• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    抗副溶血弧菌OMPK單克隆抗體的制備及其ELISA雙抗體夾心檢測方法建立

    2021-03-01 01:44:08王曉瑞邱紅玲王壽利朱海華
    食品科學(xué) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:弧菌單克隆緩沖液

    王曉瑞,邱紅玲,王壽利,朱海華,周 莉,平 洋,譚 靜,王 永,王 慧,,*

    (1.河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司,河南 鄭州 450002;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,上海 200025;3.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所,上海 200233)

    副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種嗜鹽革蘭氏陰性桿菌,廣泛存在于海水及其海產(chǎn)品中,大量弧菌存在于海洋藻類和動(dòng)物中,如蝦、魚、雙殼類、血蛤和鮭魚等[1]。人體被弧菌感染之后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腸胃炎,目前發(fā)現(xiàn)的弧菌大概有46 種,其中至少有12 種弧菌與人類感染有關(guān),包括副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、流感弧菌、溶藻弧菌等[2-8]。在弧菌科中,副溶血弧菌是許多國家引起腸胃炎的主要食源性致病菌[9-12],當(dāng)人們攝入被副溶血弧菌污染的生的或未煮熟的食物時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致急性腸胃炎等相關(guān)的疾病,如腹瀉、嘔吐、腹部絞痛和低燒[13]。GB 29921ü 2013《食品中致病菌限量》對水產(chǎn)制品、水產(chǎn)調(diào)味品中的副溶血弧菌進(jìn)行限量,具體為n=5、c=1、m=100 MPN/g(mL)、M=1 000 MPN/g(mL)。

    目前用于檢測副溶血弧菌的方法主要有傳統(tǒng)檢測法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及免疫學(xué)方法等[14]。傳統(tǒng)檢測方法對于副溶血弧菌表型鑒定通常需要結(jié)合各種生化和血清學(xué)檢測的顯色瓊脂培養(yǎng),該方法增菌時(shí)間長并且需要耗費(fèi)大量人力[15]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢,但不能有效用于常規(guī)檢測[16]。免疫學(xué)方法是一種靈敏度高、操作簡便的檢測副溶血弧菌的方法,并且該方法不需要專門的儀器和設(shè)備[17]。夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法是食品安全檢測過程中常用的方法之一,該方法由于標(biāo)記酶放大檢測信號(hào)的作用,因此具有較高的靈敏度,同時(shí)操作過程簡單、可用于大批量樣品的檢測,整個(gè)檢測過程可以在2 h之內(nèi)完成[18-19]。

    單克隆抗體由于具有特異性高、均質(zhì)性好及來源穩(wěn)定并可大批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),是目前疾病研究、診斷及治療的一種常用手段,隨著單克隆抗體研究及應(yīng)用的深入,其在病毒性疾病和水產(chǎn)病原細(xì)菌性疾病的預(yù)防及診斷過程中發(fā)揮著重要作用[20]。外膜蛋白K(outer membrane protein K,OMPK)是一種位于弧菌細(xì)胞壁外膜分子質(zhì)量約為28 kDa的蛋白,該蛋白具有廣泛與外界接觸的機(jī)會(huì),它們之間相似性較高,是弧菌主要的表面抗原之一[21]。何彬斌等[22]通過分離純化抗副溶血弧菌雞卵黃免疫球蛋白建立檢測副溶血弧菌的間接ELISA方法,該方法副溶血弧菌的檢出限為1.0h 105CFU/mL,實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有很強(qiáng)的特異性,能夠準(zhǔn)確對副溶血弧菌進(jìn)行檢測。Pinto等[23]建立了PCR-ELISA檢測副溶血弧菌的檢測方法,該方法的檢測靈敏度較傳統(tǒng)檢測方法提高了100 倍,同時(shí)又降低與其他菌株的交叉反應(yīng),具有很好的應(yīng)用前景。竇勇等[24]建立的副溶血弧菌耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)毒素雙抗體夾心檢測方法,以TDH+副溶血弧菌菌體及TDH毒素制備免疫抗原,免疫BALB/c小鼠和新西蘭大白兔制備多克隆抗體,建立雙抗體夾心ELISA檢測方法,檢測結(jié)果在5 h內(nèi)完成,并且具有很強(qiáng)的特異性。

