茅臺鎮(zhèn)不同主釀區(qū)域醬香型白酒釀造大曲中細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

任愛容，黃永光

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

中國傳統(tǒng)白酒歷史悠久且香型繁多，其中，以貴州茅臺鎮(zhèn)為主產(chǎn)區(qū)的醬香型白酒是中國傳統(tǒng)白酒中釀造工藝最為復(fù)雜、風(fēng)格最為典型的白酒香型之一[1]。而醬香白酒風(fēng)格形成的關(guān)鍵之一是其釀造過程所使用的糖化發(fā)酵劑醬香大曲，即高溫大曲。高溫大曲是影響生產(chǎn)基酒出酒率和酒質(zhì)的直接因素，通過利用一定粉碎度的純小麥作為制曲原料，添加母曲、培養(yǎng)而成，制曲過程中曲胚發(fā)酵溫度高達60～65 ℃，其高溫發(fā)酵、培菌可實現(xiàn)制曲過程微生物菌群結(jié)構(gòu)的演替和酶的有效富集，從而達到對原料降解、代謝發(fā)酵的作用[2-3]。其中包含的微生物種群主要有酵母菌、細菌、霉菌以及少量的放線菌[4]。細菌具有產(chǎn)酶和生香功能，對白酒風(fēng)味的形成以及提供發(fā)酵動力具有重要的調(diào)控作用[1,5]。醬香型白酒釀造過程中的細菌主要來源于生產(chǎn)所用大曲、原料和環(huán)境等[6-8]。因此，對大曲中細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及其組成的系統(tǒng)性研究和分析，有利于充分認識釀造微生物資源，解析醬香型白酒發(fā)酵機理，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

近年來，世界烈性酒核心產(chǎn)區(qū)茅臺鎮(zhèn)的釀造價值越來越被研究者所重視，特別是其生態(tài)效應(yīng)和社會效應(yīng)[9]。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，其對醬香白酒釀造領(lǐng)域的應(yīng)用也日益增多。如Xu等[10]通過高通量測序，在醬香型白酒大曲中發(fā)現(xiàn)芽孢乳桿菌科、鏈霉菌科、假單胞菌科、多孢放線菌科及柄桿菌科等細菌；郭敏等[11]采用高通量測序技術(shù)對3輪次和7輪次釀造酒醅中的細菌和真菌菌群結(jié)構(gòu)進行比較研究，發(fā)現(xiàn)醬香型白酒發(fā)酵過程3輪次酒醅中乳桿菌屬和芽孢桿菌屬是原核微生物中絕對優(yōu)勢菌，7輪次酒醅中細菌優(yōu)勢菌屬為鹽單胞菌屬，真菌優(yōu)勢菌屬為隱球菌屬。蔡雪梅等[12]對不同區(qū)域醬香型白酒人工窖底泥細菌多樣性研究時，發(fā)現(xiàn)區(qū)域相近的二郎鎮(zhèn)、習(xí)酒鎮(zhèn)和茅臺鎮(zhèn)的窖底泥細菌菌群結(jié)構(gòu)類似，其主要菌群包括變形菌門等；現(xiàn)有資料查閱結(jié)果表明，目前仍然缺乏對茅臺鎮(zhèn)釀造區(qū)域大曲細菌的系統(tǒng)性研究，對醬香型白酒釀造微生物動力來源及其調(diào)控機制仍然不清晰。加強對茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒不同釀造區(qū)域生產(chǎn)大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)的研究是科學(xué)認識和揭示茅臺鎮(zhèn)區(qū)域化釀造醬香型白酒的釀造微生物資源特征及其應(yīng)用調(diào)控的關(guān)鍵。因此，全面、系統(tǒng)地研究、認識茅臺鎮(zhèn)不同釀造區(qū)域生產(chǎn)大曲的微生物菌群結(jié)構(gòu)，對釀造科學(xué)的認識和促進產(chǎn)業(yè)發(fā)展均有至關(guān)重要作用，而且迫在眉睫。

