性和釋放結(jié)合酚的能力，這也是小米粥結(jié)合酚抗氧化能力下降的原因。程安瑋等[27]研究了豇豆、紅小豆、綠豆和蠶豆4 種豆類(lèi)中酚類(lèi)化合物的抗氧化能力，小米和小米粥中多酚類(lèi)化合物的抗氧化能力均高于這4 種豆類(lèi)。盡管煮制后小米粥中多酚類(lèi)化合物含量下降，但其抗氧化能力仍維持較高的水平，說(shuō)明多酚類(lèi)化合物在體內(nèi)發(fā)揮著不可或缺的作用。

表6 小米粥中游離酚和結(jié)合酚抗氧化能力Table 6 Free and bound phenolic contents and antioxidant capacities in millet porridge

2.4 PCA結(jié)果

圖6 生小米與小米粥PCA得分散點(diǎn)圖Fig.6 PCA score scatter plot of raw millet and millet porridge

由圖6可知，QC樣本重合度較高，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定性強(qiáng)、數(shù)據(jù)質(zhì)量高。置信區(qū)間的右上角為小米多酚樣本，左下角為小米粥多酚樣本，說(shuō)明小米經(jīng)過(guò)煮制后樣本之間存在顯著差異。

2.5 小米粥中游離酚和結(jié)合酚組分鑒定

本實(shí)驗(yàn)定性出37 種多酚類(lèi)化合物，包含24 種黃酮類(lèi)化合物，其中7 種為異黃酮類(lèi)化合物以及3 種為2-芳基苯并呋喃類(lèi)黃酮類(lèi)化合物；13 種酚酸類(lèi)化合物，其中4 種為肉桂酸及其衍生物，具體信息見(jiàn)表7，這與Shahidi等[4]測(cè)定小米中酚類(lèi)化合物的組成結(jié)果相似，但本實(shí)驗(yàn)更系統(tǒng)地定性出生小米及小米粥的組成成分。鼠曲草黃素、表兒茶素、光甘草素、peonidin 3-O-glucoside、金圣草黃素、芥子醇、香草酸、咖啡酸、丁香酸、間香豆酸、3,4,5-trimeth-oxycinnamic acid、芥子酸、大豆苷元、黃豆黃素、金雀異黃素、異黃樟素、胡椒醛、delphinidin-3-rutinoside和錦葵色素苷的含量均呈顯著性差異。