    本研究將副溶血弧菌外膜蛋白全長OMPK和截短OMPK1基因分別克隆到原核表達(dá)載體PET-28a中構(gòu)建重組質(zhì)粒PET-28a-OMPK/PET-28a-OMPK1,在感受態(tài)大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)并純化蛋白,免疫BALB/c小鼠制備重組外膜蛋白OMPK和OMPK1的單克隆抗體,進(jìn)一步研究抗體不同標(biāo)記方法及抗體片段對檢測靈敏度的影響,初步優(yōu)化建立副溶血弧菌間接夾心ELISA檢測方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鮭魚(三文魚)購于超市,血蛤購于菜市場;所有菌株均保存于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;原核表達(dá)載體PET-28a 安諾倫(北京)生物科技有限公司;感受態(tài)大腸桿菌BL21細(xì)胞 美國Promega公司;6~8 周SPF級BALB/c雌性小鼠 上海市第二軍醫(yī)大學(xué)。

    LB培養(yǎng)基 北京陸橋有限公司;Immunopure?Fab Preparation Kit 美國Pierce公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基 美國Gibco公司;弗氏佐劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 美國Sigma公司;T4 DNA連接酶、BamH I、XhoI 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    1500-823多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特有限公司;PCR基因擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽 美國伯樂公司。

    1.3 方法

    1.3.1 副溶血弧菌OMPK基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

    副溶血弧菌DNA提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根)操作說明進(jìn)行,依據(jù)GenBank記錄的弧菌OMPK基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,全長OMPK基因引物Nompku:CCCGG ATCCATGCGTAA ATCACTTCTAGCTCT;Nompkd:CCCCTAGTTACAGCTACG。截短OMPK1基因引物 OMPKU:CCCGGATATTACCAATTTGGTATGG;OMPKD:CCCCTCGAGTTAGAACTTGTAAGTTAC。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后,用BamH I和XhoI雙酶切轉(zhuǎn)入PET-28a載體,T4DNA連接酶進(jìn)行連接,然后分別將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物PET-28a-OMPK與PET-28a-OMPK1轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21細(xì)胞中,培養(yǎng)過夜,PCR驗(yàn)證及測序分析挑選陽性菌株。

    1.3.2 重組蛋白的表達(dá)與純化

    陽性菌株在37 ℃培養(yǎng)至OD600nm約為0.6,加入1 mmol/L硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá),8 000hg離心5 min收集菌體,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS,pH 7.4)重懸后冰浴超聲菌體30 min,10 000hg離心10 min收取上清液。將上清液結(jié)合于Ni2+瓊脂糖親和層析柱,然后PBS洗滌10 次,重組蛋白經(jīng)洗脫緩沖液(20 mmol/L Na3PO4,50 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,pH 7.4)從層析柱上洗脫下來,PBS溶液透析3 次。

    1.3.3 單克隆抗體的制備與純化

    將純化的OMPK與OMPK1重組蛋白(免疫劑量為50 μg/只小鼠)分別與等體積的弗氏完全佐劑充分混合、乳化,皮下免疫6~8 周雌性BALB/c小鼠。每隔2 周加強(qiáng)免疫1 次,一共免疫6 次,加強(qiáng)免疫將抗原與弗氏不完全佐劑1∶1混合,第3次與第6次免疫之后經(jīng)Western-blotting測定血清特異性及ELISA方法測定血清效價(jià),從OMPK與OMPK1重組蛋白中選取最佳重組蛋白進(jìn)行后續(xù)的抗體制備。第6次免疫之后3 d將小鼠脫臼拉頸處死取其脾細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶5比例充分混合,離心去除上清液,50%的聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合[25],加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止融合。采用ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞制備副溶血弧菌單克隆抗體,通過有限稀釋法對陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆3 次,將雜交瘤細(xì)胞(106細(xì)胞/mL)注入石蠟(0.3 mL/只)預(yù)處理的小鼠腹腔中,10 d左右取小鼠腹水,腹水用飽和硫酸銨沉淀后,再經(jīng)Protein-G親和層析柱純化。間接夾心ELISA法測定單克隆抗體效價(jià),抗體亞型鑒定按照小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒說明書進(jìn)行,Western-blotting檢測抗體的特異性。

