品質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌的分離和鑒定

孫鵬亮，潘姣姣，陳薈旭，張秋林，魏鑫豪，李蓮瑞*

（1．塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2．塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

芽孢桿菌是一種好氧或兼性厭氧的能產(chǎn)生極強(qiáng)抗逆性芽孢革蘭氏陽性菌，芽孢對高溫、高壓、紫外線、干燥、電離輻射和酸堿劑都有很強(qiáng)的抗性。芽孢桿菌同時也是奶粉中常見的污染菌，嚴(yán)重影響著產(chǎn)品品質(zhì)。耐熱芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種酶類。酶的形成會導(dǎo)致食品的感官品質(zhì)發(fā)生改變及營養(yǎng)價(jià)值降低。奶粉受微生物污染的主要途徑是奶粉特殊的加工工藝。奶粉在加工前，原料乳需要在乳罐中儲存數(shù)小時或數(shù)天，不會立即進(jìn)行巴氏消毒或者加工，在這種狀態(tài)下過長時間會引起細(xì)菌的大量增殖[1]。因此，原料乳在加工前都要經(jīng)過初次消毒，即將牛乳加熱到63～65 ℃、15 s，以達(dá)到殺死部分細(xì)菌和抑制細(xì)菌酶活性的目的[2]。經(jīng)過首次消毒后，附著在熱交換器中部分未被殺死的嗜熱芽孢桿菌依然存在增殖的可能性，嗜熱芽孢桿菌的增殖則會對后續(xù)需要進(jìn)行初次消毒的原料乳造成二次污染[3]。巴氏消毒乳在較長時間的貯藏和冷藏運(yùn)輸過程中，都極易受到微生物污染進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)，其中對品質(zhì)影響較大、延長貨架期的微生物主要有嗜冷芽孢桿菌和嗜熱芽孢桿菌[4]。耐熱嗜冷芽孢桿菌孢外存在的耐熱蛋白酶經(jīng)過巴氏消毒工藝處理后，會發(fā)生蛋白酶分子重疊的現(xiàn)象[5]。該酶在低溫貯存過程中逐漸被激活，在后續(xù)的乳制品儲藏過程中，會使乳制品中的蛋白質(zhì)和脂肪分解，最終導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)生變色、異味、凝固、發(fā)黏等變質(zhì)現(xiàn)象，直接影響產(chǎn)品有效期[6]。本試驗(yàn)從品質(zhì)異常奶粉中分離芽孢桿菌，并對其進(jìn)行一系列的鑒定，以期找到污染乳制品的芽孢桿菌。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

品質(zhì)異常奶粉批號20190516，生產(chǎn)日期2019年5月17日，由南疆某乳品企業(yè)提供，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

試驗(yàn)試劑：95%乙醇溶液、結(jié)晶紫溶液、碘液、0.5%的番紅花紅乙醇溶液、1%氫氧化鈉溶液、飽和孔雀綠溶液；DNA提取試劑盒（M10208）、膠回收試劑盒（L41118）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；pMD-19T載體購自TAKARA公司。

試驗(yàn)儀器：恒溫培養(yǎng)箱、高壓鍋、小型臺式高速離心機(jī)、小型高速冷凍離心機(jī)、微波爐、潔凈工作臺、顯微鏡、水浴鍋、搖床等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 品質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌的篩選、分離、純化

取樣：在潔凈工作臺上無菌操作，取3 g奶粉樣分裝到無菌細(xì)菌瓶中，加入10 mL無菌蒸餾水，渦旋混勻樣品。

接種：將混勻的樣品置于80 ℃水浴20 min，取水浴后的樣品1 mL于無菌的EP管中，用無菌蒸餾水倍比稀釋5個梯度，涂布法分別接種于錳鹽營養(yǎng)瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂和嗜冷菌計(jì)數(shù)瓊脂，錳鹽營養(yǎng)瓊脂于55 ℃培養(yǎng)，普通營養(yǎng)瓊脂于37 ℃培養(yǎng)，嗜冷菌計(jì)數(shù)瓊脂于4 ℃培養(yǎng)。倒置培養(yǎng)，錳鹽營養(yǎng)瓊脂和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)24～48 h，嗜冷菌計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)5～7 d后觀察結(jié)果。

純培養(yǎng)：對培養(yǎng)出來的菌落進(jìn)行形態(tài)觀察，選取形態(tài)不同的單菌落，在對應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)和純培養(yǎng)。

細(xì)菌抹片的制備：在干凈的載玻片上加10 μL無菌生理鹽水，接種環(huán)挑取純化的單菌落均勻涂布于生理鹽水中，自然晾干或酒精燈外焰烘干固定。

染色：對細(xì)菌涂片進(jìn)行革蘭染色和芽孢染色。

鏡檢：油鏡下觀察菌體特征和有無芽孢。

選取鏡檢有芽孢的單菌落，接種到裝有10 mL液體培養(yǎng)基的細(xì)菌瓶中搖菌擴(kuò)增，用于DNA提取。

菌種的保存：將分離得到的細(xì)菌在最適溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，將對數(shù)末期時的菌液與經(jīng)過消毒的50 %甘油溶液按1∶1比例混合均勻，凍存于-20 ℃和-70 ℃冰箱，防止菌種丟失。

