C型尿鈉肽的作用機(jī)制及其對動物生殖調(diào)控的研究進(jìn)展

荊 天，字向東

（西南民族大學(xué)動物科學(xué)國家民委重點(diǎn)試驗(yàn)室，四川 成都 610041）

C型尿鈉肽（C-type natriuretic peptide，CNP）是Sudoh等[1]首次在豬腦中提純的小分子蛋白，從屬于尿鈉肽家族。尿鈉肽家族成員還包括心房尿鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）和樹突尿鈉肽（dendrite natriuretic peptide，DNP），廣泛分布于心臟、下丘腦、垂體、肺和腎等組織，在維持心血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)、血壓和體液調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[2-3]。CNP主要在生殖系統(tǒng)中表達(dá)[4]。研究表明，在小鼠卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）前階段，補(bǔ)充CNP和雌二醇可以使減數(shù)分裂停滯，并且囊胚發(fā)育率高于傳統(tǒng)體外成熟的卵母細(xì)胞；在牛和羊的IVM前階段，補(bǔ)充CNP可以提高囊胚的產(chǎn)量和質(zhì)量[5-6]。CNP通過作用于環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）控制環(huán)磷酸腺苷（cAMP）濃度，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育能力，提高囊胚發(fā)育率[7-9]。文章綜述CNP的作用機(jī)制及其在動物生殖調(diào)控中的研究進(jìn)展，以期深化對CNP作用機(jī)制的認(rèn)識，提高家畜繁殖能力。

1 C型尿鈉肽的結(jié)構(gòu)

CNP由22個(gè)氨基酸組成，與同屬于尿鈉肽家族的ANP、BNP和DNP高度同源，均是由17個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但CNP缺乏羧基末端延伸（見圖1[10]）。編碼CNP的人類基因NPPC位于2號染色體2q24-qter位置，包含3個(gè)外顯子：外顯子1編碼23個(gè)信號肽和CNP原的前7個(gè)氨基酸；外顯子2編碼其余的CNP原序列；外顯子3編碼3’非翻譯區(qū)。CNP前原肽由126個(gè)氨基酸組成，被切割成23和103個(gè)氨基酸，其中23個(gè)氨基酸組成信號肽，103個(gè)氨基酸被進(jìn)一步加工成CNP-53[11]。CNP-53可以以CNP-22前30～31位置的Lys-Lys為信號轉(zhuǎn)化為CNP-22，二者同時(shí)存在。CNP-53通常是主要的內(nèi)源分子組織形式，CNP-22則是主要的成熟形式[3]。Peng等[12]對不同物種的尿鈉肽前原肽序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CNP前原肽物種間同源性顯著高于ANP、BNP和DNP，CNP被認(rèn)為使該家族中最保守的尿鈉肽。

2 C型尿鈉肽受體結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

目前發(fā)現(xiàn)3種結(jié)構(gòu)的尿鈉肽受體，分別為A型尿鈉肽受體（natriuretic peptide receptor A，NPR-A）、B型尿鈉肽受體（natriuretic peptide receptor B，NPR-B）和C型尿鈉肽受體（natriuretic peptide receptor C，NPR-C），三者結(jié)構(gòu)相似，都是由一個(gè)單一的跨膜結(jié)構(gòu)域，將細(xì)胞外配體與細(xì)胞內(nèi)激酶同源結(jié)構(gòu)與催化域分開[11]。尿鈉肽通過NPR-B促進(jìn)cGMP的積累，NPR-C受體不與cGMP產(chǎn)生偶聯(lián)，能夠以高親和力結(jié)合所有4種類型尿鈉肽，反映其作為清除受體的主要功能[13]。Chen等[14]試驗(yàn)表明，NPR-B與CNP的親和力大約是ANP的50倍，NPR-A基本不與CNP結(jié)合，故CNP的主要受體為NPR-B和NPR-C；NPR-B在結(jié)構(gòu)和功能上與可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（SGC）和腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)，將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生cGMP，繼而通過其下游效應(yīng)因子cGMP依賴性蛋白激酶（PKG）、磷酸二酯酶（PDE）和環(huán)核酸門控通道（CNG）參與多個(gè)生理過程的調(diào)節(jié)。在一定濃度范圍內(nèi)，cGMP對cAMP水解酶PDES具有調(diào)節(jié)作用，通過這種機(jī)制PDE可以作為cGMP介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)靶點(diǎn)，即cGMP在細(xì)胞中的一些調(diào)節(jié)作用可能通過影響cAMP途徑而產(chǎn)生[15]。揭示NPR-B具有通過產(chǎn)生cGMP間接抑制cAMP降解的功能。