為揭示茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造體系的內(nèi)在生態(tài)資源及其核心機制，解析不同區(qū)域醬香白酒釀造生產(chǎn)大曲發(fā)酵微生物之間的細菌菌群差異機制，本研究利用高通量測序技術(shù)對茅臺鎮(zhèn)主釀區(qū)域醬香型白酒釀造生產(chǎn)大曲樣品（2018ü 2019釀造年度生產(chǎn)）的細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及組成進行解析，旨在揭示茅臺鎮(zhèn)釀酒區(qū)域性細菌多樣性的結(jié)構(gòu)特征，為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，也為其釀造工藝優(yōu)化及生產(chǎn)選址提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自貴州省仁懷市茅臺鎮(zhèn)觀音寺區(qū)（1區(qū)域）、上坪村（2區(qū)域）、椿樹村（3區(qū)域）、巖灘村（4區(qū)域）、向陽村（5區(qū)域）、盧榮壩村（6區(qū)域）及合馬鎮(zhèn)街道社區(qū)（7區(qū)域）共7 個釀造醬香型白酒的主要區(qū)域17 個代表性釀酒企業(yè)的7 個釀造輪次所生產(chǎn)應(yīng)用的大曲（各企業(yè)采集大曲均為采樣企業(yè)獨立生產(chǎn)，并用于本企業(yè)的醬香型白酒基酒釀造）。取樣時間為2018年1ü 9月，茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造1～7輪次生產(chǎn)期。每個企業(yè)樣品采集的每次取樣點固定為同一點。按照區(qū)域劃分，將一個區(qū)域內(nèi)所有酒廠相同輪次的大曲樣品等量混合為一個區(qū)域的綜合樣（實驗樣品，代表一個區(qū)域的綜合樣品），共獲取49 個綜合樣品。取樣過程中，每個取樣點從第1輪次到第7輪次均固定為同一點（每個取樣點做有標記，以防被破壞），每輪次采集樣品為2 d時間，采集樣品均-80 ℃密封保存、備用。

DNA Marker、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、引物合成 上海生物工程股份有限公司；E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 美國Omega BioTek公司；異丙醇（分析純）、核酸電泳緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司；Gengreen染料 上海賽百盛有限公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Zealway G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽（廈門）儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

分別取最后充分混勻的綜合樣各16 g于100 mL離心管中，用30 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮，加入3～5 顆玻璃珠，旋渦振蕩7 min，400 r/min離心5 min，取上清液。沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩4 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。將沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩2 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。全部上清液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞沉淀。

1.3.2 樣品總DNA提取

預(yù)處理結(jié)束后即對各樣品中的微生物總DNA進行提取，置于-20 ℃?zhèn)溆?。提取步驟參見E.Z.N.A.?Soil DNA Kit的操作說明。

1.3.3 PCR擴增

所提基因組DNA的濃度和純度符合測序要求的標準，通過Illumina MiSeq PE250平臺進行高通量測序。用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.3.4 Illumina MiSeq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫，構(gòu)建文庫步驟：1）連接“Y”字形接頭；2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進行拼接：

1）設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列。

2）barcode需精確匹配，引物允許2 個堿基的錯配，去除模糊堿基。

3）根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，overlap需大于10 bp。去除無法拼接的序列。使用UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，細菌比對silva128/16s_bacteria數(shù)據(jù)庫。

4）采用Microsoft Office Excel 2016進行數(shù)據(jù)計算和分析。利用生信云平臺（www.i-sanger.com）、R語言和AI作圖工具繪制稀釋曲線和堆積柱狀圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物多樣性分析

2.1.1 稀釋曲線

應(yīng)用稀釋曲線分析比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，以說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理[13]。7 個區(qū)域的7 個輪次共49 個樣品的稀釋曲線如圖1所示。所有樣品的序列數(shù)大于30 000，而且稀釋度曲線趨于平臺期，表明各樣品測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度滿足測序和分析的要求，測序結(jié)果準確有效，可以充分反映樣品的多樣性。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves

2.1.2α多樣性分析

α多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性和群落的物種豐富度，常用Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、覆蓋率等評價數(shù)據(jù)結(jié)果[14]。其中，Sobs表示樣本中觀察到的物種數(shù)目；Shannon指數(shù)主要表示菌群多樣性；Chao指數(shù)主要用于衡量物種的豐富度；覆蓋率主要用于衡量測序深度。圖2為各區(qū)域大曲樣品的菌群多樣性指數(shù)及其顯著性分析（OTU水平）。

圖2 各區(qū)域大曲菌群多樣性指數(shù)及其顯著性分析（OTU水平）Fig.2 Diversity indexes and significance analysis of bacterial community in Daqu from each brewing region at OTU Level

如圖2A所示，在7 個區(qū)域的大曲樣本中，各區(qū)域樣品的Sobs指數(shù)差異顯著，其中2區(qū)域的Sobs指數(shù)最高，即2區(qū)域觀測到的物種數(shù)目高于其他區(qū)域；經(jīng)t檢驗，1區(qū)域與2、3、4、7區(qū)域，2區(qū)域與6、7區(qū)域，3區(qū)域與7區(qū)域及4區(qū)域與7區(qū)域具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），5區(qū)域和其他區(qū)域差異不顯著。各區(qū)域的覆蓋率均大于0.99，說明該信息足以揭示大多數(shù)樣本的細菌菌群（圖2B）。Shannon指數(shù)直觀表明了各區(qū)域大曲細菌物種多樣性，其中2區(qū)域的Shannon指數(shù)值最高，經(jīng)t檢驗，2區(qū)域與1區(qū)域的大曲物種多樣性具有顯著性差異（P＜0.01），其他區(qū)域無顯著性差異（圖2C），表明2區(qū)域的物種多樣性高于其他區(qū)域。不同區(qū)域Chao指數(shù)存在差異，其中2區(qū)域的Chao指數(shù)最大，并與1、6和7區(qū)域具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）（圖2D），表明2區(qū)域大曲的物種豐富度較其他區(qū)域更高。此外，本研究同時針對此7 個區(qū)域的相同大曲樣品進行了連續(xù)7輪次可培養(yǎng)細菌研究[7]，通過對各區(qū)域大曲的可培養(yǎng)細菌數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，從1～7區(qū)域的可培養(yǎng)細菌菌群種類檢出結(jié)果依次為21、25、21、24、24、23 種和20 種，由此表明，2區(qū)域大曲樣品的可培養(yǎng)細菌種類高于其他區(qū)域，與高通量檢測結(jié)果一致。

綜上，運用α多樣性分析結(jié)合可培養(yǎng)研究評價茅臺鎮(zhèn)的不同區(qū)域醬香型白酒釀造生產(chǎn)大曲的微生物多樣性和物種豐富度。結(jié)果表明，茅臺鎮(zhèn)各主釀區(qū)域細菌多樣性豐富，且不同區(qū)域細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性和物種豐富度均存在差異。

2.2 微生物菌群結(jié)構(gòu)組成

2.2.1 細菌菌群門水平結(jié)構(gòu)組成

為進一步確定各區(qū)域大曲具體的細菌菌群結(jié)構(gòu)組成，將所有的OTU與數(shù)據(jù)庫進行比對，選取置信度閾值，即相似度在97%以上的序列進行物種分類。在門水平上，各區(qū)域的細菌菌群結(jié)構(gòu)組成如圖3所示。

圖3 各區(qū)域大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)（門水平）Fig.3 Bacterial community structure in Daqu from each brewing region at the phylum level

從茅臺鎮(zhèn)各主釀區(qū)的1～7區(qū)域醬香白酒釀造生產(chǎn)大曲中依次檢出13、18、15、16、15、12 個和11 個門，共檢出21 個門。7 個區(qū)域共有細菌門9 個，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Cyanobacteria、unclassified_k__norank、棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、Saccharibacteria和梭桿菌門（Fusobacteria）。從各區(qū)域大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)可知（圖3），茅臺鎮(zhèn)各主釀區(qū)大曲細菌以厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門，其中厚壁菌門和變形菌門為絕對優(yōu)勢菌門。戴奕杰等[15]從醬香白酒高溫制曲、堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵中共檢測出18 個細菌門，在細菌菌群數(shù)量及結(jié)構(gòu)分布上均具有多樣性，且優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門；譚旭[16]從茅臺鎮(zhèn)赤水河水體中檢出17 個細菌門，厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門為其水體中的優(yōu)勢細菌門類。文獻查閱比較，本研究從茅臺鎮(zhèn)大曲中檢出的細菌門類最為豐富，結(jié)合研究結(jié)果表明茅臺鎮(zhèn)醬香白酒產(chǎn)區(qū)整體微生物結(jié)構(gòu)組成具有高度相似性。