1.3.2 品質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌DNA的提取

將在液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的細(xì)菌取1 mL加到無菌1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清，重復(fù)1次，收集適量細(xì)菌。細(xì)菌DNA提取方法按照北京全式金生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒（M10208）說明書進(jìn)行操作。提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 品質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌16S rDNA擴(kuò)增

細(xì)菌通用引物序列如下：27F：5'-AGAGTTT GATCCTGG CTCAG-3'和1492R：5'-CGGTT ACCTTGTT ACGACTT-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：DNA模板1 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、EasyTaq SuperMix 12.5 μL、加入ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察是否有目的條帶。

1.3.4 品質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌16S rDNA的克隆和鑒定

1.3.4.1 PCR產(chǎn)物切膠回收

按照北京全式金生物技術(shù)有限公司膠回收試劑盒（L41118）說明書進(jìn)行操作，回收的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 目的基因和pMD-19T載體連接與pMD-19T載體自連

回收的16S rDNA片段0.5 μL、pMD-19T載體3.5 μL、Solution I 6 μL于1.5 mL離心管，ddH2O 0.5 μL、pMD-19T載體3.5 μL、Solution I 6 μL于另一1.5 mL離心管，置于16 ℃連接過夜。

1.3.4.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

將連接物10 μL加入100 μL感受態(tài)DH5α中，冰浴30 min，42 ℃熱沖擊90 s，再置冰浴1 min，加入含Amp+（50 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基800 μL，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，取轉(zhuǎn)化菌100 μL涂布于含有Amp+（50 mg/L）的瓊脂平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 h，長出單菌落，挑取單菌落，于含Amp+（50 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。

1.3.4.4 質(zhì)粒電泳鑒定和質(zhì)粒的PCR鑒定

質(zhì)粒提取按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書進(jìn)行操作，質(zhì)粒DNA溶液于1.5 mL離心管中保存?zhèn)溆谩?/p>

16S rDNA質(zhì)粒DNA10 μL與pMD-19T載體自連質(zhì)粒DNA對照，經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，觀察條帶大小。用提取的16S rDNA質(zhì)粒DNA做PCR模板，用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增后，以pMD-19T載體自連質(zhì)粒DNA做PCR模板為陰性對照，經(jīng)1 %瓊脂糖電泳后，觀察條帶大小。

1.3.5 測序

選取鑒定后的陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA，送測序。

1.3.6 序列分析

測序所得的序列在NCBI上進(jìn)行核苷酸序列比對，鑒定該細(xì)菌的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 品質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌的篩選、分離、純化結(jié)果（見圖1、圖2）

由圖1可知，分離得到外觀扁平、邊緣不整齊、白色，表面粗糙皺褟的單菌落。由圖2可知，分離得到外觀呈白色蠟狀，形態(tài)為邊緣整齊、凸起、表面干燥、有皺褶的單菌落。

2.2 品質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌的染色結(jié)果（見圖3、圖4）

將圖1、圖2中的單菌落制作抹片后，進(jìn)行革蘭染色。

由圖3可知，經(jīng)革蘭染色后，菌體被染成藍(lán)紫色，芽孢不著色。

由圖4可知，經(jīng)孔雀石綠-沙黃染色法進(jìn)行芽孢染色后，菌體被染成紅色，芽孢呈綠色。

2.3 品質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌的16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果（見圖5）

細(xì)菌基因組DNA提取以后，用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增以后，PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)。

由圖5可知，16S rDNA擴(kuò)增成功，大小為1 500 bp左右，與預(yù)期大小一致。

2.4 品質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌16S rDNA質(zhì)粒電泳結(jié)果（見圖6）

品質(zhì)異常全脂滅菌乳中芽孢桿菌的16S rDNA的克隆菌和pMD-19T載體自連的克隆菌放在含Amp+（50 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。

由圖6可知，芽孢桿菌的16S rDNA的質(zhì)粒和pMD-19T載體自連的質(zhì)粒大小不同，與預(yù)期一致。

2.5 質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌16S rDNA質(zhì)粒PCR鑒定的電泳結(jié)果（見圖7）

品質(zhì)異常全脂滅菌乳中芽孢桿菌的16S rDNA的克隆菌放在含Amp+（50 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，以質(zhì)粒DNA為模板，用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。

由圖7可知，以質(zhì)粒為模板，且擴(kuò)增出大小為1 500 bp左右的目的條帶。

2.6 品質(zhì)異常奶粉中芽孢桿菌的16S rDNA的序列分析結(jié)果（見表1）

表1 異常奶粉中芽孢桿菌序列比對結(jié)果Tab.1 Sequence comparison results of Bacillus in abnormal milk powder