3 C型尿鈉肽在動物繁殖調(diào)控中的作用

3.1 C型尿鈉肽在雄性動物生殖活動的調(diào)控作用

CNP/NPR-B/cGMP級聯(lián)導(dǎo)致睪丸中各種生物學(xué)效應(yīng)，可能的旁分泌作用包括松弛生精小管，分別調(diào)節(jié)精子運(yùn)輸和睪丸血液供應(yīng)進(jìn)而調(diào)節(jié)睪丸的生精功能[16]。Nielsen等[17]研究表明，CNP主要表達(dá)于男性生殖腺即附睪、精囊腺和前列腺，這些器官的上皮細(xì)胞是精液CNP的主要來源；該研究還表明，人精漿中CNP濃度是血漿中的200多倍。研究表明，支持細(xì)胞是生精上皮中參與CNP/NPR-B/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要細(xì)胞類型，CNP與附睪膜上的受體NPR-B結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的cGMP，并通過CNG通道誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流。Ca2+的升高也提高精子沿著化學(xué)引力梯度的游泳速度，從而增加精子活力[18-20]。將CNP-22注射到大鼠睪丸中，通過監(jiān)測小分子探針在血生精小管屏障上的擴(kuò)散來評估屏障功能，發(fā)現(xiàn)CNP可能通過影響間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)cGMP水平來影響血生精小管屏障完整性，其作為成年大鼠睪丸血生精小管屏障動力學(xué)的調(diào)節(jié)因子進(jìn)而調(diào)節(jié)血生精小管屏障在精子發(fā)生過程中的動態(tài)[21]。

CNP/NPR-B/cGMP級聯(lián)反應(yīng)不僅能調(diào)控睪丸細(xì)胞的自分泌和旁分泌功能，還對陰莖的勃起有重要的調(diào)節(jié)作用。CNP與陰莖海綿體膜的NPR-B受體結(jié)合，作用于顆粒細(xì)胞導(dǎo)致cGMP積累，通過調(diào)節(jié)其下游的PKG和環(huán)核苷酸門控通道調(diào)節(jié)正性肌力從而引起陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞松弛[22]。CNP可引起對鈣激活的K+通道、內(nèi)向整流性K+通道和Na+-K+-ATP阻滯的強(qiáng)烈舒張作用[23]。

3.2 C型尿鈉肽在雌性動物生殖中的調(diào)控作用

3.2.1 C型尿鈉肽在雌性動物卵泡中的表達(dá)

在哺乳動物卵泡中，初級卵母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂，但滯留在第一次減數(shù)分裂中期的雙線期，卵母細(xì)胞在這種休眠狀態(tài)下持續(xù)數(shù)月至數(shù)年以等待卵母細(xì)胞胞質(zhì)的成熟[5]。CNP在卵母細(xì)胞中的表達(dá)量受到卵母細(xì)胞發(fā)育周期的影響。Xi等[24]對卵泡發(fā)育過程中CNP和NPR-B的動態(tài)過程進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在腔前卵泡發(fā)育的早期和晚期，NPPC和NPR-B的轉(zhuǎn)錄顯著增加。進(jìn)一步分離不同大小的小鼠卵泡并進(jìn)行詳細(xì)計(jì)數(shù)表明，CNP處理降低初級卵泡和早期次級卵泡的百分比，同時(shí)使晚期次級卵泡的百分比增加109%；在卵泡發(fā)育過程中檢測到NPPC和NPR-B轉(zhuǎn)錄水平升高，并且在排卵前卵泡中達(dá)到最高水平[25]。Kawamura等[26]發(fā)現(xiàn)，在小鼠排卵前LH刺激引起NPPC轉(zhuǎn)錄迅速下降，在人類卵巢中進(jìn)一步證實(shí)使用排卵劑量的LH后，卵泡液中的CNP表達(dá)水平下降。由此可以推測，CNP的表達(dá)量不斷增加，通過維持高水平的cAMP使卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯在雙線期，在排卵前LH分泌量增加，對CNP的合成產(chǎn)生抑制作用，排卵前LH峰形成時(shí)CNP表達(dá)量達(dá)到最低，從而使減數(shù)分裂恢復(fù)，卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂。CNP在雌性動物卵母細(xì)胞的發(fā)生過程中作為一個(gè)成熟因子調(diào)節(jié)卵泡減數(shù)分裂，在Graafian卵泡中，NPPC基因表達(dá)于腔前卵泡和有腔卵泡的顆粒細(xì)胞，其受體NPR-B的表達(dá)定位于卵丘細(xì)胞， CNP通過激活卵丘細(xì)胞上的NPR-B刺激cGMP的產(chǎn)生，cGMP通過縫隙連接從卵丘細(xì)胞擴(kuò)散至卵母細(xì)胞[24]。NPR-B受體還可以在卵母細(xì)胞膜上表達(dá)，不完全依賴于卵丘與卵母細(xì)胞之間的縫隙連接，定位于卵母細(xì)胞膜上的NPR-B在功能上響應(yīng)CNP，在卵母細(xì)胞中不依賴縫隙連接內(nèi)源性的產(chǎn)生cGMP[27]。卵母細(xì)胞源性生長因子（ODGFs）和雌二醇可以以旁分泌和自分泌的方式調(diào)節(jié)尿鈉肽受體的表達(dá)，17-b雌二醇增加卵丘細(xì)胞對NPPC的敏感性并增加卵丘細(xì)胞中NPR-B的表達(dá)，與NPR-B促進(jìn)cGMP的產(chǎn)生具有協(xié)同作用[28]。

