雞蛋殼表面典型菌株的分離鑒定及其對(duì)全蛋液致腐能力分析

弓 敏，馬艷秋，王瑞紅，遲 媛，遲玉杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

雞蛋是自然界中營養(yǎng)成分最完善的動(dòng)物性食品之一，富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等多種營養(yǎng)成分，是一種“全營養(yǎng)模式”的食品原料[1]。隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)食品安全的意識(shí)日益強(qiáng)化，雞蛋的質(zhì)量安全問題同樣引起消費(fèi)者的重視，而雞蛋從生產(chǎn)、加工到制備和食用過程中，微生物均會(huì)在不同階段對(duì)雞蛋造成污染。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)雞蛋在母雞卵巢中形成時(shí)就會(huì)發(fā)生微生物的跨卵巢或“垂直”傳播，當(dāng)其從母雞泄殖腔排出后，糞便、墊草、羽毛等產(chǎn)蛋外環(huán)境，收購運(yùn)輸過程中裝蛋容器及貯藏環(huán)境中的微生物均有可能穿過蛋殼進(jìn)入雞蛋內(nèi)部，即發(fā)生微生物的“水平”傳播污染[2-4]，雞蛋內(nèi)容物營養(yǎng)豐富且水分活度較高，微生物一旦通過氣孔進(jìn)入其內(nèi)部后，極易分解雞蛋內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，使雞蛋品質(zhì)發(fā)生腐敗變質(zhì)。因此，對(duì)雞蛋有效殺菌是保證雞蛋質(zhì)量安全的重要措施，目前對(duì)雞蛋進(jìn)行殺菌處理應(yīng)用較為廣泛的是對(duì)雞蛋進(jìn)行清洗消毒，同時(shí)利用低溫冷藏技術(shù)[5-6]達(dá)到雞蛋保鮮的目的，但是雞蛋在貯藏過程或打蛋過程中仍受到某些特定腐敗菌的影響，且這類特定腐敗菌隨著貯藏時(shí)間延長，其數(shù)量逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，加速蛋制品的劣變。

全蛋液是雞蛋經(jīng)過打蛋去殼制備得到的液蛋制品，蛋殼表面微生物在貯藏期間及打蛋過程中均會(huì)不同程度地進(jìn)入到全蛋液制品中，造成全蛋液的腐敗變質(zhì)[7]。雖然雞蛋殼、殼膜及蛋殼表面的角質(zhì)層是阻止細(xì)菌滲透的有效屏障，但是蛋殼的破碎及殼表面成千上萬的氣孔為微生物的入侵提供了通道，使得雞蛋殼表面的微生物極易污染雞蛋內(nèi)容物，此外，大量研究證明雞蛋殼表面細(xì)菌滲透與全蛋液受污染之間（水平傳播污染）存在一定的相關(guān)性[8-9]，同時(shí)雞蛋在貯藏過程中發(fā)生的呼吸作用也會(huì)增加雞蛋內(nèi)容物受污染程度[10]，嚴(yán)重影響全蛋液品質(zhì)與其食用安全性。

目前，研究發(fā)現(xiàn)溫度仍然是影響全蛋液貯藏品質(zhì)的關(guān)鍵因素，雖然低溫條件下可一定程度延緩全蛋液的腐敗變質(zhì)，但是關(guān)于全蛋液貯藏過程中特定腐敗菌的致腐能力及其變化規(guī)律還鮮有報(bào)道。本研究通過傳統(tǒng)微生物的分離純化技術(shù)結(jié)合16S rDNA分子技術(shù)，鑒定存在于雞蛋殼表面的典型菌種，并將分離純化得到的典型菌株接種到滅菌全蛋液樣品中，系統(tǒng)地研究蛋殼表面典型菌株對(duì)全蛋液的腐敗特性，旨在為全蛋液的腐敗機(jī)理解析及雞蛋的殺菌處理?xiàng)l件提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋 市售；PCA平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TransTaqHiFi聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）SuperMix I試劑盒、TaKaRa裂解緩沖液（代碼D304） 全式金生物技術(shù)有限公司；無菌采樣袋（12 cm×18 cm） 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉、硼酸、鹽酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全相顯微鏡 廣州蔚儀金相實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PowerPac Basic電泳儀、1000-Series PCR儀 美國Bio-Rad公司；BCM-1000無菌操作臺(tái) 蘇州江東精密儀器有限公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司；YX-280壓力蒸汽滅菌鍋 河北中興偉業(yè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數(shù)的測(cè)定及蛋殼表面典型菌株的分離純化