    1.3.4 單克隆抗體Fab片段的制備及標(biāo)記

    單克隆抗體Fab的制備按照Immunopure?Fab Preparation Kit說明書方法操作,首先向250 μL消化緩沖液中加入250 μL木瓜蛋白酶,靜置10 min,然后6 000hg離心3 min,去除上清液并重復(fù)上述步驟3 次。將平衡后的木瓜蛋白酶重懸于250 μL消化緩沖液中,然后將單克隆抗體與消化緩沖液各250 μL混合后加入到250 μL木瓜蛋白酶凝膠中,37 ℃放置8 h。用Ultrafree MC分離器從固定的木瓜蛋白酶中分離消化液,結(jié)合緩沖液(250 μL)洗滌木瓜蛋白酶凝膠,收集混合液保存于4 ℃。辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標(biāo)記單克隆抗體(VP3、VP4、VP5、VP6、VP16、VP17)操作方法如下:純化后的單克隆抗體在0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.5)4 ℃條件下透析3 次并輕輕攪拌。10 mg NaIO4溶于0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液,0.25 mL HRP(10 mg/mL)中加入0.25 mL現(xiàn)配NaIO4在25 ℃黑暗條件下氧化20 min,加入100 μL乙二醇終止上述反應(yīng)。將1 mL透析后的抗體與HRP混合反應(yīng)3 h,然后向混合液中加入80 μL NaBH4,4 ℃條件下培養(yǎng)1 h。HRP標(biāo)記的單克隆抗體在4 ℃條件下透析3 次并緩慢攪拌,加入等量甘油保存于-20 ℃。生物素(biotin)標(biāo)記單克隆抗體操作方法如下:biotin標(biāo)記方法按照EZ-Link?Sulfo-NHS-LCBiotin kit說明書操作,將1 mL 2 mg/mL的單克隆抗體與27 μL 10 mmol/L biotin混合后冰浴放置2 h,抗體中加入等量的甘油保存于-20 ℃。

    1.3.5 ELISA法結(jié)合單克隆抗體檢測副溶血弧菌

    不同處理方式的單克隆抗體作系列梯度稀釋包被于96 孔板,每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行,每孔加入100 μL,4 ℃放置過夜。加入200 μL封閉液(10 mmol/L PBS+0.05%吐溫20+5%牛血清白蛋白)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn),加入100 μL洗滌緩沖液(10 mmol/L PBS+0.05%吐溫20)洗3 次,副溶血弧菌培養(yǎng)至108CFU/mL,去除培養(yǎng)基,加入2 mL PBS煮沸15 min暴露抗原,然后每孔加入100 μL,放置37 ℃孵育1 h,加入洗滌緩沖液洗3 次[26]。

    1.3.5.1 HRP標(biāo)記單克隆抗體檢測

    將HRP標(biāo)記抗體按1∶1 000比例稀釋,然后取100 μL加入抗原抗體包被的96 孔板中,37 ℃孵育1 h,洗滌緩沖液洗3 次,每孔加入100 μL四甲基聯(lián)苯胺反應(yīng)10 min,加入1 mol/L HCl溶液終止上述反應(yīng),酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度。

    1.3.5.2 biotin標(biāo)記單克隆抗體檢測

    將biotin標(biāo)記的抗體按1∶1 000比例稀釋,取100 μL加入抗原抗體包被的96 孔板中,37 ℃孵育1 h,洗滌緩沖液洗6 次,然后加入100 μL磷酸對硝基苯酯反應(yīng)10 min,0.5 mol/L Na2CO3溶液終止上述反應(yīng),酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度。

    1.3.6 ELISA法檢測海鮮樣品中副溶血弧菌

    取鮭魚可食用部分用滅菌剪刀剪碎,稱取25 g鮭魚加入225 mL LB培養(yǎng)基放入均質(zhì)器中均質(zhì)30 s,然后分別接種5~10、10~25、25~100 CFU/25 g副溶血弧菌ATCC33847(平板計(jì)數(shù)法對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)),37 ℃培養(yǎng)12 h。取1 mL增菌液5 000hg離心5 min,菌沉淀用1 mL PBS重懸,將菌液煮沸15 min后,用抗原抗體包被的96 孔板進(jìn)行檢測。血蛤從菜市場購買,稱取25 g加入225 mL LB培養(yǎng)基放入均質(zhì)器中均質(zhì)30 s,37 ℃培養(yǎng)12 h,間接夾心ELISA方法檢測副溶血弧菌。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Western-blotting檢測結(jié)果

    圖1 抗血清Western-blotting檢測結(jié)果Fig.1 Western-blotting of the purified recombinant protein

    全長及截短的OMPK/OMPK1重組蛋白用His-tag標(biāo)簽標(biāo)記,純化目的蛋白免疫小鼠,取小鼠血清通過Westernblotting方法檢測該血清對副溶血弧菌抗原的特異性。如圖1所示,全長及截短的OMPK/OMPK1重組蛋白制備的抗血清均能與副溶血弧菌裂解物起特異性反應(yīng)。