3.2.2 C型尿鈉肽在雌性動物生殖中的調(diào)控

CNP水平受多種因素的調(diào)控。LH/hCG刺激可抑制顆粒細(xì)胞中NPPC的表達(dá)，LH下調(diào)小鼠顆粒細(xì)胞CNP轉(zhuǎn)錄和卵泡液中的CNP蛋白的表達(dá)[26]。在人類中，LH誘導(dǎo)NPR-B鳥苷酸環(huán)化酶活性在20 min內(nèi)下降[29]。這是因?yàn)榫幋aNPPC的mRNA與LH受體在同一細(xì)胞中表達(dá)，LH受體會激活G蛋白和磷脂酶Cβ從而提高顆粒細(xì)胞中的Ca2+，而Ca2+升高和蛋白激酶C的激活都可以導(dǎo)致NPR-B的去磷酸化和失活，所以在同一細(xì)胞內(nèi)暴露于LH可能標(biāo)志著CNP數(shù)量的減少[30]。但卵丘細(xì)胞中表達(dá)的NPR-B受體不太可能受刺激排卵的LH的直接調(diào)節(jié)，因?yàn)槁涯讣?xì)胞源性旁分泌因子維持著卵丘細(xì)胞中NPR-B受體的表達(dá)，而LH在卵丘細(xì)胞和壁細(xì)胞上皮都缺乏受體從而必須涉及細(xì)胞間信號傳遞[25]。LH信號通路可以通過表皮生長因子（EGF）網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行表達(dá)，LH會激活壁層顆粒細(xì)胞中的G蛋白偶聯(lián)受體使卵母細(xì)胞中的cAMP增加形成cAMP峰，以負(fù)反饋調(diào)節(jié)形式抑制NPPC及NPR-B的表達(dá)從而激活EGF網(wǎng)絡(luò)[31]。EGF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，EGF樣因子（Areg）、表皮調(diào)節(jié)素（Ereg）和β細(xì)胞蛋白（BTC）作用于EGF受體，激活胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1和2、蛋白激酶C信號通路和顆粒細(xì)胞及卵丘細(xì)胞中的其他信號通路，以關(guān)閉縫隙連接的形式響應(yīng)壁層顆粒細(xì)胞中LH的激增，從而下調(diào)NPR-B的表達(dá)[32]。促卵泡激素（FSH）也會影響CNP的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。目前對于FSH與CNP之間作用機(jī)制的研究尚不十分明確。有研究提出，F(xiàn)SH通過腔前卵泡刺激CNP的產(chǎn)生并且CNP反映FSH對腔前卵泡和小卵泡的生長刺激作用[11]。在腔前卵泡培養(yǎng)過程中，使用低劑量的FSH可以提高卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞間的耦合效率，F(xiàn)SH誘導(dǎo)cAMP的產(chǎn)生并從周圍的卵丘細(xì)胞流入。FSH和CNP具有一定程度的協(xié)同作用[24]。有研究表明，在體外，F(xiàn)SH刺激山羊顆粒細(xì)胞可以誘導(dǎo)NPR-C表達(dá)量的增加，并呈時(shí)間和劑量依賴性增長，NPR-C作為CNP的清除性受體可以降低CNP在卵母細(xì)胞中的濃度[33]?？梢酝茢?，在腔前卵泡階段主要由CNP促進(jìn)卵泡的發(fā)育和增長，F(xiàn)SH對CNP的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，當(dāng)卵泡發(fā)育到促性腺激素依賴期體內(nèi)FSH分泌量增加，促進(jìn)NPR-C清除性受體的表達(dá)從而降低CNP含量。已有研究表明，F(xiàn)SH在卵泡期控制卵母細(xì)胞生長及卵泡發(fā)育并誘導(dǎo)壁層顆粒細(xì)胞表達(dá)EGF受體，F(xiàn)SH信號與卵泡內(nèi)EGF網(wǎng)絡(luò)相交誘導(dǎo)EGF配體的積累引起級聯(lián)反應(yīng)關(guān)閉縫隙連接，減少NPR-B受體進(jìn)入卵母細(xì)胞從而抑制CNP發(fā)揮作用[34]。推測低劑量的FSH促進(jìn)CNP的產(chǎn)生，而高劑量的FSH在卵泡促性腺激素依賴期則通過影響EGF通路及NPR-C表達(dá)抑制CNP發(fā)揮作用。Michael等[35]使用多重RT-qPCR技術(shù)對原代小鼠內(nèi)分泌組織以及廣泛使用αT3-1和LβT2促性腺激素來源的細(xì)胞中尿鈉肽相關(guān)基因的表達(dá)譜進(jìn)行研究，CNP的靶細(xì)胞促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌和CNP在促性腺激素細(xì)胞系中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相互拮抗，而且GnRH可以以鈣和蛋白激酶C依賴的方式刺激近端的小鼠NPPC啟動子，NPPC對脈動性GnRH的強(qiáng)烈反應(yīng)證明GnRH是促性腺激素來源細(xì)胞中尿鈉肽的調(diào)節(jié)器。