取市售新鮮雞蛋（蛋齡為3 d且肉眼無可見雜質(zhì)）30 枚，分成3 組，每組10 枚雞蛋，放入無菌袋內(nèi)并加入500 mL無菌生理鹽水，用手輕輕揉搓無菌袋，使蛋殼表面的微生物盡可能被洗下，將3 組雞蛋擦洗液混合并進(jìn)行10 倍遞增稀釋，參照GB 4789.2ü 2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》中的傾注式平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定蛋殼表面及蛋內(nèi)容物中的菌落總數(shù)，并取適宜濃度的稀釋液100 μL涂布于PCA平板計(jì)數(shù)表面，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h。依據(jù)菌落形態(tài)、大小及顏色的不同挑取典型菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至得到單一菌落并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.1 菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)觀察

將分離得到菌株進(jìn)行劃線培養(yǎng)，觀察菌株形態(tài)特征，包括大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地、邊緣狀態(tài)、隆起及透明度等，進(jìn)一步通過全相顯微鏡觀察菌體細(xì)胞形態(tài)，包括形態(tài)、大小及排列方式等。

1.3.1.2 菌株生理生化特性鑒定

將分離得到的5 株菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，包括淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并參照相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.3.1.3 菌株的16S rDNA分子鑒定

1）DNA模板的制備及引物設(shè)計(jì)與合成

取適量菌體溶于Takara裂解緩沖液（代碼D304）中變性后離心取上清液作為模板（模板DNA），反應(yīng)條件為80 ℃，15 min。選取通用引物27F和1492R作為擴(kuò)增引物，正反測(cè)序，擴(kuò)增引物序列分別為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[13]。

2）擴(kuò)增反應(yīng)

使用高保真性的TransTaqHiFi PCR SuperMix I試劑盒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。陰性對(duì)照為滅菌水；陽性對(duì)照為已知菌株的16S rDNA。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)熱5 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火2 s，72 ℃延伸1.5 min，重復(fù)35 次；72 ℃延伸10 min。16S rRNA序列的PCR體系（50 μL）如表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增體系Table 1 PCR reaction system

3）擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與測(cè)序

通過瓊脂糖凝膠電泳完成擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，DNA Marker為2 000 bp DNA Ladder，將擴(kuò)增出的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，由吉林省庫美生物科技有限公司完成。

4）序列分析

通過電泳檢測(cè)到完整的16S rRNA基因，將測(cè)序結(jié)果輸入到NCBI網(wǎng)站GenBank中，利用BLAST功能組件將測(cè)得的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中基因序列進(jìn)行同源性比較。選取BLAST結(jié)果中得分較高菌的序列，使用MEGA5.2.1軟件根據(jù)Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立及分析。

1.3.2 全蛋液的制備

參照祖林林等[14]的方法并略有改動(dòng)，采用75%乙醇溶液擦拭雞蛋殼并將其置于紫外條件下進(jìn)行滅菌15 min，在無菌操作臺(tái)下進(jìn)行打蛋去殼攪拌，過濾除去系帶和蛋黃膜，分裝于無菌容器中，制得全蛋液樣品。

