• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    抗副溶血弧菌OMPK單克隆抗體的制備及其ELISA雙抗體夾心檢測方法建立

    2021-03-01 01:44:08王曉瑞邱紅玲王壽利朱海華
    食品科學(xué) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:弧菌單克隆緩沖液

    王曉瑞,邱紅玲,王壽利,朱海華,周 莉,平 洋,譚 靜,王 永,王 慧,,*

    (1.河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司,河南 鄭州 450002;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,上海 200025;3.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所,上海 200233)

    副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種嗜鹽革蘭氏陰性桿菌,廣泛存在于海水及其海產(chǎn)品中,大量弧菌存在于海洋藻類和動(dòng)物中,如蝦、魚、雙殼類、血蛤和鮭魚等[1]。人體被弧菌感染之后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腸胃炎,目前發(fā)現(xiàn)的弧菌大概有46 種,其中至少有12 種弧菌與人類感染有關(guān),包括副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、流感弧菌、溶藻弧菌等[2-8]。在弧菌科中,副溶血弧菌是許多國家引起腸胃炎的主要食源性致病菌[9-12],當(dāng)人們攝入被副溶血弧菌污染的生的或未煮熟的食物時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致急性腸胃炎等相關(guān)的疾病,如腹瀉、嘔吐、腹部絞痛和低燒[13]。GB 29921ü 2013《食品中致病菌限量》對水產(chǎn)制品、水產(chǎn)調(diào)味品中的副溶血弧菌進(jìn)行限量,具體為n=5、c=1、m=100 MPN/g(mL)、M=1 000 MPN/g(mL)。

    目前用于檢測副溶血弧菌的方法主要有傳統(tǒng)檢測法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及免疫學(xué)方法等[14]。傳統(tǒng)檢測方法對于副溶血弧菌表型鑒定通常需要結(jié)合各種生化和血清學(xué)檢測的顯色瓊脂培養(yǎng),該方法增菌時(shí)間長并且需要耗費(fèi)大量人力[15]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢,但不能有效用于常規(guī)檢測[16]。免疫學(xué)方法是一種靈敏度高、操作簡便的檢測副溶血弧菌的方法,并且該方法不需要專門的儀器和設(shè)備[17]。夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法是食品安全檢測過程中常用的方法之一,該方法由于標(biāo)記酶放大檢測信號(hào)的作用,因此具有較高的靈敏度,同時(shí)操作過程簡單、可用于大批量樣品的檢測,整個(gè)檢測過程可以在2 h之內(nèi)完成[18-19]。

    單克隆抗體由于具有特異性高、均質(zhì)性好及來源穩(wěn)定并可大批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),是目前疾病研究、診斷及治療的一種常用手段,隨著單克隆抗體研究及應(yīng)用的深入,其在病毒性疾病和水產(chǎn)病原細(xì)菌性疾病的預(yù)防及診斷過程中發(fā)揮著重要作用[20]。外膜蛋白K(outer membrane protein K,OMPK)是一種位于弧菌細(xì)胞壁外膜分子質(zhì)量約為28 kDa的蛋白,該蛋白具有廣泛與外界接觸的機(jī)會(huì),它們之間相似性較高,是弧菌主要的表面抗原之一[21]。何彬斌等[22]通過分離純化抗副溶血弧菌雞卵黃免疫球蛋白建立檢測副溶血弧菌的間接ELISA方法,該方法副溶血弧菌的檢出限為1.0h 105CFU/mL,實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有很強(qiáng)的特異性,能夠準(zhǔn)確對副溶血弧菌進(jìn)行檢測。Pinto等[23]建立了PCR-ELISA檢測副溶血弧菌的檢測方法,該方法的檢測靈敏度較傳統(tǒng)檢測方法提高了100 倍,同時(shí)又降低與其他菌株的交叉反應(yīng),具有很好的應(yīng)用前景。竇勇等[24]建立的副溶血弧菌耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)毒素雙抗體夾心檢測方法,以TDH+副溶血弧菌菌體及TDH毒素制備免疫抗原,免疫BALB/c小鼠和新西蘭大白兔制備多克隆抗體,建立雙抗體夾心ELISA檢測方法,檢測結(jié)果在5 h內(nèi)完成,并且具有很強(qiáng)的特異性。