    2.2 血清效價(jià)測定結(jié)果

    間接夾心ELISA法測定anti-OMPK(OMPK抗體)和anti-OMPK1(OMPK1抗體)血清效價(jià)。將小鼠血清分別按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000比例稀釋,小鼠血清效價(jià)結(jié)果(圖2)表明,血清稀釋度為1∶8 000時(shí)anti-OMPK/OMPK效價(jià)是anti-OMPK1/OMPK1的2.3 倍,對副溶血弧菌抗原(V.parahaemolyticusantigen,VPA)測定比較,anti-OMPK/VPA效價(jià)是anti-OMPK1/VPA的11.1 倍,全長OMPK重組蛋白制備的抗血清效價(jià)明顯優(yōu)于截短OMPK1重組蛋白制備的血清,全長蛋白分子質(zhì)量大,包含的抗原位點(diǎn)多,具有較強(qiáng)的免疫原性,但是截短蛋白會(huì)失去一部分抗原表位,影響該蛋白的免疫原型,從而降低后續(xù)免疫小鼠制備的抗體與VPA的親和力[27]。故實(shí)驗(yàn)選擇OMPK重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體。

    圖2 anti-OMPK和anti-OMPK1血清效價(jià)ELISA檢測結(jié)果Fig.2 Measurement of the titer of anti-OMPK serum and anti-OMPK1 serum by indirect ELISA

    2.3 抗體特異性

    圖3 抗體Western-blotting檢測結(jié)果Fig.3 Western blotting of the antibodies

    圖3表明,6 株單克隆抗體均能特異性識(shí)別副溶血弧菌抗原,后續(xù)將6 株單克隆抗體用HRP或biotin標(biāo)記,兩兩配對選擇最佳的檢測抗體對。

    2.4 酶標(biāo)抗體最佳工作濃度

    如圖4所示,HRP標(biāo)記的單克隆抗體稀釋度在1∶3 200時(shí),只有VP16-HRP OD450nm大于1,biotin標(biāo)記的抗體稀釋度為1∶800時(shí),VP4-biotin測定值大于1,不同抗體標(biāo)記方法不同其最佳工作濃度也有差別。

    圖4 不同酶標(biāo)抗體的ELISA檢測結(jié)果Fig.4 ELISA results of HRP or biotin-labeled antibodies

    2.5 HRP標(biāo)記單克隆抗體檢測副溶血弧菌

    表1 HRP標(biāo)記mAbs檢測副溶血弧菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of V.parahaemolyticus detection by mAbs conjugated with HRP

    由表1可以看出,將HRP標(biāo)記的單克隆抗體作為檢測抗體用于檢測副溶血弧菌,當(dāng)副溶血弧菌抗原濃度為109CFU/mL時(shí),VP3-HRP與其他抗體配對檢測結(jié)果為副溶血弧菌陽性,但是檢測信號(hào)很弱。當(dāng)副溶血性弧菌抗原濃度為107CFU/mL時(shí),只有VP3-HRP/VP4檢測結(jié)果為陽性,其余配對抗體ELISA檢測結(jié)果為陰性。

    2.6 biotin標(biāo)記單克隆抗體檢測副溶血弧菌

    表2 biotin標(biāo)記mAbs檢測副溶血弧菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of detection of V.parahaemolyticus detection by mAbs conjugated with biotin

    表2結(jié)果表明,副溶血弧菌ATCC33847抗原濃度為107CFU/mL時(shí),VP3-biotin與VP4、VP5、VP6、VP16、VP17配對用于夾心ELISA法檢測副溶血弧菌,除VP3-biotin/VP4抗體對檢測OD450nm值小于2,其余OD450nm值均大于2,VP16-biotin/VP3抗體對也具有很高的檢測靈敏度,綜上結(jié)果可知biotin標(biāo)記VP3和VP16與特定抗體配對能夠放大檢測信號(hào),進(jìn)而ELISA方法用于副溶血弧菌檢測具有較高的靈敏度。

    2.7 特異性實(shí)驗(yàn)

    表3 VP3-biotin抗體對ELISA法檢測副溶血弧菌的特異性Table 3 Specificity analysis of biotinylated VP3 paired with other purified mAbs to detect V.parahaemolyticus by sandwich ELISA