1.3.3 雞蛋殼表面典型菌種在全蛋液中腐敗特性的測(cè)定

將上述5 株菌制成濃度為105CFU/mL菌懸液，分別吸取1 mL菌懸液接種到100 mL的無菌全蛋液中，測(cè)定蛋殼表面典型菌株對(duì)全蛋液的致腐能力，致腐能力通過測(cè)定樣品在4 ℃貯藏期間典型菌株的生長動(dòng)力學(xué)曲線及樣品揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值、pH值、質(zhì)構(gòu)特性及感官特性為評(píng)定依據(jù)，對(duì)照組為未接種菌株的全蛋液樣品。

1.3.3.1 全蛋液中菌落總數(shù)的測(cè)定

將從蛋殼表面分離純化得到的5 株典型菌株（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、考克氏菌及2 株蠟樣芽孢桿菌）進(jìn)行活化，采用平板傾倒計(jì)數(shù)法確定5 種菌懸液的濃度并將其濃度調(diào)整為105CFU/mL。吸取1 mL菌懸液接種到100 mL全蛋液中并攪拌均勻，于4 ℃貯藏30 h。參照GB 4789.2ü 2016傾注式平板菌落計(jì)數(shù)法，每6 h測(cè)定1 次全蛋液樣品中菌落總數(shù)。

1.3.3.2 TVB-N值測(cè)定參照GB 5009.228ü 2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的全自動(dòng)凱氏定氮儀法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.3 pH值的測(cè)定

采用pH計(jì)測(cè)定貯藏過程中全蛋液酸度值的變化。

1.3.3.4 全蛋液凝膠性質(zhì)的測(cè)定

凝膠的制備及測(cè)定參照王軼男等[15]的方法，取全蛋液20 mL放于25 mL的燒杯中，用保鮮膜封口，并用橡皮筋扎緊，置于90 ℃水浴中加熱15 min，取出后立即放入冰水中冷卻15 min，4 ℃保存24 h，恢復(fù)到室溫后測(cè)定凝膠硬度，測(cè)定條件：采用P/0.5探頭，測(cè)試前速率5.0 mm/s，測(cè)試速率2.0 mm/s，測(cè)試后速率5.0 mm/s，測(cè)試距離為20 mm，觸發(fā)力為5 g。

1.3.3.5 全蛋液凝膠持水力的測(cè)定

參考Kocher等[16]的方法，稱取一定量的凝膠W1，切割成大小均一的塊狀（5 mm×5 mm×5 mm），5 000 r/min離心15 min，取出離心管內(nèi)的凝膠，用濾紙吸干凝膠表面水分后稱量凝膠質(zhì)量W2。持水性計(jì)算見下式：

1.3.3.6 全蛋液感官品質(zhì)的測(cè)定

對(duì)接種全蛋液樣品貯藏過程中的感官特性進(jìn)行觀察描述，包括色澤、氣味及組織狀態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

應(yīng)用SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Pearson方法進(jìn)行雞蛋品質(zhì)參數(shù)及全蛋液中菌落總數(shù)與雞蛋殼表面菌落總數(shù)的相關(guān)性分析，并使用MEGA5.2.1軟件根據(jù)Neighbor-Joining法對(duì)雞蛋殼表面主要微生物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，采用Origin Pro 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞蛋殼表面菌落總數(shù)與全蛋液貨架期的相關(guān)性分析

分別取貯藏0、7、15、20、25、30 d的雞蛋，編號(hào)為I～VI組，將6 組雞蛋進(jìn)行打蛋、均質(zhì)、熱處理（63.5 ℃，3.5 min）制得全蛋液并于4 ℃條件下貯藏，通過測(cè)定全蛋液貯藏過程中菌落總數(shù)，分析全蛋液貨架期與雞蛋殼表面菌落總數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果如圖1、2所示。

圖1 雞蛋殼表面（A）及全蛋液（B）中菌落總數(shù)Fig.1 Growth rates of total number of bacterial colonies on eggshell (A) and in liquid whole egg (B)

圖2 全蛋液中菌落總數(shù)生長情況與雞蛋殼表面菌落總數(shù)的相關(guān)性Fig.2 Correlation between growth rate of total number of bacterial colonies in liquid whole egg and that on eggshell surface