    本研究將副溶血弧菌外膜蛋白全長OMPK和截短OMPK1基因分別克隆到原核表達(dá)載體PET-28a中構(gòu)建重組質(zhì)粒PET-28a-OMPK/PET-28a-OMPK1,在感受態(tài)大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)并純化蛋白,免疫BALB/c小鼠制備重組外膜蛋白OMPK和OMPK1的單克隆抗體,進(jìn)一步研究抗體不同標(biāo)記方法及抗體片段對檢測靈敏度的影響,初步優(yōu)化建立副溶血弧菌間接夾心ELISA檢測方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鮭魚(三文魚)購于超市,血蛤購于菜市場;所有菌株均保存于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;原核表達(dá)載體PET-28a 安諾倫(北京)生物科技有限公司;感受態(tài)大腸桿菌BL21細(xì)胞 美國Promega公司;6~8 周SPF級BALB/c雌性小鼠 上海市第二軍醫(yī)大學(xué)。

    LB培養(yǎng)基 北京陸橋有限公司;Immunopure?Fab Preparation Kit 美國Pierce公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基 美國Gibco公司;弗氏佐劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 美國Sigma公司;T4 DNA連接酶、BamH I、XhoI 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    1500-823多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特有限公司;PCR基因擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽 美國伯樂公司。

    1.3 方法

    1.3.1 副溶血弧菌OMPK基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

    副溶血弧菌DNA提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根)操作說明進(jìn)行,依據(jù)GenBank記錄的弧菌OMPK基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,全長OMPK基因引物Nompku:CCCGG ATCCATGCGTAA ATCACTTCTAGCTCT;Nompkd:CCCCTAGTTACAGCTACG。截短OMPK1基因引物 OMPKU:CCCGGATATTACCAATTTGGTATGG;OMPKD:CCCCTCGAGTTAGAACTTGTAAGTTAC。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后,用BamH I和XhoI雙酶切轉(zhuǎn)入PET-28a載體,T4DNA連接酶進(jìn)行連接,然后分別將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物PET-28a-OMPK與PET-28a-OMPK1轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21細(xì)胞中,培養(yǎng)過夜,PCR驗(yàn)證及測序分析挑選陽性菌株。

    1.3.2 重組蛋白的表達(dá)與純化

    陽性菌株在37 ℃培養(yǎng)至OD600nm約為0.6,加入1 mmol/L硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá),8 000hg離心5 min收集菌體,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS,pH 7.4)重懸后冰浴超聲菌體30 min,10 000hg離心10 min收取上清液。將上清液結(jié)合于Ni2+瓊脂糖親和層析柱,然后PBS洗滌10 次,重組蛋白經(jīng)洗脫緩沖液(20 mmol/L Na3PO4,50 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,pH 7.4)從層析柱上洗脫下來,PBS溶液透析3 次。

    1.3.3 單克隆抗體的制備與純化

    將純化的OMPK與OMPK1重組蛋白(免疫劑量為50 μg/只小鼠)分別與等體積的弗氏完全佐劑充分混合、乳化,皮下免疫6~8 周雌性BALB/c小鼠。每隔2 周加強(qiáng)免疫1 次,一共免疫6 次,加強(qiáng)免疫將抗原與弗氏不完全佐劑1∶1混合,第3次與第6次免疫之后經(jīng)Western-blotting測定血清特異性及ELISA方法測定血清效價(jià),從OMPK與OMPK1重組蛋白中選取最佳重組蛋白進(jìn)行后續(xù)的抗體制備。第6次免疫之后3 d將小鼠脫臼拉頸處死取其脾細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶5比例充分混合,離心去除上清液,50%的聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合[25],加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止融合。采用ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞制備副溶血弧菌單克隆抗體,通過有限稀釋法對陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆3 次,將雜交瘤細(xì)胞(106細(xì)胞/mL)注入石蠟(0.3 mL/只)預(yù)處理的小鼠腹腔中,10 d左右取小鼠腹水,腹水用飽和硫酸銨沉淀后,再經(jīng)Protein-G親和層析柱純化。間接夾心ELISA法測定單克隆抗體效價(jià),抗體亞型鑒定按照小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒說明書進(jìn)行,Western-blotting檢測抗體的特異性。