    由表3可知,抗體對用于檢測大腸桿菌ATCC35218等1 6 株菌的E L I S A 結(jié)果均為陰性,檢測河流弧菌CGMCC1.1611等4 株弧菌屬結(jié)果為陰性,說明上述抗體對與其他菌株無交叉反應(yīng),副溶血弧菌 ATCC33847等4 株菌的檢測結(jié)果均為顯著陽性。表3中的抗體對在用于ELISA方法檢測副溶血弧菌時(shí)具有良好的靈敏度及特異性。

    2.8 Fab片段檢測靈敏度實(shí)驗(yàn)

    表4 VP16-biotin/VP3和VP16(Fab)-biotin/VP3抗體對檢測副溶血性弧菌靈敏度分析Table 4 Sensitivity analysis of VP16-biotin/VP3 and VP16(Fab)-biotin/VP3 to detect V.parahaemolyticus

    VP16 Fab片段與VP16檢測副溶血弧菌結(jié)果見表4,副溶血弧菌抗原濃度為107CFU/mL兩者的檢測結(jié)果無明顯差異,抗原濃度降低至106CFU/mL,VP16-biotin/VP3抗體對檢測副溶血弧菌OD450nm結(jié)果為0.75,VP16(Fab)-biotin/VP3抗體對檢測OD450nm結(jié)果為1.87,其檢測靈敏度明顯高于VP16-biotin/VP3。上述結(jié)果與Fab自身特性有關(guān),F(xiàn)ab是分子IgG經(jīng)木瓜蛋白酶裂解產(chǎn)生的2 個(gè)相同片段中的任一個(gè),F(xiàn)ab相對分子質(zhì)量約為5h 104,相比于完整抗體IgG具有分子質(zhì)量小、無Fc片段、具有很高的結(jié)合能力、不需要介導(dǎo)抗體效應(yīng)就能夠單價(jià)結(jié)合抗原的特性[28]。兩抗體對用于檢測高濃度豚鼠氣單胞菌抗原時(shí)均無交叉反應(yīng)。

    2.9 海鮮樣品檢測結(jié)果

    表5 海鮮樣品中副溶血弧菌檢測結(jié)果Table 5 Results of V.parahaemolyticus detection in seafood samples

    ELISA方法結(jié)合VP16-biotin/VP3抗體對檢測血蚶和人工污染鮭魚中活的副溶血弧菌,由表5可知,5~10、10~25、25~100 CFU/25 g菌污染濃度下,ELISA檢測結(jié)果均為副溶血弧菌陽性,市場購買的血蚶檢測結(jié)果也是副溶血弧菌陽性。

    3 討論與結(jié)論

    免疫學(xué)方法檢測副溶血弧菌一般是以其毒力因子作為檢測對象,傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測方法主要是以相對耐熱溶血素、TDH耐熱溶血素等制備單克隆抗體,以此檢測樣品中的副溶血弧菌[17]。但是除副溶血弧菌外,其他弧菌中也存在毒力基因,因此可能造成漏檢與誤檢[29-30]。外膜蛋白是一類細(xì)菌表面蛋白,對于菌體自身結(jié)構(gòu)的維持以及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能具有重要作用,該蛋白還有較強(qiáng)的免疫原性[31]。OMPK是副溶血弧菌表面蛋白成分之一,具有較好的免疫原性,很少與其他菌屬發(fā)生交叉反應(yīng),因此可避免其他菌屬的干擾造成檢測結(jié)果假陽性[32-33]。

    本研究結(jié)果表明OMPK重組蛋白免疫小鼠血清效價(jià)明顯高于OMPK1重組蛋白。經(jīng)OMPK重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備出VP3、VP4、VP6、VP7、VP16、VP17共6 株單克隆抗體均能夠特異性識(shí)別副溶血弧菌抗原。HRP標(biāo)記的單克隆抗體用于檢測副溶血弧菌時(shí)檢測信號(hào)弱、靈敏度低,VP3-biotin與其他5 個(gè)抗體配對和VP16-biotin/VP3檢測副溶血弧菌靈敏度較高。VP3-biotin與其他5 個(gè)抗體配對用于ELISA方法檢測對副溶血弧菌同種屬具有良好的特異性,該抗體對用于檢測其他種屬菌并無交叉反應(yīng)。Fab片段相比于完整抗體用ELISA方法檢測副溶血弧菌具有更高的靈敏度,VP16-biotin/VP3抗體對檢測海鮮樣品中副溶血弧菌的檢測限可達(dá)5~10 CFU/25 g。該方法的靈敏度高,可成功用于副溶血弧菌快速檢測等應(yīng)用研究。