由圖1可知，雞蛋殼表面及全蛋液中菌落總數(shù)隨貯藏時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，且蛋殼表面菌落總數(shù)不同，打蛋制得的全蛋液樣品的貨架期顯著不同，表現(xiàn)為III～VI組的全蛋液貨架期明顯短于I組和II組。I組制得的全蛋液于4 ℃條件下貯藏8 d，菌落總數(shù)達(dá)4.61（lg（CFU/mL）），符合GB 2749ü 2015《蛋制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)全蛋液蛋制品的衛(wèi)生要求，但當(dāng)全蛋液貯藏時(shí)間為10 d時(shí)，其菌落總數(shù)達(dá)5.45（lg（CFU/mL）），超過國標(biāo)要求，而II～VI組制得的全蛋液樣品于4 ℃條件下貯藏8 d時(shí)，菌落總數(shù)均已超過全蛋液制品衛(wèi)生要求。Ayres等[17]研究發(fā)現(xiàn)全蛋液在9、2 ℃貯藏條件下分別于5、12 d時(shí)，其樣品中菌落總數(shù)均超過國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有差異，可能原因是貯藏溫度、蛋源及全蛋液熱處理參數(shù)不同導(dǎo)致的結(jié)果差異。

由圖2相關(guān)性分析表明，蛋殼表面菌落總數(shù)越多，全蛋液受污染程度越高，全蛋液貨架期越短，由此可見雞蛋殼表面微生物數(shù)量是影響全蛋液貨架期的主要因素。相關(guān)研究指出新鮮雞蛋殼表面具有一層生物保護(hù)膜，具有封閉氣孔和一定的抑菌作用，但隨貯藏時(shí)間延長，外層生物保護(hù)膜自行脫落，失去了抑菌性及對(duì)氣孔的密封性，使蛋殼表面微生物易滲透到蛋內(nèi)容物中，在高營養(yǎng)高水分的環(huán)境下微生物得到迅速生長繁殖，使得全蛋液的初始微生物數(shù)量增加[17]；其次在全蛋液制備過程中，尤其是打蛋環(huán)節(jié)，蛋殼表面微生物極易侵染到蛋液中，最終影響全蛋液的貨架期[18-19]。因此，雞蛋殼表面微生物是全蛋液制品中微生物的主要來源，為了進(jìn)一步確定蛋殼表面微生物的種類及特性對(duì)全蛋液貯藏品質(zhì)的影響，對(duì)雞蛋殼表面典型菌株進(jìn)行分離鑒定并探究菌株的腐敗特性。

2.2 雞蛋殼表面典型菌株的分離鑒定

2.2.1 典型菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

圖3 5 株菌的菌落特征及細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Colonies and cell morphology of five isolated bacterial strains

由圖3可知，5 株細(xì)菌在營養(yǎng)瓊脂平板上形態(tài)各異，A菌呈白色、表面扁平黏稠且邊緣不規(guī)則的大菌落特征，顯微結(jié)構(gòu)顯示為革蘭氏陽性，菌體呈短狀直桿狀且倆端鈍圓，內(nèi)部具有芽孢結(jié)構(gòu)，呈單個(gè)或短鏈狀排列；B菌為白色、表面干燥且多褶皺多隆起、邊緣呈裂葉狀，革蘭氏染色呈陽性，且形態(tài)為梭狀，中間有芽孢結(jié)構(gòu)，呈分散排列；C菌呈現(xiàn)透明乳白色、表面扁平黏稠且邊緣不規(guī)則的大菌落特征，顯微結(jié)構(gòu)為革蘭氏陽性，短狀直桿菌，呈單個(gè)或鏈狀排列；D菌呈現(xiàn)黃色、表面凸起、光滑圓潤的菌落特征，革蘭氏染色呈陽性，且具有金屬光澤，呈現(xiàn)單球菌/四聯(lián)球菌的排列方式；E菌表現(xiàn)為圓形低凸、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落特征，革蘭氏染色呈陰性，菌體為兩端鈍圓的短粗桿狀，單個(gè)排列方式。Moats[20]和Reu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋殼表面微生物菌系主要以革蘭氏陽性菌居多。