    1.3.4 單克隆抗體Fab片段的制備及標(biāo)記

    單克隆抗體Fab的制備按照Immunopure?Fab Preparation Kit說明書方法操作,首先向250 μL消化緩沖液中加入250 μL木瓜蛋白酶,靜置10 min,然后6 000hg離心3 min,去除上清液并重復(fù)上述步驟3 次。將平衡后的木瓜蛋白酶重懸于250 μL消化緩沖液中,然后將單克隆抗體與消化緩沖液各250 μL混合后加入到250 μL木瓜蛋白酶凝膠中,37 ℃放置8 h。用Ultrafree MC分離器從固定的木瓜蛋白酶中分離消化液,結(jié)合緩沖液(250 μL)洗滌木瓜蛋白酶凝膠,收集混合液保存于4 ℃。辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標(biāo)記單克隆抗體(VP3、VP4、VP5、VP6、VP16、VP17)操作方法如下:純化后的單克隆抗體在0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.5)4 ℃條件下透析3 次并輕輕攪拌。10 mg NaIO4溶于0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液,0.25 mL HRP(10 mg/mL)中加入0.25 mL現(xiàn)配NaIO4在25 ℃黑暗條件下氧化20 min,加入100 μL乙二醇終止上述反應(yīng)。將1 mL透析后的抗體與HRP混合反應(yīng)3 h,然后向混合液中加入80 μL NaBH4,4 ℃條件下培養(yǎng)1 h。HRP標(biāo)記的單克隆抗體在4 ℃條件下透析3 次并緩慢攪拌,加入等量甘油保存于-20 ℃。生物素(biotin)標(biāo)記單克隆抗體操作方法如下:biotin標(biāo)記方法按照EZ-Link?Sulfo-NHS-LCBiotin kit說明書操作,將1 mL 2 mg/mL的單克隆抗體與27 μL 10 mmol/L biotin混合后冰浴放置2 h,抗體中加入等量的甘油保存于-20 ℃。

    1.3.5 ELISA法結(jié)合單克隆抗體檢測副溶血弧菌

    不同處理方式的單克隆抗體作系列梯度稀釋包被于96 孔板,每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行,每孔加入100 μL,4 ℃放置過夜。加入200 μL封閉液(10 mmol/L PBS+0.05%吐溫20+5%牛血清白蛋白)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn),加入100 μL洗滌緩沖液(10 mmol/L PBS+0.05%吐溫20)洗3 次,副溶血弧菌培養(yǎng)至108CFU/mL,去除培養(yǎng)基,加入2 mL PBS煮沸15 min暴露抗原,然后每孔加入100 μL,放置37 ℃孵育1 h,加入洗滌緩沖液洗3 次[26]。

    1.3.5.1 HRP標(biāo)記單克隆抗體檢測

    將HRP標(biāo)記抗體按1∶1 000比例稀釋,然后取100 μL加入抗原抗體包被的96 孔板中,37 ℃孵育1 h,洗滌緩沖液洗3 次,每孔加入100 μL四甲基聯(lián)苯胺反應(yīng)10 min,加入1 mol/L HCl溶液終止上述反應(yīng),酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度。

    1.3.5.2 biotin標(biāo)記單克隆抗體檢測

    將biotin標(biāo)記的抗體按1∶1 000比例稀釋,取100 μL加入抗原抗體包被的96 孔板中,37 ℃孵育1 h,洗滌緩沖液洗6 次,然后加入100 μL磷酸對硝基苯酯反應(yīng)10 min,0.5 mol/L Na2CO3溶液終止上述反應(yīng),酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度。

    1.3.6 ELISA法檢測海鮮樣品中副溶血弧菌

    取鮭魚可食用部分用滅菌剪刀剪碎,稱取25 g鮭魚加入225 mL LB培養(yǎng)基放入均質(zhì)器中均質(zhì)30 s,然后分別接種5~10、10~25、25~100 CFU/25 g副溶血弧菌ATCC33847(平板計(jì)數(shù)法對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)),37 ℃培養(yǎng)12 h。取1 mL增菌液5 000hg離心5 min,菌沉淀用1 mL PBS重懸,將菌液煮沸15 min后,用抗原抗體包被的96 孔板進(jìn)行檢測。血蛤從菜市場購買,稱取25 g加入225 mL LB培養(yǎng)基放入均質(zhì)器中均質(zhì)30 s,37 ℃培養(yǎng)12 h,間接夾心ELISA方法檢測副溶血弧菌。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Western-blotting檢測結(jié)果

    圖1 抗血清Western-blotting檢測結(jié)果Fig.1 Western-blotting of the purified recombinant protein

    全長及截短的OMPK/OMPK1重組蛋白用His-tag標(biāo)簽標(biāo)記,純化目的蛋白免疫小鼠,取小鼠血清通過Westernblotting方法檢測該血清對副溶血弧菌抗原的特異性。如圖1所示,全長及截短的OMPK/OMPK1重組蛋白制備的抗血清均能與副溶血弧菌裂解物起特異性反應(yīng)。