由圖3可知，1、3、4、5、6、7區(qū)域的大曲以厚壁菌門為第一絕對優(yōu)勢細菌門，其相對豐度高達64.99%～79.09%，以變形菌門為第二優(yōu)勢菌門，其相對豐度為16.47%～30.78%，二者相對豐度相差較大，相差值最小為34.96%（7區(qū)域），相差值最大可達62.63%（4區(qū)域）；而2區(qū)域以變形菌門為第一絕對優(yōu)勢菌門，其相對豐度為48.96%，以厚壁菌門為第二絕對優(yōu)勢細菌門，其相對豐度為45.76%，二者相對豐度基本接近。郭敏[3]在研究傳統(tǒng)和機械制曲過程的細菌群落結(jié)構(gòu)過程時發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和變形菌門為其大曲的第一和第二優(yōu)勢菌門，厚壁菌門在制曲結(jié)束出房時相對豐度達到最大值（93.10%），相反，變形菌門在大曲入房時其相對豐度值最大（41.13%）；本研究與其結(jié)論具有高度的一致性。然而，雷振河[17]采用高通量測序技術(shù)分析清香型白酒釀造微生物時發(fā)現(xiàn)，變形菌門和厚壁菌門仍然為其大曲中的優(yōu)勢細菌門，但其相對豐度之和低于30%；姚粟[18]在研究芝麻香型白酒高溫大曲細菌菌群過程發(fā)現(xiàn)，變形菌門和厚壁菌門也是其大曲的優(yōu)勢細菌門，但其相對豐度之和低于25%。通過結(jié)合上述其他研究者和本研究結(jié)論可知，厚壁菌門和變形菌門不僅是醬香白酒釀造大曲中的優(yōu)勢微生物，也是其他白酒釀造用酒曲中的優(yōu)勢微生物，但醬香大曲在微生物組成上又有別于其他酒曲，是因為醬香白酒大曲優(yōu)勢微生物的種類和豐度遠高于其他酒曲；而茅臺鎮(zhèn)各主釀區(qū)域大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)在門水平組成上無明顯差異。

上述結(jié)果表明，茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒高溫大曲的細菌菌群在門水平上其數(shù)量及結(jié)構(gòu)分布和組成上多樣性特征明顯，但其主導(dǎo)性細菌菌群基本一致。各區(qū)域優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門。其中，厚壁菌門和變形菌門是其絕對優(yōu)勢微生物。進一步說明茅臺鎮(zhèn)主釀區(qū)域大曲微生物具有一定的共性和穩(wěn)定性。

2.2.2 各區(qū)域細菌菌群結(jié)構(gòu)的屬水平組成

為更加深入揭示茅臺鎮(zhèn)各區(qū)域大曲的細菌菌群結(jié)構(gòu)組成，對細菌菌群結(jié)構(gòu)的屬水平特征結(jié)構(gòu)進行分析，并且將其平均相對豐度大于1%的細菌菌群結(jié)構(gòu)組成進行分析，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 各區(qū)域生產(chǎn)大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)（屬水平）Fig.4 Bacterial community structure in Daqu from each brewing region at the genus level