續(xù)表7

表兒茶素、香蘭素、綠原酸、香草酸、芥子酸和芥子醇等酚類(lèi)化合物相對(duì)含量較高，這與Hithamani等[28]的研究結(jié)果吻合。表兒茶素、綠原酸、芥子酸和香草酸為小米中主要的游離酚；而咖啡酸、間香豆酸為小米中主要的結(jié)合酚，Shahidi等[4]的研究得到同樣的結(jié)果。香葉木苷、表兒茶素、川陳皮素等游離酚相對(duì)含量呈下降趨勢(shì)[29]，其原因可能是在煮制過(guò)程中部分游離酚被氧化，其次熱處理后酚類(lèi)物質(zhì)因降解等原因可能會(huì)進(jìn)入胚乳，與蛋白質(zhì)等大分子形成復(fù)合物，從而使游離酚含量下降。有研究表明[30]，表兒茶素可修復(fù)由幽門(mén)螺旋桿菌誘導(dǎo)的胃黏膜損傷。綠原酸、麥黃酮、間香豆酸等游離酚的相對(duì)含量呈上升趨勢(shì)[31-32]。其原因可能是熱處理破壞了結(jié)合酚的結(jié)構(gòu)，促使結(jié)合酚轉(zhuǎn)變成游離酚，提高了游離酚的含量，研究表明[33]，綠原酸可以阻鎘，阻止胃腸病變，從而保護(hù)腸道。葒草素、蘆丁、香蘭素等結(jié)合酚含量下降，出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能是由于熱處理破壞了包裹結(jié)合酚的酯鍵、碳碳雙鍵等化學(xué)結(jié)構(gòu)，或促使細(xì)胞壁組成中部分果膠或蛋白被溶解，從而釋放食物基質(zhì)中結(jié)合酚并促使其溶出，導(dǎo)致結(jié)合酚含量減少。研究表明[34]，蘆丁對(duì)胃和十二指腸潰瘍的小鼠具有細(xì)胞保護(hù)和胃保護(hù)作用，蘆丁還對(duì)乙醇相關(guān)的胃黏膜潰瘍的修復(fù)起到重要作用。表兒茶素、芥子醇、咖啡酸、丁香酸、大豆苷元等結(jié)合酚的相對(duì)含量呈上升趨勢(shì)，表明適當(dāng)熱處理會(huì)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，可能會(huì)生成新的物質(zhì)；其次，適當(dāng)?shù)臒崽幚泶偈菇Y(jié)合酚的半溶出，提高提取效率[35]?？Х人釋?duì)胃腸炎病毒具有抑制作用，許多益胃、養(yǎng)胃的膠囊或沖劑中均含有咖啡酸。異黃樟素、金圣草黃素、大豆苷元、錦葵色素苷、香蘭素、咖啡酸、香草酸等酚類(lèi)化合物中游離酚和結(jié)合酚均呈上升趨勢(shì)，其原因可能是煮制后部分可溶性結(jié)合酚游離出來(lái)，且適當(dāng)?shù)闹笾坪徒菘梢蕴岣叨喾拥奶崛⌒?，致使其含量增加。川陳皮素、licoagrodin、環(huán)桑皮黃素等酚類(lèi)化合物差異不顯著，表明其熱穩(wěn)定性強(qiáng)于其他酚類(lèi)化合物，其原因可能是此類(lèi)化合物中含有苯環(huán)以及碳碳雙鍵等穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)。其次，苯酚上的羥基與多糖上的氧原子間會(huì)形成氫鍵，這種相互作用可以形成葡聚糖凝膠，提高多酚類(lèi)化合物的穩(wěn)定性。綜上所述，煮制后部分多酚類(lèi)化合物的含量呈現(xiàn)出顯著差異，并且許多酚類(lèi)化合物都具有養(yǎng)胃的功效。

圖7 生小米與小米粥差異組分層次聚類(lèi)分析熱力圖Fig.7 Hierarchical clustering analysis heat map of differential phenolic components between raw millet and millet porridge

圖7為生小米與小米粥差異組分層次聚類(lèi)分析熱力圖。將差異組分的相對(duì)含量進(jìn)行聚類(lèi)，高低表達(dá)交互在一起，紅色為高表達(dá)組分，綠色為低表達(dá)組分。表兒茶素、間香豆酸、辛弗林、咖啡酸、丁香酸等酚類(lèi)化合物為高表達(dá)；yuccaol C、芹菜苷、芒柄花素和(-)-glycinol等為低表達(dá)；根據(jù)顏色變化差異得出綠原酸、紫菀苷、丁香酸、芥子酸、香木葉苷、蘆丁、peonidin 3-O-glucoside、大豆苷元、黃豆黃素、金雀異黃素和鼠曲草黃素等物質(zhì)存在極顯著差異；香蘭素、表兒茶素、香草酸、咖啡酸、間香豆酸等差異顯著，這與表5結(jié)果相似。通過(guò)顏色深淺差異可知，游離酚變化差異大于結(jié)合酚，這表明小米經(jīng)過(guò)煮制后游離酚含量變化顯著，與圖5結(jié)果相似。其中變化最顯著的游離酚為蘆丁、香木葉苷、peonidin 3-O-glucoside、鼠曲草黃素和錦葵色等。

圖8 小米粥差異組分代謝通路影響因子圖Fig.8 Rich factors of metabolic pathways of differential phenolic components between raw millet and millet porridge