    2.2 血清效價(jià)測定結(jié)果

    間接夾心ELISA法測定anti-OMPK(OMPK抗體)和anti-OMPK1(OMPK1抗體)血清效價(jià)。將小鼠血清分別按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000比例稀釋,小鼠血清效價(jià)結(jié)果(圖2)表明,血清稀釋度為1∶8 000時(shí)anti-OMPK/OMPK效價(jià)是anti-OMPK1/OMPK1的2.3 倍,對副溶血弧菌抗原(V.parahaemolyticusantigen,VPA)測定比較,anti-OMPK/VPA效價(jià)是anti-OMPK1/VPA的11.1 倍,全長OMPK重組蛋白制備的抗血清效價(jià)明顯優(yōu)于截短OMPK1重組蛋白制備的血清,全長蛋白分子質(zhì)量大,包含的抗原位點(diǎn)多,具有較強(qiáng)的免疫原性,但是截短蛋白會(huì)失去一部分抗原表位,影響該蛋白的免疫原型,從而降低后續(xù)免疫小鼠制備的抗體與VPA的親和力[27]。故實(shí)驗(yàn)選擇OMPK重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體。

    圖2 anti-OMPK和anti-OMPK1血清效價(jià)ELISA檢測結(jié)果Fig.2 Measurement of the titer of anti-OMPK serum and anti-OMPK1 serum by indirect ELISA

    2.3 抗體特異性

    圖3 抗體Western-blotting檢測結(jié)果Fig.3 Western blotting of the antibodies

    圖3表明,6 株單克隆抗體均能特異性識(shí)別副溶血弧菌抗原,后續(xù)將6 株單克隆抗體用HRP或biotin標(biāo)記,兩兩配對選擇最佳的檢測抗體對。

    2.4 酶標(biāo)抗體最佳工作濃度

    如圖4所示,HRP標(biāo)記的單克隆抗體稀釋度在1∶3 200時(shí),只有VP16-HRP OD450nm大于1,biotin標(biāo)記的抗體稀釋度為1∶800時(shí),VP4-biotin測定值大于1,不同抗體標(biāo)記方法不同其最佳工作濃度也有差別。

    圖4 不同酶標(biāo)抗體的ELISA檢測結(jié)果Fig.4 ELISA results of HRP or biotin-labeled antibodies

    2.5 HRP標(biāo)記單克隆抗體檢測副溶血弧菌

    表1 HRP標(biāo)記mAbs檢測副溶血弧菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of V.parahaemolyticus detection by mAbs conjugated with HRP

    由表1可以看出,將HRP標(biāo)記的單克隆抗體作為檢測抗體用于檢測副溶血弧菌,當(dāng)副溶血弧菌抗原濃度為109CFU/mL時(shí),VP3-HRP與其他抗體配對檢測結(jié)果為副溶血弧菌陽性,但是檢測信號(hào)很弱。當(dāng)副溶血性弧菌抗原濃度為107CFU/mL時(shí),只有VP3-HRP/VP4檢測結(jié)果為陽性,其余配對抗體ELISA檢測結(jié)果為陰性。

    2.6 biotin標(biāo)記單克隆抗體檢測副溶血弧菌

    表2 biotin標(biāo)記mAbs檢測副溶血弧菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of detection of V.parahaemolyticus detection by mAbs conjugated with biotin

    表2結(jié)果表明,副溶血弧菌ATCC33847抗原濃度為107CFU/mL時(shí),VP3-biotin與VP4、VP5、VP6、VP16、VP17配對用于夾心ELISA法檢測副溶血弧菌,除VP3-biotin/VP4抗體對檢測OD450nm值小于2,其余OD450nm值均大于2,VP16-biotin/VP3抗體對也具有很高的檢測靈敏度,綜上結(jié)果可知biotin標(biāo)記VP3和VP16與特定抗體配對能夠放大檢測信號(hào),進(jìn)而ELISA方法用于副溶血弧菌檢測具有較高的靈敏度。

    2.7 特異性實(shí)驗(yàn)

    表3 VP3-biotin抗體對ELISA法檢測副溶血弧菌的特異性Table 3 Specificity analysis of biotinylated VP3 paired with other purified mAbs to detect V.parahaemolyticus by sandwich ELISA

    由表3可知,抗體對用于檢測大腸桿菌ATCC35218等1 6 株菌的E L I S A 結(jié)果均為陰性,檢測河流弧菌CGMCC1.1611等4 株弧菌屬結(jié)果為陰性,說明上述抗體對與其他菌株無交叉反應(yīng),副溶血弧菌 ATCC33847等4 株菌的檢測結(jié)果均為顯著陽性。表3中的抗體對在用于ELISA方法檢測副溶血弧菌時(shí)具有良好的靈敏度及特異性。