3.2.3 CNP在卵母細(xì)胞體外成熟中的應(yīng)用

體外成熟培養(yǎng)（IVM）是將未成熟的生發(fā)泡（GV）階段的卵母細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)成熟的技術(shù)[36]。CAPA-IVM是一個(gè)完整的雙相IVM系統(tǒng)，該系統(tǒng)最初是為小鼠的零刺激IVM開發(fā)，由一個(gè)卵母細(xì)胞獲得即將發(fā)育能力的早熟階段，和一個(gè)促進(jìn)配體依賴的由卵丘細(xì)胞驅(qū)動的減數(shù)分裂成熟的IVM階段組成[5]。第一階段為IVM前階段，阻滯自然減數(shù)分裂恢復(fù)，延長卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞（CC）縫隙連接通訊（GJC），促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的獲得；第二階段為IVM階段，誘導(dǎo)減數(shù)分裂的恢復(fù)和卵母細(xì)胞的成熟[29]。與傳統(tǒng)IVM相比，CAPA-IVM體外成熟前系統(tǒng)中卵母細(xì)胞的“獲能”即促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育的能力至關(guān)重要，用CNP抑制減數(shù)分裂恢復(fù)被證明有較好的結(jié)果，因?yàn)槠渥鳛闇p數(shù)分裂停滯的自然決定因素既沒有其他化學(xué)物質(zhì)半衰期長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)的缺點(diǎn)，又保持了縫隙連接活性，并支持對卵母細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要的關(guān)鍵基因的表達(dá)[37]。已知CNP介導(dǎo)的體外成熟前培養(yǎng)系統(tǒng)關(guān)鍵作用機(jī)制為：防止或延緩體外自發(fā)的減數(shù)分裂恢復(fù)；保存卵丘卵母細(xì)胞縫隙連接通訊；支持卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞的持續(xù)生長，調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞內(nèi)的糖酵解和氧化代謝；提高卵母細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽活性使卵母細(xì)胞不過多暴露于活性氧中，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育；促進(jìn)卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂恢復(fù)前卵母細(xì)胞的有序停止,與獲得減數(shù)分裂和發(fā)育能力相關(guān)的染色質(zhì)從分散結(jié)構(gòu)變?yōu)闈饪s結(jié)構(gòu)；減少不同大小閉鎖狀態(tài)的卵泡間的減數(shù)分裂異步性；在體外成熟前培養(yǎng)過程中，在卵丘細(xì)胞中發(fā)展具有功能的表皮生長因子信號網(wǎng)絡(luò)[38]。Santiquet等[39]對小鼠卵丘細(xì)胞未擴(kuò)張的COC進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，體外成熟前系統(tǒng)導(dǎo)致的減數(shù)分裂停滯的2 h會顯著增加卵母細(xì)胞中三磷酸腺苷（ATP）的產(chǎn)量，并顯著影響線粒體膜電位的變化和卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展，這些都是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量及IVF后囊胚率的重要因素。

4 結(jié)論

CNP與動物生殖系統(tǒng)功能關(guān)系密切，其具體作用機(jī)制是通過產(chǎn)生cGMP間接影響生殖細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量，從而影響生殖活動。CNP主要通過旁分泌的方式影響雄性動物的生精作用及精子活力。CNP在雌性動物中的表達(dá)，隨發(fā)情周期的變化而變化，受多種內(nèi)分泌激素及通路的影響。在許多雙向體外成熟系統(tǒng)的研究中，添加CNP作為卵母細(xì)胞減數(shù)分裂抑制劑的前培養(yǎng)系統(tǒng)顯著提高卵母細(xì)胞成熟率及體外受精后的囊胚率。目前針對CNP對體外受精和妊娠結(jié)局的影響尚停留在初級階段，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。