2.2.2 典型菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 菌株生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of the strains

生理生化實(shí)驗(yàn)可以反映菌種的代謝特點(diǎn)，由表2可以看出，A菌和C菌的生理生化鑒定結(jié)果基本一致，可以初步判斷其為同一菌屬，且從生化結(jié)果可初步判定A、B、C為芽孢桿菌。D菌的淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)均為陰性，不能利用乳糖、麥芽糖、L-阿拉伯糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，其生理生化特性與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]中微球菌屬一致。E菌依據(jù)上述糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可利用大部分糖且甲基紅實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)等呈陽性，同時(shí)可利用乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，依據(jù)微生物手冊(cè)，可初步判定E菌為腸桿菌屬。

2.2.3 5 株菌16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 5 株細(xì)菌16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)圖譜Fig.4 Electrophoresis of PCR-amplified 16S rRNA sequence from five isolated bacterial strains

如圖4所示，以提取的5 株細(xì)菌的DNA為模板，27f和1492r為引物，進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，5 株菌在1 500 bp處出現(xiàn)單一清晰的熒光條帶且無拖尾現(xiàn)象，滿足實(shí)驗(yàn)需求，通過對(duì)目的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，以備后續(xù)測(cè)序使用。

2.2.4 5 株菌16S rDNA基因序列同源性比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株A～E的基因序列與GenBank內(nèi)已知菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，選取BLAST結(jié)果中得分較高菌的16S rDNA序列，使用MEGA5.2.1軟件根據(jù)Neighbor-Joining進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖5所示。

根據(jù)供試細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，分離得到菌株A、B、C與芽孢桿菌屬（Bacillus）遺傳距離最近，均屬于芽孢桿菌屬，其中菌株A、C與菌株B.cereus相似度最高，達(dá)100%，B菌與B.subtilis相似度最高，達(dá)100%，因此A、C菌鑒定為蠟樣芽孢桿菌，B菌鑒定為枯草芽孢桿菌。而芽孢桿菌屬已被證實(shí)為多種食品中常見的食品腐敗菌，其中蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生嘔吐毒素和多種腸毒素，引發(fā)嘔吐和腹瀉型食物中毒，常存在于原料乳、肉類、禽蛋類食品中[22]，枯草芽孢桿菌可分解食品中蛋白質(zhì)、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，造成食品的風(fēng)味和口感發(fā)生不期望的變化，從而引起食品的腐敗變質(zhì)[23]。從圖5 可以看出，菌株D 與考克氏菌屬（Kocuria）遺傳距離最近，屬于考克氏菌屬，且D菌與K.marina相似度最高，達(dá)100%，因此，鑒定D菌為考克氏菌。劉梅等[24]從冰鮮雞制品中同樣分離純化出了能夠分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生生物胺的考克氏菌。E菌與大腸桿菌科的2 個(gè)菌屬埃希氏菌（Escherichia）和志賀氏菌（Shigella）的遺傳距離較近，與菌種E.fergusonii和S.flexneri相似度均達(dá)100%，綜合E菌生理生化實(shí)驗(yàn)，如E菌可分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣而志賀氏菌屬不分解乳糖可知E菌為大腸埃希氏菌種（E.fergusonii）。因此，依據(jù)菌種的菌落形態(tài)差異本實(shí)驗(yàn)從雞蛋殼表面分離鑒定得到了5 株典型菌種，分別為：大腸埃希氏菌（E）、枯草芽孢桿菌（B）、考克氏菌（D）及2 株蠟樣芽孢桿菌（A、C）。雞蛋內(nèi)容物營養(yǎng)豐富且水分活度較高，微生物一旦通過氣孔或者在打單過程中進(jìn)入蛋液后，極易分解其中的營養(yǎng)物質(zhì)，使其品質(zhì)發(fā)生變化[25]。因此，將蛋殼表面分離得到的典型菌株接種到全蛋液中并進(jìn)行了致腐能力測(cè)定分析。