    2.8 Fab片段檢測靈敏度實(shí)驗(yàn)

    表4 VP16-biotin/VP3和VP16(Fab)-biotin/VP3抗體對檢測副溶血性弧菌靈敏度分析Table 4 Sensitivity analysis of VP16-biotin/VP3 and VP16(Fab)-biotin/VP3 to detect V.parahaemolyticus

    VP16 Fab片段與VP16檢測副溶血弧菌結(jié)果見表4,副溶血弧菌抗原濃度為107CFU/mL兩者的檢測結(jié)果無明顯差異,抗原濃度降低至106CFU/mL,VP16-biotin/VP3抗體對檢測副溶血弧菌OD450nm結(jié)果為0.75,VP16(Fab)-biotin/VP3抗體對檢測OD450nm結(jié)果為1.87,其檢測靈敏度明顯高于VP16-biotin/VP3。上述結(jié)果與Fab自身特性有關(guān),F(xiàn)ab是分子IgG經(jīng)木瓜蛋白酶裂解產(chǎn)生的2 個(gè)相同片段中的任一個(gè),F(xiàn)ab相對分子質(zhì)量約為5h 104,相比于完整抗體IgG具有分子質(zhì)量小、無Fc片段、具有很高的結(jié)合能力、不需要介導(dǎo)抗體效應(yīng)就能夠單價(jià)結(jié)合抗原的特性[28]。兩抗體對用于檢測高濃度豚鼠氣單胞菌抗原時(shí)均無交叉反應(yīng)。

    2.9 海鮮樣品檢測結(jié)果

    表5 海鮮樣品中副溶血弧菌檢測結(jié)果Table 5 Results of V.parahaemolyticus detection in seafood samples

    ELISA方法結(jié)合VP16-biotin/VP3抗體對檢測血蚶和人工污染鮭魚中活的副溶血弧菌,由表5可知,5~10、10~25、25~100 CFU/25 g菌污染濃度下,ELISA檢測結(jié)果均為副溶血弧菌陽性,市場購買的血蚶檢測結(jié)果也是副溶血弧菌陽性。

    3 討論與結(jié)論

    免疫學(xué)方法檢測副溶血弧菌一般是以其毒力因子作為檢測對象,傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測方法主要是以相對耐熱溶血素、TDH耐熱溶血素等制備單克隆抗體,以此檢測樣品中的副溶血弧菌[17]。但是除副溶血弧菌外,其他弧菌中也存在毒力基因,因此可能造成漏檢與誤檢[29-30]。外膜蛋白是一類細(xì)菌表面蛋白,對于菌體自身結(jié)構(gòu)的維持以及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能具有重要作用,該蛋白還有較強(qiáng)的免疫原性[31]。OMPK是副溶血弧菌表面蛋白成分之一,具有較好的免疫原性,很少與其他菌屬發(fā)生交叉反應(yīng),因此可避免其他菌屬的干擾造成檢測結(jié)果假陽性[32-33]。

    本研究結(jié)果表明OMPK重組蛋白免疫小鼠血清效價(jià)明顯高于OMPK1重組蛋白。經(jīng)OMPK重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備出VP3、VP4、VP6、VP7、VP16、VP17共6 株單克隆抗體均能夠特異性識(shí)別副溶血弧菌抗原。HRP標(biāo)記的單克隆抗體用于檢測副溶血弧菌時(shí)檢測信號(hào)弱、靈敏度低,VP3-biotin與其他5 個(gè)抗體配對和VP16-biotin/VP3檢測副溶血弧菌靈敏度較高。VP3-biotin與其他5 個(gè)抗體配對用于ELISA方法檢測對副溶血弧菌同種屬具有良好的特異性,該抗體對用于檢測其他種屬菌并無交叉反應(yīng)。Fab片段相比于完整抗體用ELISA方法檢測副溶血弧菌具有更高的靈敏度,VP16-biotin/VP3抗體對檢測海鮮樣品中副溶血弧菌的檢測限可達(dá)5~10 CFU/25 g。該方法的靈敏度高,可成功用于副溶血弧菌快速檢測等應(yīng)用研究。