從茅臺鎮(zhèn)1～7 個主釀區(qū)域生產(chǎn)大曲中依次檢出272、354、314、302、320、255、228 個屬，共檢測出532 個屬。從圖4可知，在各區(qū)域豐度排前10 位的優(yōu)勢細菌屬中，有6 個屬在7 個區(qū)域中連續(xù)存在，分別是芽孢桿菌屬（Bacillus）、慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）、克羅彭斯特菌屬（K ro p p e n s t e d t i a）、泛生菌屬（Pantoea）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）和腸桿菌屬（Enterobacter）。研究表明，芽孢桿菌屬在多種香型白酒釀造過程中均有報道，是白酒發(fā)酵過程中主要的功能細菌菌屬，可代謝產(chǎn)乙偶姻、4-甲基吡嗪等重要白酒風(fēng)味物質(zhì)[5]，為大曲中關(guān)鍵核心微生物屬；其他5 個細菌屬在白酒釀造過程的具體功能尚未見報道，但其在茅臺鎮(zhèn)釀酒區(qū)域的出現(xiàn)范圍廣且豐度高，本課題組正在對其釀造功能等進行深入研究。

綜上表明，在茅臺鎮(zhèn)各區(qū)域間，其主要核心菌屬和優(yōu)勢菌屬具有高度一致性，表明各區(qū)域間微生物存在一定的共性。在對此7 個區(qū)域的相同大曲樣品進可培養(yǎng)細菌研究中發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬不僅出現(xiàn)在大曲樣品中，還出現(xiàn)在釀造環(huán)境樣品樣中[7]；張亞麗[8]研究茅臺鎮(zhèn)空氣微生物時，分離到了泛生菌屬和腸桿菌屬下的菌種；可見交錯來往的地面環(huán)境和流動的空氣環(huán)境是區(qū)域微生物互動的重要來源。另外，在研究醬香型白酒發(fā)酵酒醅細菌過程中發(fā)現(xiàn)，大洋芽孢桿菌屬為其酒醅的核心微生物屬[1,3]；戴奕杰等[15]在研究醬香型白酒多樣性時發(fā)現(xiàn)，腸桿菌屬不僅存在于大曲中，還存在于糟醅中。由此可見，茅臺鎮(zhèn)各區(qū)域大曲通過自身發(fā)酵及其貯存，富集和網(wǎng)絡(luò)環(huán)境的微生物，為后期酒醅的發(fā)酵提供了穩(wěn)定的微生物來源基礎(chǔ)，也使得茅臺鎮(zhèn)醬香白酒釀造具有了地域性特征。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，另外一些相對豐度大于1%的菌屬具有重要的功能，為醬香白酒釀造提供了產(chǎn)酒增香的作用。如，魏斯氏菌屬（Weissella）具有代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸類的功能[19]，為白酒中重要風(fēng)味物質(zhì)的形成提供了前體，乳球菌屬[20]（Lactococcus）具有一定的氨肽酶活性和蛋白質(zhì)水解力，乳桿菌屬[21]（Lactobacillus）在不同的發(fā)酵食品中能夠貢獻乙醇、乙酸、乳酸和其他重要風(fēng)味物質(zhì)，而這些物質(zhì)可改變發(fā)酵過程中的生態(tài)環(huán)境，驅(qū)動菌群結(jié)構(gòu)變化。另外，解硫胺素芽孢桿菌屬[22]（Aneurinibacillus）和魯梅爾芽孢桿菌屬[23]（Rummeliibacillus）曾在四川濃香型白酒釀造窖泥和出窖糟醅中被檢出，為好氧和兼性好氧菌，而本研究為首次在茅臺鎮(zhèn)醬香大曲中檢出。同時，本研究還首次在醬香大曲中檢出了摩根氏菌屬（Morganella）、普勞斯氏菌屬（Prauserella）、橄欖形菌屬（Olivibacter）、庫特氏菌屬（Kurthia）、魯梅爾芽孢桿菌屬、兩面神菌屬（Janibacter）、巴爾通氏體屬（Bartonella）、香味菌屬（Myroides）、unclassified_o__Corynebacteriales和Parapusillimonas。