圖5 以16S rDNA基因序列為分子標(biāo)記的5 株細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of five isolated bacterial strains based on their 16S rDNA sequences

2.3 雞蛋殼表面典型菌株在全蛋液中的腐敗特性

2.3.1 典型菌株對(duì)全蛋液菌落總數(shù)的影響

圖6 典型菌株對(duì)全蛋液菌落總數(shù)的影響Fig.6 Change in total bacterial count during storage of liquid whole egg inoculated with each typical strain

由圖6所示，貯藏至第18小時(shí)，A、B、C、D、E組的菌落總數(shù)均已超過GB 2749ü 2015《蛋與蛋制品》中安全限量所規(guī)定的最低限量值4.70（lg（CFU/mL）），而對(duì)照組在貯藏至第30小時(shí)仍未超過限量值。在貯藏6 h后實(shí)驗(yàn)組全蛋液中的菌落總數(shù)便開始迅速增加，其中A、C組顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組的生長速率，當(dāng)貯藏至第30小時(shí)，全蛋液中的菌落總數(shù)從高到低分別為C、A、E、B、D，分別達(dá)到5.83、5.8、5.69、5.679、5.53（lg（CFU/mL）），遠(yuǎn)高于對(duì)照組1.21（lg（CFU/mL））。

2.3.2 貯藏期間全蛋液TVB-N值及酸度值的變化

圖7 全蛋液貯藏期間TVB-N值及pH值的變化Fig.7 Changes in TVB-N and pH value in liquid whole egg during storage

全蛋液在貯藏期間，蛋白質(zhì)在酶與微生物作用下不斷分解，產(chǎn)生具有揮發(fā)性的氨、胺類等堿性含氮物質(zhì)[26]，導(dǎo)致TVB-N值含量升高，因此TVB-N值可用于反映全蛋液貯藏期間的蛋白質(zhì)被分解程度。此外，全蛋液貯藏過程中，酸度值同樣是反映全蛋液制品劣變的重要指標(biāo)[27]。由圖7可知，接菌的全蛋液樣品在貯藏過程中，隨貯藏時(shí)間的延長TVB-N值逐漸增加，酸度值隨貯藏時(shí)間延長呈現(xiàn)先緩慢增加后急劇下降的趨勢(shì)。貯藏0～6 h期間，實(shí)驗(yàn)組中揮發(fā)性鹽基氮緩慢增長，而在第12小時(shí)，接種菌種的全蛋液樣品中揮發(fā)性鹽基氮的含量變化幅度較大，尤其A、C組增長速度較快，在貯藏第24小時(shí)后，TVB-N值分別達(dá)（31.67f 1.311）、（30.07f 1.318）mg/100 g，均已超過國標(biāo)中的限量值30 mg/100 g。經(jīng)過30 h貯藏，實(shí)驗(yàn)組全蛋液樣品中揮發(fā)性鹽基氮的含量由高到低分別為C、A、B、D、E。全蛋液的酸度值隨貯藏時(shí)間延長呈現(xiàn)緩慢上升后急劇下降的趨勢(shì)，可能原因是全蛋液中蛋白質(zhì)在內(nèi)源蛋白酶及微生物分泌的蛋白分解酶的作用下降解為多肽、氨基酸等堿性基團(tuán)，導(dǎo)致pH值上升，雖然后期全蛋液中TVB-N值逐漸增加，但是隨著貯藏時(shí)間延長，蛋液中復(fù)雜氮和碳源分解，從而使全蛋液中營養(yǎng)基質(zhì)適合并支持細(xì)菌生長，尤其芽孢菌屬可利用多數(shù)糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣，此外，全蛋液中脂質(zhì)在貯藏過程中發(fā)生水解產(chǎn)生脂肪酸，致使后期全蛋液中pH值在貯藏后期驟降[28]。