    猜你喜歡
    弧菌單克隆緩沖液
    銷量增長200倍!“弧菌克星”風(fēng)靡行業(yè),3天殺滅98%弧菌
    副溶血弧菌檢測方法的研究進(jìn)展
    新型醋酸纖維素薄膜電泳緩沖液的研究
    單克隆抗體在新型冠狀病毒和其他人冠狀病毒中的研究進(jìn)展
    如何有效防控對蝦養(yǎng)殖中的弧菌病
    卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    副溶血弧菌噬菌體微膠囊的制備及在餌料中的應(yīng)用
    TSH受體單克隆抗體研究進(jìn)展
    單克隆抗體制備的關(guān)鍵因素
    av网站在线播放免费| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久综合国产亚洲精品| 色视频在线一区二区三区| 天美传媒精品一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久亚洲国产成人精品v| 高清黄色对白视频在线免费看| 极品人妻少妇av视频| 日本av手机在线免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 一区二区三区激情视频| 久久天堂一区二区三区四区| 久久99一区二区三区| 性少妇av在线| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 90打野战视频偷拍视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲国产欧美网| 久久久久久人人人人人| 国产不卡av网站在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲国产av新网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品国产一区二区久久| 综合色丁香网| 亚洲三区欧美一区| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩精品免费视频一区二区三区| 老司机影院毛片| 只有这里有精品99| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| a级毛片在线看网站| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一二三四中文在线观看免费高清| 黄色视频在线播放观看不卡| 在线观看免费视频网站a站| 99国产综合亚洲精品| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | www.av在线官网国产| 男人舔女人的私密视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品二区激情视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲成国产人片在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 国产日韩欧美视频二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 男的添女的下面高潮视频| 日本午夜av视频| 精品一区在线观看国产| 日韩 亚洲 欧美在线| av在线app专区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 岛国毛片在线播放| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 爱豆传媒免费全集在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲专区中文字幕在线 | 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美清纯卡通| 一级爰片在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩中文字幕视频在线看片| 高清欧美精品videossex| 晚上一个人看的免费电影| 99国产精品免费福利视频| 久久久久久久久久久久大奶| 丰满乱子伦码专区| 激情视频va一区二区三区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 最新在线观看一区二区三区 | 国产精品免费大片| 亚洲精品日本国产第一区| www.自偷自拍.com| 国产伦人伦偷精品视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 高清不卡的av网站| 黄色 视频免费看| 国产精品久久久av美女十八| 欧美激情高清一区二区三区 | 亚洲精品成人av观看孕妇| av视频免费观看在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 综合色丁香网| 久久久久久人人人人人| 午夜福利免费观看在线| 高清黄色对白视频在线免费看| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | av在线播放精品| 我的亚洲天堂| 啦啦啦在线免费观看视频4| 精品少妇久久久久久888优播| 久久久精品94久久精品| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 免费看av在线观看网站| 久久久久久久国产电影| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 一级片免费观看大全| 各种免费的搞黄视频| 精品少妇内射三级| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 女人精品久久久久毛片| 99九九在线精品视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 夫妻午夜视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 黄片小视频在线播放| 久久精品人人爽人人爽视色| 少妇人妻久久综合中文| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 乱人伦中国视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产成人精品在线电影| 亚洲欧洲国产日韩| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲国产欧美日韩在线播放| kizo精华| 国产极品天堂在线| 日本av手机在线免费观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 9191精品国产免费久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 各种免费的搞黄视频| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲男人天堂网一区| 看非洲黑人一级黄片| 午夜91福利影院| 国产色婷婷99| 成人黄色视频免费在线看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 免费黄频网站在线观看国产| av在线观看视频网站免费| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲图色成人| 电影成人av| 黄色怎么调成土黄色| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 91国产中文字幕| 国产av码专区亚洲av| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 欧美成人午夜精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人黄色视频免费在线看| 在线观看三级黄色| 超碰97精品在线观看| 蜜桃在线观看..