上述結(jié)果表明，茅臺鎮(zhèn)各釀造區(qū)域生產(chǎn)大曲中的細菌菌群種類豐富，為傳統(tǒng)白酒釀造提供了產(chǎn)酒增香的功能作用，且在屬水平上其核心細菌屬和優(yōu)勢細菌屬結(jié)構(gòu)組成上具有高度的一致性，進一步說明茅臺鎮(zhèn)各區(qū)域間微生物具有良好的共性，為其微生態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定奠定了基礎(chǔ)，也致使茅臺鎮(zhèn)具有產(chǎn)醬香白酒的整體優(yōu)勢。但實際生產(chǎn)中各區(qū)域釀酒質(zhì)量卻各有不同，因此，對各區(qū)域微生物的菌群結(jié)構(gòu)差異分析，是揭示區(qū)域釀酒差異的重要著力點。

2.3 各區(qū)域微生物菌群結(jié)構(gòu)差異

為進一步揭示茅臺鎮(zhèn)各區(qū)域細菌的菌群結(jié)構(gòu)差異，針對細菌屬水平進行ANOSIM分析、Adonis分析和主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果如表1、2和圖5所示。

表1 組間相似性分析結(jié)果Table 1 Results of similarity analysis between groups

表2 Adonis結(jié)果Table 2 Adonis results

圖5 各區(qū)域大曲細菌菌群差異性分析Fig.5 Analysis of differences in bacterial community structure in Daqu among brewing regions

由圖5A可知，各區(qū)域內(nèi)的各輪次大曲樣品間的細菌菌群結(jié)構(gòu)存在差異，且各區(qū)域輪次間的差異程度有所不同，結(jié)合表1、2分析，其Statistic值為0.162 6，P值為0.001，Adonis的結(jié)果中R2為0.232 44，P＜0.05，表明各區(qū)域的組間微生物差異顯著大于組內(nèi)微生物差異，且本次差異分析結(jié)果可信度高。

為更加明確各組間細菌菌群的具體差異程度，對各區(qū)域進行PCA。如圖5B所示，7 個區(qū)域基本可聚為2 類，1、3、4、5、6區(qū)和7區(qū)域聚為一類，2區(qū)域單獨聚為一類。表明2區(qū)域的細菌菌群結(jié)構(gòu)與其他區(qū)域有明顯差異。其原因可能與2區(qū)域離集鎮(zhèn)和市區(qū)較遠，其微生物環(huán)境受人類活動影響較小，從而導(dǎo)致2區(qū)域細菌種類更為豐富，為大曲長期網(wǎng)絡(luò)及馴化細菌菌群提供了基礎(chǔ)。結(jié)合圖3，分析各區(qū)域在細菌門水平上的具體差異可知，2區(qū)域的特有菌門（1 個）為TM6__Dependentiae_，5區(qū)域的特有菌門（2 個）分別為Parcubacteria和硝化螺旋菌門（Nitrospirae），其中硝化螺旋菌門對處理高強度有機廢水具有關(guān)鍵作用[24]，TM6__Dependentiae_和Parcubacteria功能作用尚未見報道；其他區(qū)域均無特有細菌門。在屬水平上，如圖4所示，當(dāng)相對豐度大于1%時，各區(qū)域無特有菌屬。

本研究通過對微生物多樣性分析，可知茅臺鎮(zhèn)釀造區(qū)域的細菌存在多樣性差異，但在分析各區(qū)域豐度較高且具有重要作用的菌屬組成時，發(fā)現(xiàn)無顯著差異，于是把各區(qū)域相對豐度大于0.1%的細菌屬進行比較后發(fā)現(xiàn)，2區(qū)域特征性菌屬（2 個）為克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和橄欖形菌屬；3區(qū)域特征性菌屬（1 個）為Anaerosalibacter；5區(qū)域特征性菌屬（12 個）分別為Propionigenium、norank_c__Cyanobacteria、赤桿菌屬（Erythrobacter）、席藻屬（Phormidium）、unclassified_f__Rhodobacteraceae、Rubidimonas、unclassified_f__Erythrobacteraceae、Rubrivirga、厚皮藻屬（Pleurocapsa）、Jannaschia、Lewinella和Loktanella；6區(qū)域有特征性菌屬（7 個）分別為普氏菌屬（Prevotella_9）、Apibacter、norank_f__Bacillaceae、norank_f__Enterobacteriaceae、Enterococcus、Sebaldella和norank_f__Bacteroidales_S24-7，其他區(qū)域無特有菌屬。其中，克雷伯氏菌屬具有產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶和植酸酶的功能，具有降解原料和發(fā)酵生香的作用[25-26]；Propionigenium可在發(fā)酵代謝產(chǎn)生丙酸[27]，增加白酒中酸的種類，丙酸呈現(xiàn)酸中帶甜，少量可使酒體更柔和；赤桿菌屬和席藻屬具有降解物質(zhì)的功能[28-30]；Loktanella為產(chǎn)紅色素海洋桿菌，發(fā)酵可產(chǎn)生天然紅色素[31]。由此表明，豐度較小的菌屬對白酒釀造仍具有一定的功能作用，而這些為各區(qū)域所特有的豐度較小的菌屬極有可能是造成茅臺鎮(zhèn)各區(qū)域醬香型白酒釀造存在差異的重要原因。而2區(qū)域細菌菌群結(jié)構(gòu)之所以有別于其他區(qū)域，一方面是其物種豐富度高于其他區(qū)域，另一方面則可能是更小豐度水平上存在有其他區(qū)域沒有的功能菌群。