    猜你喜歡
    弧菌單克隆緩沖液
    銷量增長200倍!“弧菌克星”風(fēng)靡行業(yè),3天殺滅98%弧菌
    副溶血弧菌檢測方法的研究進(jìn)展
    新型醋酸纖維素薄膜電泳緩沖液的研究
    單克隆抗體在新型冠狀病毒和其他人冠狀病毒中的研究進(jìn)展
    如何有效防控對蝦養(yǎng)殖中的弧菌病
    卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    副溶血弧菌噬菌體微膠囊的制備及在餌料中的應(yīng)用
    TSH受體單克隆抗體研究進(jìn)展
    單克隆抗體制備的關(guān)鍵因素
    99热这里只有精品一区| www.www免费av| 男女午夜视频在线观看| 免费看a级黄色片| 久久人人精品亚洲av| av国产免费在线观看| 精品久久久久久,| 国产精品久久久人人做人人爽| 日本与韩国留学比较| av中文乱码字幕在线| 最好的美女福利视频网| 久久精品国产自在天天线| 精品国产三级普通话版| 国产不卡一卡二| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产免费av片在线观看野外av| 国产av不卡久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久精品综合一区二区三区| 免费大片18禁| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99国产综合亚洲精品| 一个人免费在线观看电影| 91在线精品国自产拍蜜月 | 窝窝影院91人妻| 真人做人爱边吃奶动态| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 色av中文字幕| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 精品久久久久久久久久免费视频| 窝窝影院91人妻| 欧美最黄视频在线播放免费| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲av不卡在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 国产在视频线在精品| 成人鲁丝片一二三区免费| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类 | 91久久精品电影网| 亚洲精品在线美女| 日本黄色视频三级网站网址| 黄色日韩在线| 免费av不卡在线播放| 国产老妇女一区| 最好的美女福利视频网| 99久久精品热视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 极品教师在线免费播放| 成人特级av手机在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美成人免费av一区二区三区| av黄色大香蕉| 男女那种视频在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品久久久久久久电影 | 热99re8久久精品国产| 最近最新免费中文字幕在线| 一本久久中文字幕| 宅男免费午夜| 男人舔奶头视频| 成人国产综合亚洲| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲国产高清在线一区二区三| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 熟女电影av网| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产成+人综合+亚洲专区| 日韩欧美国产在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 两人在一起打扑克的视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 在线观看av片永久免费下载| 成人国产一区最新在线观看| 国产不卡一卡二| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 99视频精品全部免费 在线| 看片在线看免费视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲欧美激情综合另类| 无人区码免费观看不卡| 99国产精品一区二区蜜桃av| 最近最新中文字幕大全免费视频| 性色av乱码一区二区三区2| 九色成人免费人妻av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美黄色片欧美黄色片| 宅男免费午夜| 天堂√8在线中文| 在线观看免费午夜福利视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 久久久色成人| 性色av乱码一区二区三区2| 母亲3免费完整高清在线观看| bbb黄色大片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 99国产精品一区二区三区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲内射少妇av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲无线在线观看| 九色成人免费人妻av| 欧美成人a在线观看| av黄色大香蕉| 午夜福利高清视频| 欧美成人性av电影在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 男女午夜视频在线观看| 夜夜爽天天搞| 国产高清三级在线| 国产男靠女视频免费网站| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩欧美 国产精品| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲av不卡在线观看| 麻豆成人av在线观看| 日韩欧美三级三区| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲欧美日韩东京热| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 午夜福利欧美成人| 欧美乱妇无乱码| 亚洲中文日韩欧美视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产熟女xx| 91字幕亚洲| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 欧美色视频一区免费| 午夜免费激情av| svipshipincom国产片| 亚洲成人免费电影在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品,欧美在线| 成人av在线播放网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩精品青青久久久久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 最近最新中文字幕大全电影3| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲国产精品成人综合色| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产综合懂色| 无遮挡黄片免费观看| 国产精品 国内视频| 亚洲人成网站高清观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 精品国产美女av久久久久小说| av女优亚洲男人天堂| 欧美日本视频| 国产成年人精品一区二区| 很黄的视频免费| 国产毛片a区久久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 人妻久久中文字幕网| 亚洲中文字幕日韩| 一夜夜www| 欧美国产日韩亚洲一区| h日本视频在线播放| 日本黄大片高清| 日韩欧美精品v在线| 国产一区二区在线观看日韩 | 精品久久久久久久久久免费视频| 五月伊人婷婷丁香| 国产成人aa在线观看| 国产探花极品一区二区| 免费高清视频大片| 欧美中文综合在线视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 禁无遮挡网站| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美黑人巨大hd| 看免费av毛片| 国产精品久久久人人做人人爽| 一进一出抽搐动态| 日本成人三级电影网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产激情欧美一区二区| 黄色女人牲交| 国内精品久久久久久久电影| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 俄罗斯特黄特色一大片| 日韩大尺度精品在线看网址| 一区福利在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲精华国产精华精| 少妇的逼水好多| 婷婷六月久久综合丁香| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩中文字幕欧美一区二区| 91久久精品国产一区二区成人 | 亚洲,欧美精品.