由表1可知，測序后的序列經(jīng)NCBI blast在線比對后確定3株短小芽孢桿菌及7株地衣芽孢桿菌。

2.7 地衣芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分類（見圖8、圖9）

由圖8、圖9可知，將其結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸比對，建立進(jìn)化樹后分析表明，該菌株與登錄號 為 KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢桿菌處于同一分支，且根據(jù)同源性分析，該菌株與登錄號為KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢桿菌同源性為100%。根據(jù)上述結(jié)果，可以確定該菌株為地衣芽孢桿菌。

2.8 短小芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分類（見圖10、圖11）

由圖10和圖11可知，將其結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸比對，建立進(jìn)化樹后分析表明，該菌株與登錄號為 FJ641024、MT367713、FJ641028、KU662344、DQ275671、KR780437、KF463141的短小芽孢桿菌處于同一分支，且根據(jù)同源性分析，該菌株與登錄號為FJ641024、MT367713、FJ641028、KU662344、DQ275671、KR780437、KF463141的短小芽孢桿菌同源性為100 %，根據(jù)上述結(jié)果，可以確定該菌株為短小芽孢桿菌。

3 討論

奶粉中芽孢桿菌的研究較多，特別是嬰兒配方奶粉。鄭藝[7]從污染的嬰兒配方奶粉中分離出的微生物為地衣芽孢桿菌。蔡彥希[8]對市面上出售的29批嬰兒配方奶粉進(jìn)行微生物調(diào)查，發(fā)現(xiàn)污染微生物中芽孢桿菌占72%，其中地衣芽孢桿菌占34.5%。Murphy等[9]從奶粉中分離到地衣芽孢桿菌。Hill等[10]從11個不同工廠相同季節(jié)季的244個新西蘭市售乳粉樣本中分離芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)有地芽孢桿菌的污染，且是優(yōu)勢菌株。王林林[11]從成品乳粉中分離細(xì)菌發(fā)現(xiàn)有地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的污染。但在奶粉中研究更多的是能產(chǎn)生毒素的蠟樣芽孢桿菌，蠟樣芽孢桿菌是嗜熱菌，產(chǎn)生的毒素為嘔吐毒素或腹瀉毒素，國內(nèi)外也出現(xiàn)過多例消費(fèi)者使用受蠟樣芽孢桿菌的乳品出現(xiàn)嘔吐或腹瀉的案例，該菌危害較大。趙月明[12]進(jìn)行乳品中蠟樣芽孢桿菌暴露研究，發(fā)現(xiàn)巴氏消毒乳中蠟樣芽孢桿菌的污染最嚴(yán)重，其次是發(fā)酵乳、奶粉和UHT乳。王偉軍等[13]對市售的多種奶粉進(jìn)行芽孢桿菌污染調(diào)查，其中也有蠟樣芽孢桿菌污染的奶粉。乳粉中的芽孢桿菌大多數(shù)是休眠體的芽孢，因?yàn)槿榉郗h(huán)境不適合芽孢桿菌生長繁殖，乳粉里的芽孢能長期存在并保持萌發(fā)的能力，待條件滿足生長的時候，芽孢可能被激活并萌發(fā)生長。Brosius等[14]從90年前的奶粉中分離出來枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的活芽孢。Hill等[10]研究發(fā)現(xiàn)，奶粉廠中嗜熱桿菌產(chǎn)生的芽孢比實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基產(chǎn)生的芽孢更耐熱，污染乳品的大多數(shù)芽孢桿菌都能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶等，其中一些嗜冷菌產(chǎn)生的脂肪酶耐熱性極高，即使菌體被殺滅，但其代謝產(chǎn)物仍能污染奶粉使之腐敗變質(zhì)等。奶粉中芽孢在乳粉被人們用開水或熱水溶解的時候可能被激發(fā)，若沒有及時飲用，擱置一段時間，里面的芽孢桿菌就會快速生長繁殖，可能會引起飲用者食物中毒。短小芽孢桿菌的研究較少，除了加強(qiáng)原料乳中芽孢桿菌的監(jiān)測，還應(yīng)加大對乳品加工車間及加工生產(chǎn)設(shè)備的清洗消毒。

本試驗(yàn)從異常奶粉中分離鑒定出3株短小芽孢桿菌和7株地衣芽孢桿菌。對地衣芽孢桿菌進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果顯示，該菌與登錄號為KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢桿菌處于同一分支，且同源性為100%。根據(jù)上述結(jié)果，可以確定該菌株為地衣芽孢桿菌。對短小芽孢桿菌進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果顯示，該菌株與登錄號為FJ641024、MT367713、FJ641028、KU662344、DQ275671、KR780437、KF463141的短小芽孢桿菌處于同一分支，且同源性為100%。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從品質(zhì)異常奶粉中分離得到7株疑似地衣芽孢桿菌、3株疑似短小芽孢桿菌。通過對10株芽孢桿菌的16S rDNA序列克隆后測序，并將16S rDNA序列進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建和同源性分析，分離得到的7株疑似地衣芽孢桿菌和3株疑似短小芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。