綜上可知，茅臺鎮(zhèn)不同主釀區(qū)域細菌菌群結(jié)構(gòu)組內(nèi)差異小于組間差異，而組間差異的重要原因是由低豐度細菌功能菌群組成的不同所造成，進一步說明在以后研究中除豐度較大且出現(xiàn)頻率較高的菌群值得關(guān)注外，低豐度的功能菌群也應(yīng)是研究重點。

3 結(jié) 論

本研究通過高通量測序技術(shù)結(jié)合數(shù)理分析方法系統(tǒng)性研究了2018ü 2019年度茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒不同釀造區(qū)域生產(chǎn)大曲中的細菌菌群結(jié)構(gòu)特征，共檢出細菌21 個門和532 個屬。首次在醬香大曲中檢出了解硫胺素芽孢桿菌屬、魯梅爾芽孢桿菌屬、摩根氏菌屬、普勞斯氏菌屬、橄欖形菌屬、庫特氏菌屬、兩面神菌屬、巴爾通氏體屬、香味菌屬、unclassified_o__Corynebacteriales和Parapusillimonas。研究發(fā)現(xiàn)，不同區(qū)域大曲中的細菌多樣性豐富且存在差異，但各區(qū)域在豐度較高的優(yōu)勢細菌門、優(yōu)勢細菌屬及核心細菌屬的群落結(jié)構(gòu)組成上具有高度的相似性。其優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門，優(yōu)勢細菌屬為慢生芽孢桿菌屬、克羅彭斯特菌屬、泛生菌屬、大洋芽孢桿菌屬和腸桿菌屬，關(guān)鍵核心細菌屬為芽孢桿菌屬；區(qū)域間微生物存在良好的互動性和穩(wěn)定性，使茅臺鎮(zhèn)有了穩(wěn)定的微生態(tài)結(jié)構(gòu)，成為產(chǎn)醬香型白酒最佳產(chǎn)地的重要原因之一。各區(qū)域內(nèi)的不同輪次生產(chǎn)大曲中細菌菌群差異小于區(qū)域間菌群差異，而區(qū)域間的細菌菌群結(jié)構(gòu)差異主要集中在豐度較小的功能菌群上。本研究在對相對豐度極大的細菌分析后，對相對豐度大于0.1%的細菌菌群僅進行了較為粗略的分析，因此，在本研究基礎(chǔ)上后續(xù)工作將對相對豐度較小的菌群進行更加詳細的系統(tǒng)性跟蹤監(jiān)測，進一步調(diào)查茅臺鎮(zhèn)不同主釀區(qū)更細致的微生態(tài)系統(tǒng)信息。本研究結(jié)果揭示了茅臺鎮(zhèn)不同釀造區(qū)域生產(chǎn)大曲中的細菌菌群結(jié)構(gòu)，為后續(xù)相關(guān)研究提供了新的視角和基礎(chǔ)，也為醬香型白酒生產(chǎn)工藝優(yōu)化及生產(chǎn)選址提供了參考和指導(dǎo)。