| aaaaa片日本免费| 又紧又爽又黄一区二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 在线国产一区二区在线| 国产精品一区二区三区四区久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 床上黄色一级片| 欧美成人免费av一区二区三区| 成人av一区二区三区在线看| 午夜免费激情av| 又黄又粗又硬又大视频| 久久久国产精品麻豆| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美在线黄色| 亚洲一区高清亚洲精品| 在线观看av片永久免费下载| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产免费男女视频| 久久久精品欧美日韩精品| 久久人妻av系列| 色在线成人网| 美女 人体艺术 gogo| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久久久久大精品| 观看免费一级毛片| 精品国产三级普通话版| 中出人妻视频一区二区| 久久久久亚洲av毛片大全| 禁无遮挡网站| 欧美日韩综合久久久久久 | 五月伊人婷婷丁香| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲av二区三区四区| 久久久久久大精品| 成人欧美大片| 深夜精品福利| 在线播放国产精品三级| 欧美在线黄色| www国产在线视频色| 91久久精品电影网| 欧美乱妇无乱码| 激情在线观看视频在线高清| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 日本一本二区三区精品| 黄色女人牲交| 1024手机看黄色片| 一区二区三区国产精品乱码| 成人精品一区二区免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 内射极品少妇av片p| 欧美三级亚洲精品| 18禁美女被吸乳视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久这里只有精品中国| 中出人妻视频一区二区| 无遮挡黄片免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 岛国在线免费视频观看| 99国产精品一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 少妇丰满av| 国产视频内射| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费观看的影片在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 99久久精品热视频| 丝袜美腿在线中文| 亚洲成av人片免费观看| 最新在线观看一区二区三区| 国产一区二区三区视频了| 国产精品女同一区二区软件 | 久久伊人香网站| 国产三级在线视频| 99热6这里只有精品| 不卡一级毛片| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美日韩精品网址| 久久6这里有精品| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品久久久久久久电影 | 1000部很黄的大片| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 男女下面进入的视频免费午夜| 在线免费观看不下载黄p国产 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产一区二区三区视频了| 日本 av在线| 毛片女人毛片| 国产乱人伦免费视频| 18禁美女被吸乳视频| 91在线观看av| 99国产综合亚洲精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 97超视频在线观看视频| 制服人妻中文乱码| 高清日韩中文字幕在线| 一本精品99久久精品77| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 午夜福利欧美成人| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品久久久久久,| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲精品一区av在线观看| 51国产日韩欧美| 亚洲成人久久性| 桃红色精品国产亚洲av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 男女视频在线观看网站免费| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美激情在线99| 国产探花极品一区二区| 两个人视频免费观看高清| 国产熟女xx| or卡值多少钱| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 中文字幕av在线有码专区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 两个人看的免费小视频| 日韩欧美三级三区| 国内精品久久久久精免费| 亚洲av美国av| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品免费一区二区三区在线| 日本一本二区三区精品| 国产私拍福利视频在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲美女视频黄频| 高清在线国产一区| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲人成网站高清观看| 国产av不卡久久| 国产色婷婷99| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品野战在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 91九色精品人成在线观看| 亚洲无线在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 淫秽高清视频在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 90打野战视频偷拍视频| 在线国产一区二区在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 香蕉丝袜av| 国产精品99久久久久久久久| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 99国产综合亚洲精品| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲国产精品合色在线| 69av精品久久久久久| 757午夜福利合集在线观看| 成人午夜高清在线视频| 欧美最新免费一区二区三区 | 在线观看日韩欧美| 91字幕亚洲| 国产中年淑女户外野战色| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品美女特级片免费视频播放器| av在线蜜桃| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一区二区三区高清视频在线| 很黄的视频免费| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产日本99.