2.3.3 貯藏期間全蛋液凝膠性質(zhì)的變化

圖8 全蛋液貯藏期間凝膠性質(zhì)的變化Fig.8 Changes in gel properties of liquid whole egg during storage

全蛋液的凝膠硬度及凝膠持水性是評(píng)價(jià)全蛋液功能性質(zhì)的重要指標(biāo)[29]，由圖8可知，未接種的全蛋液的功能性質(zhì)在貯藏30 h期間沒有顯著變化，而接種菌株的全蛋液在貯藏過程中呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，尤其A、C菌株對(duì)全蛋液的凝膠硬度及凝膠持水性的影響較大，在貯藏30 h后，接種A、C菌株的全蛋液樣品的凝膠強(qiáng)度下降了46.29%～46.94%，凝膠持水性下降了23.11%～23.54%。可能原因是微生物將全蛋液中的蛋白質(zhì)分解成低分子的銨類物質(zhì)，破壞了蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵的形成[30]，尤其蠟樣芽孢桿菌在生長代謝過程中能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及纖維酶等，破壞了全蛋液中蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用，此外，蠟樣芽孢桿菌在生長代謝過程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸降低體系pH值，在較低pH值的條件下同樣會(huì)降低全蛋液的凝膠強(qiáng)度，進(jìn)而降低凝膠的持水性[31-32]。

2.3.4 貯藏期間全蛋液感官品質(zhì)的變化

由表3可知，未接種菌株的全蛋液樣品在貯藏30 h后，全蛋液仍然呈現(xiàn)均勻的乳濁液，具有正常蛋液的氣味，顏色較新鮮蛋液樣品較暗。接種A、B、C、D、E組的全蛋液樣品均呈現(xiàn)出腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，其中A、C組樣品變質(zhì)情況嚴(yán)重，顏色變成亮黃，全蛋液已經(jīng)失去原有的液體狀態(tài)，呈現(xiàn)細(xì)膩均一的膏狀；接種B、D、E組的全蛋液樣品呈現(xiàn)嚴(yán)重的分層現(xiàn)象，上層蛋液呈現(xiàn)深黃，下層為膏狀固體。結(jié)合貯藏期間全蛋液的TVB-N值、菌落總數(shù)的生長曲線及全蛋液功能性質(zhì)的變化，可知從雞蛋殼表面分離純化得到的5 株主要微生物菌種中，致腐能力最強(qiáng)的為芽孢桿菌屬（菌株A、C），其次為大腸桿菌（菌株E）、枯草芽孢桿菌（菌株B）及考克氏菌（菌株D）。

表3 典型菌株對(duì)全蛋液感官品質(zhì)的影響Table 3 Effect of inoculation with typical spoilage bacteria on sensory quality of liquid whole egg after storage for 30 h

3 結(jié) 論

通過研究雞蛋在貯藏期間蛋殼表面菌落總數(shù)及全蛋液貨架期隨貯藏時(shí)間變化趨勢(shì)，并建立二者之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)雞蛋殼表面微生物菌群是影響全蛋液貨架期的主要因素，雞蛋貯藏時(shí)間越久打蛋制得的全蛋液貨架期越短。且從蛋殼表面分離純化得到的5 株典型菌株，并接種到全蛋液樣品中，分析貯藏期間各典型菌株的生長動(dòng)力學(xué)曲線及全蛋液貯藏品質(zhì)變化趨勢(shì)，確定了雞蛋殼表面5 株典型菌株腐敗能力最強(qiáng)的為蠟樣芽孢桿菌屬（B.cereus）A、C，其次為大腸桿菌（E.coli）E、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）B及考克氏菌（K.marina）D。以上研究結(jié)果可為雞蛋殺菌工藝及全蛋液制品的防腐提供理論參考。