| 久久久久精品人妻al黑| 黄色视频不卡| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲久久久国产精品| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久久久久久久久久免费av| 尾随美女入室| 国产日韩欧美在线精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲人成77777在线视频| 最黄视频免费看| svipshipincom国产片| 国产精品久久久久成人av| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日韩视频在线欧美| 女性生殖器流出的白浆| 久久av网站| 在线看a的网站| 日本wwww免费看| 久久午夜综合久久蜜桃| 中文字幕av电影在线播放| 久久久久久久精品精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲熟女精品中文字幕| √禁漫天堂资源中文www| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日韩精品有码人妻一区| 欧美国产精品va在线观看不卡| h视频一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲精品日本国产第一区| 午夜福利一区二区在线看| 欧美日韩成人在线一区二区| 丝袜美足系列| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 成人免费观看视频高清| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲成人一二三区av| 老司机深夜福利视频在线观看 | 在线观看人妻少妇| 免费在线观看完整版高清| 成人毛片60女人毛片免费| 视频区图区小说| 热re99久久国产66热| av在线老鸭窝| 亚洲av中文av极速乱| 久久热在线av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 天天操日日干夜夜撸| www.熟女人妻精品国产| 国产片特级美女逼逼视频| 搡老岳熟女国产| 色精品久久人妻99蜜桃| 国精品久久久久久国模美| 丁香六月天网| 天堂中文最新版在线下载| √禁漫天堂资源中文www| 我要看黄色一级片免费的| 精品一区二区三卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产熟女欧美一区二区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 尾随美女入室| 99久久精品国产亚洲精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产又色又爽无遮挡免| 少妇被粗大猛烈的视频| 99久国产av精品国产电影| 久久毛片免费看一区二区三区| 69精品国产乱码久久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 美女视频免费永久观看网站| 久久97久久精品| 欧美日韩视频精品一区| 69精品国产乱码久久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 女人久久www免费人成看片| 深夜精品福利| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产欧美亚洲国产| av.在线天堂| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久青草综合色| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲精品视频女| 一本大道久久a久久精品| 久久人人爽人人片av| 在线天堂中文资源库| 两性夫妻黄色片| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品一区二区在线观看99| 男女边吃奶边做爰视频| 日本av手机在线免费观看| 悠悠久久av| 国产成人精品久久二区二区91 | 久久久国产欧美日韩av| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲成人免费av在线播放| 国产精品成人在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产av精品麻豆| 色视频在线一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 日韩大片免费观看网站| 男人舔女人的私密视频| 99香蕉大伊视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久 成人 亚洲| 亚洲人成网站在线观看播放| 男女边吃奶边做爰视频| avwww免费| 国产97色在线日韩免费| 自线自在国产av| 青草久久国产| 久久精品久久久久久久性| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 久久久久人妻精品一区果冻| 人妻 亚洲 视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 91成人精品电影| 日韩伦理黄色片| 亚洲三区欧美一区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 不卡av一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久精品免费免费高清| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| 老司机深夜福利视频在线观看 | 久久久久精品人妻al黑| 色视频在线一区二区三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲av福利一区| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 秋霞在线观看毛片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| www日本在线高清视频| 波野结衣二区三区在线| 久久韩国三级中文字幕| 久久久久久久久久久免费av| 毛片一级片免费看久久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久 成人 亚洲| 99国产精品免费福利视频| 中文字幕最新亚洲高清| 乱人伦中国视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲国产欧美一区二区综合| 伦理电影大哥的女人| 亚洲熟女精品中文字幕| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产深夜福利视频在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 国产一区二区 视频在线| 美女视频免费永久观看网站| 欧美人与善性xxx| 国产极品粉嫩免费观看在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 男女午夜视频在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 国产免费视频播放在线视频| 欧美日韩av久久| 国产精品熟女久久久久浪| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲av日韩在线播放| 丰满乱子伦码专区| 九九爱精品视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久人人爽人人片av| 久久鲁丝午夜福利片| 国产成人免费观看mmmm| 女性被躁到高潮视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品熟女久久久久浪| 大香蕉久久网| 国产一区二区 视频在线| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲精品自拍成人| av卡一久久| 日本91视频免费播放| 超色免费av| 美国免费a级毛片| 亚洲成人国产一区在线观看 | 美女主播在线视频| 国产片特级美女逼逼视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲av福利一区| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品久久久久久精品古装| a级毛片在线看网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产精品蜜桃在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产乱来视频区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲欧洲日产国产| 99久久人妻综合| 波多野结衣一区麻豆| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产一区二区在线观看av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 老汉色av国产亚洲站长工具| 午夜久久久在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 人妻一区二区av| 中国三级夫妇交换| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 中文天堂在线官网| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美精品高潮呻吟av久久| 超色免费av| www日本在线高清视频| 大香蕉久久网| 国产人伦9x9x在线观看| 少妇精品久久久久久久| 91国产中文字幕| 国产精品嫩草影院av在线观看| 