由圖5及表7可以得出，煮制后小米籽粒中部分酚類(lèi)化合物含量呈下降趨勢(shì)。有研究表明[36]，小米貯藏過(guò)程中若存在溫度過(guò)高的現(xiàn)象，其籽粒中多酚類(lèi)化合物的含量會(huì)相應(yīng)減少。酚類(lèi)化合物性質(zhì)不是很穩(wěn)定，當(dāng)環(huán)境溫度升高時(shí)，酚類(lèi)化合物極易分解，所以本實(shí)驗(yàn)針對(duì)小米在生熟2 種狀態(tài)下的差異組分進(jìn)行KEGG富集分析，分析高溫環(huán)境對(duì)小米中酚類(lèi)化合物代謝通路的影響，以便為小米貯藏環(huán)境的選擇提供參考。代謝通路富集分析結(jié)果以氣泡圖的形式展現(xiàn)，見(jiàn)圖8。圖中每個(gè)氣泡代表一條代謝通路，共有10 個(gè)氣泡，即在KEGG中查詢(xún)到了10 個(gè)代謝通路，既有合成途徑也有降解途徑，分別為苯丙素的生物合成、異黃酮生物合成、苯丙烷類(lèi)生物合成、氨基苯甲酸鹽降解、次生代謝物的生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、類(lèi)黃酮生物合成、芳香化合物的降解、不同環(huán)境中的微生物代謝途徑及新陳代謝途徑。氣泡所在橫坐標(biāo)和氣泡大小表示該通路在拓?fù)浞治鲋械挠绊懸蜃哟笮?，縱坐標(biāo)和氣泡顏色表示富集分析的P值（取負(fù)常用對(duì)數(shù)，即-lgP），顏色越深P值越小，富集程度越顯著。其中苯丙素的生物合成途徑、異黃酮生物合成途徑、苯丙烷類(lèi)生物合成途徑氣泡顏色較深，說(shuō)明這些代謝途徑受溫度變化影響較大。

表8 差異組分參與的代謝途徑Table 8 Metabolic pathways in which differential phenolic components are involved

由表8可知，涉及到這10 條代謝通路的差異組分有表兒茶素（C09727）、芥子醇（C02325）、咖啡酸（C01481）、大豆苷元（C10208）、金雀異黃素（C06563）、芥子酸（C00482）、香草酸（C06672）和金圣草黃素（C04293）。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)KEGG富集差異組分得到的10 條代謝通路，其中部分代謝通路與高溫環(huán)境下酚類(lèi)化合物含量下降有關(guān)。因此在小米未經(jīng)過(guò)加工處理前，使其保持良好的環(huán)境溫度（尤其是夏季），以延緩酚類(lèi)物質(zhì)的代謝，盡可能將酚類(lèi)化合物的含量維持在最高水平，同時(shí)保持功能因子的保健功效。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到小米粥最優(yōu)煮制參數(shù)為煮制時(shí)間15 min、煮制功率700 W、料液比1∶25（g/mL）。煮制后小米粥游離酚DPPH自由基清除率下降了2.2%，總抗氧化能力下降了1.91 U/mL；小米粥結(jié)合酚DPPH自由基清除率下降了9.69%，總抗氧化能力下降了3.06 U/mL。通過(guò)Folin-Ciocalteu法測(cè)定游離酚和結(jié)合酚含量，結(jié)果表明游離酚比結(jié)合酚對(duì)煮制更加敏感，說(shuō)明結(jié)合酚在體內(nèi)可能起到更為關(guān)鍵的作用。通過(guò)植物廣泛靶向代謝組學(xué)方法，定性分析出37 種多酚類(lèi)化合物，其中鼠曲草黃素、表兒茶素、光甘草素、金圣草黃素等19 種酚類(lèi)化合物均呈顯著性差異。通過(guò)KEGG富集分析得到了10 個(gè)代謝通路。在定性檢測(cè)出的37 種物質(zhì)中，表兒茶素、蘆丁、香蘭素、咖啡酸、大豆苷元等研究較為廣泛，但辛弗林、間香豆酸、環(huán)桑皮黃素、刺芒柄花素、鼠曲草黃素、葒草素等物質(zhì)鮮有研究，甚至鮮少有人深入了解其結(jié)構(gòu)及功能特性。但是，多酚類(lèi)化合物作為小米粥中重要的保護(hù)腸胃功能因子，其研究?jī)r(jià)值不應(yīng)被忽略。后續(xù)研究可對(duì)多酚類(lèi)化合物進(jìn)行分離純化，對(duì)每一種多酚類(lèi)化合物進(jìn)行體內(nèi)和體外功能特性的研究，例如：細(xì)胞抗氧化活性、修復(fù)被損傷的胃上皮細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。從酚類(lèi)化合物的角度闡明小米粥保護(hù)腸胃功能機(jī)制，篩選出高效、無(wú)毒害作用的功能因子，為功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。