免费观看| 最好的美女福利视频网| 亚洲av不卡在线观看| 午夜a级毛片| 色尼玛亚洲综合影院| 国产欧美日韩一区二区三| 国产综合懂色| 九色成人免费人妻av| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久久国产精品麻豆| netflix在线观看网站| 偷拍熟女少妇极品色| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲国产精品成人综合色| 波野结衣二区三区在线 | 成人国产综合亚洲| 性色avwww在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 成人av在线播放网站| 国产三级中文精品| 国产69精品久久久久777片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 精品午夜福利视频在线观看一区| 色综合亚洲欧美另类图片| 两个人看的免费小视频| 久久久久久国产a免费观看| a级一级毛片免费在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 午夜免费观看网址| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 色吧在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 啦啦啦免费观看视频1| 99久久综合精品五月天人人| avwww免费| 中文在线观看免费www的网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 成人特级黄色片久久久久久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲精品成人久久久久久| 精品久久久久久成人av| 亚洲av免费在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| or卡值多少钱| 少妇高潮的动态图| 久久久久九九精品影院| 亚洲 国产 在线| 首页视频小说图片口味搜索| 久久亚洲精品不卡| 亚洲av成人精品一区久久| 色综合站精品国产| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 最近最新免费中文字幕在线| 1000部很黄的大片| 欧美丝袜亚洲另类 | av国产免费在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 黄片小视频在线播放| 美女被艹到高潮喷水动态| 俄罗斯特黄特色一大片| 婷婷精品国产亚洲av| 午夜免费激情av| 精品电影一区二区在线| 国产成人欧美在线观看| 欧美午夜高清在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 制服丝袜大香蕉在线| 日韩欧美国产在线观看| 有码 亚洲区| 成人精品一区二区免费| 日日干狠狠操夜夜爽| 99视频精品全部免费 在线| 国产真实乱freesex| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 色综合欧美亚洲国产小说| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲无线在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 日本五十路高清| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产亚洲精品av在线| 亚洲黑人精品在线| 亚洲成人久久性| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产私拍福利视频在线观看| 人人妻人人看人人澡| 日日干狠狠操夜夜爽| 一区二区三区激情视频| 热99re8久久精品国产| 午夜福利欧美成人| 一级毛片女人18水好多| 偷拍熟女少妇极品色| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 18禁黄网站禁片免费观看直播| av黄色大香蕉| 亚洲av电影在线进入| 757午夜福利合集在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 99热这里只有精品一区| 国产成人福利小说| 国产毛片a区久久久久| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产三级在线视频| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲av电影在线进入| 色老头精品视频在线观看| 亚洲精华国产精华精| 久久国产精品影院| 日本 欧美在线| 一个人看视频在线观看www免费 | 男女那种视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 成人精品一区二区免费| 免费电影在线观看免费观看| 级片在线观看| 久久99热这里只有精品18| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲精品成人久久久久久| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲美女黄片视频| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美3d第一页| 午夜免费成人在线视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日本五十路高清| 久久久久性生活片| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产成人影院久久av| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 一级毛片高清免费大全| or卡值多少钱| 国产老妇女一区| 亚洲欧美激情综合另类| 免费电影在线观看免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 桃红色精品国产亚洲av| 国产三级在线视频| 久久人妻av系列| 99国产综合亚洲精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 在线观看日韩欧美| 男女下面进入的视频免费午夜| 99热精品在线国产| 丝袜美腿在线中文| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产成人啪精品午夜网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 色老头精品视频在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本免费a在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本黄色片子视频| 亚洲av美国av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 91av网一区二区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 午夜福利18| 高潮久久久久久久久久久不卡| 性色av乱码一区二区三区2| 悠悠久久av| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产老妇女一区| 亚洲一区高清亚洲精品| 长腿黑丝高跟| 天天一区二区日本电影三级| 99在线视频只有这里精品首页| avwww免费| 亚洲在线自拍视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产探花极品一区二区| 麻豆国产av国片精品| 午夜福利欧美成人| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久久久大精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲人成电影免费在线| 精品国产美女av久久久久小说| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美色视频一区免费| 热99在线观看视频| 18+在线观看网站| 青草久久国产| 在线观看一区二区三区| netflix在线观看网站| 欧美乱妇无乱码| 亚洲片人在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 禁无遮挡网站| 最新中文字幕久久久久| 少妇的逼水好多| 禁无遮挡网站| avwww免费| 亚洲无线观看免费| av女优亚洲男人天堂| www.色视频.com| 免费看光身美女| 操出白浆在线播放| 国产精品免费一区二区三区在线| 少妇熟女aⅴ在线视频| 午夜激情欧美在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美日韩精品网址| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 成人18禁在线播放| 有码 亚洲区| 在线观看舔阴道视频| 观看美女的网站| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频|