看免费成人av毛片| svipshipincom国产片| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美日韩成人在线一区二区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 丝袜人妻中文字幕| 婷婷色综合www| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲免费av在线视频| 免费黄频网站在线观看国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| h视频一区二区三区| 国产片内射在线| 久久久欧美国产精品| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜免费鲁丝| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲国产最新在线播放| 男女下面插进去视频免费观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲欧美一区二区三区国产| 午夜av观看不卡| 国产爽快片一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 在线观看一区二区三区激情| 免费av中文字幕在线| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美久久黑人一区二区| 久久精品人人爽人人爽视色| 最近手机中文字幕大全| 久久免费观看电影| 蜜桃国产av成人99| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产一区有黄有色的免费视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久97久久精品| 大陆偷拍与自拍| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产成人欧美在线观看 | 电影成人av| 性色av一级| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲欧洲日产国产| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 中文字幕av电影在线播放| 99国产综合亚洲精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 又大又爽又粗| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲精品乱久久久久久| 国产不卡av网站在线观看| 91国产中文字幕| 老司机靠b影院| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 男女床上黄色一级片免费看| 国产成人a∨麻豆精品| 久久人妻熟女aⅴ| 免费黄色在线免费观看| 免费在线观看黄色视频的| 国产日韩欧美亚洲二区| 高清av免费在线| 国产一卡二卡三卡精品 | 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲国产最新在线播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产欧美日韩一区二区三区在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久天堂一区二区三区四区| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产亚洲一区二区精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产成人av激情在线播放| 亚洲av电影在线进入| a级毛片黄视频| 国产一区二区三区av在线| 国产爽快片一区二区三区| 最黄视频免费看| 超碰成人久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品国产露脸久久av麻豆| av在线播放精品| 久久狼人影院| 国产极品粉嫩免费观看在线| 妹子高潮喷水视频| 一级毛片电影观看| 人妻 亚洲 视频| www.熟女人妻精品国产| 少妇精品久久久久久久| 日韩大片免费观看网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 九九爱精品视频在线观看| 99热国产这里只有精品6| 999久久久国产精品视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美成人精品欧美一级黄| 美女主播在线视频| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 热re99久久精品国产66热6| 制服诱惑二区| 国产精品一二三区在线看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产精品av久久久久免费| 国产精品一区二区精品视频观看| 日韩精品有码人妻一区| 午夜免费观看性视频| 国精品久久久久久国模美| 满18在线观看网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产亚洲欧美精品永久| 九草在线视频观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲天堂av无毛| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 久久99热这里只频精品6学生| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产成人精品久久二区二区91 | 免费看不卡的av| 久久综合国产亚洲精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 色视频在线一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 日日爽夜夜爽网站| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美精品一区二区大全| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品无大码| 男人舔女人的私密视频| 亚洲伊人久久精品综合| 精品亚洲成国产av| 国产男人的电影天堂91| 两个人免费观看高清视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| www.av在线官网国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产男女超爽视频在线观看| 中文字幕高清在线视频| 免费高清在线观看日韩| 美国免费a级毛片| 国产免费福利视频在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日本午夜av视频| 99久久人妻综合| 精品久久蜜臀av无| avwww免费| 精品第一国产精品| 欧美日本中文国产一区发布| 丝袜美足系列| 国产成人精品久久久久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲人成电影观看| 免费看av在线观看网站| tube8黄色片| 日韩av免费高清视频| av视频免费观看在线观看| 久久精品国产综合久久久| 国产黄频视频在线观看| 国产色婷婷99| 毛片一级片免费看久久久久| 国产极品天堂在线| 搡老岳熟女国产| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲av中文av极速乱| tube8黄色片| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 涩涩av久久男人的天堂| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品久久午夜乱码| 电影成人av| 91成人精品电影| av国产精品久久久久影院| 中文天堂在线官网| 精品亚洲成a人片在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 老鸭窝网址在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲精品aⅴ在线观看| www.自偷自拍.com| 黄片播放在线免费| 久久久久久久久久久久大奶| 国产野战对白在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 国产黄色免费在线视频| 国产又爽黄色视频| 亚洲国产欧美网| 欧美精品一区二区免费开放| 青春草视频在线免费观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 午夜av观看不卡| 赤兔流量卡办理| 不卡av一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 熟女av电影| 老司机影院成人| 日本vs欧美在线观看视频| 久久久久精品人妻al黑|